血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定

1、【實驗原理實驗原理】 ALT催化丙氨酸與-酮戊二酸之間的氨基轉(zhuǎn)移,生 成丙酮酸和谷氨酸,在37, pH7.4,經(jīng)30min反應之后， 加入2,4-二硝基苯肼終止反應,并與反應中的二種-酮 酸生成2,4-二硝基苯腙,在堿性條件下顯紅棕色,于波 長505nm處讀取A值。 兩種苯腙的吸收光譜曲線在500520nm處差異最 大,丙酮酸苯腙的呈色強度是-酮戊二酸苯腙的3倍,據(jù) 此可以計算出丙酮酸的生成量,后者與血清中的ALT的 活性濃度成正比。 【實驗原理實驗原理】 n丙氨酸丙氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸+谷氨酸谷氨酸 ALT 2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼 -酮戊二酸酮戊二酸-2,4-二硝基苯

2、腙二硝基苯腙丙酮酸丙酮酸-2,4-二硝基苯腙二硝基苯腙 0. 4mol/LNaOH 紅棕色紅棕色紅棕色紅棕色（三倍）（三倍） 卡門單位卡門單位:1ml血清血清在在25,340nm,體積為體積為3ml,光徑為光徑為1cm每分鐘每分鐘光光 密度密度下降下降0.001的酶量。的酶量。 1 1、主要器具、主要器具 微量移液器微量移液器 【實驗儀器實驗儀器】 可見分光光度計可見分光光度計 【實驗試劑實驗試劑】 n10.1mol/L磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（pH7.4） n2基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液 精確稱取D-L-丙氨酸1.79g,-酮戊二酸29.2mg, 先溶于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液約50ml中,

3、用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4,再加磷酸鹽緩沖液至100ml,每升 底物緩沖液中可加氯仿防腐,4保存。 n31.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 n40.4mol/L NaOH溶液溶液 n52.0mmol/L丙酮酸標準液丙酮酸標準液 n6待測標本待測標本: 病人血清或質(zhì)控血清。病人血清或質(zhì)控血清。 【操作步驟操作步驟】 n（1）待測血清的測定 加入物加入物(ml)對照管對照管測定管測定管 血清血清0.10.1 基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5 混勻，混勻，37水浴水浴30min 2，4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.5 0.5 基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5 混勻，混勻，3

4、7保溫保溫20min 0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.0 混勻，室溫放置混勻，室溫放置5min，在波長為，在波長為505nm處比色，處比色，蒸餾水調(diào)蒸餾水調(diào)“0” 【操作步驟操作步驟】 n（2）校正曲線的制備 加入物加入物(ml)01234 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.1 2.0mmol/L丙酮酸標準液丙酮酸標準液00.050.100.150.20 基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.500.450.400.350.30 1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.5 混勻，混勻，37保溫保溫20min 0.4mo

5、l/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.05.0 卡門單位卡門單位0285797150 混勻，室溫放置混勻，室溫放置5min，在波長為，在波長為505nm處比色，處比色，蒸餾水調(diào)蒸餾水調(diào)“0” 取取7支試管，按下表操作支試管，按下表操作 卡門單位卡門單位0285797150 加入物加入物(ml)對照管對照管測定管測定管01234 血清血清0.10.1 基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5 混勻，混勻，37水浴水浴30min 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.1 2.0mmol/L丙酮酸標準液丙酮酸標準液00.050.100.150.20 基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5

6、00.450.400.350.30 1.0mmol/L 2，4-二硝基苯二硝基苯 肼溶液肼溶液 0.50.50.50.50.50.50.5 基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.5 混勻，混勻，37保溫保溫20min 0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.05.05.05.0 混勻，室溫放置混勻，室溫放置5min，在波長為，在波長為505nm處比色，處比色，蒸餾水調(diào)蒸餾水調(diào)“0” 【實驗結果實驗結果】 1.校正曲線的制備 以標準管各管的A值-“0”號管的A值,所得差 值與對應酶卡門氏單位作圖,即成校正曲線。 2.測定管 測定管A值-對照管A值,根據(jù)所得差值，從校正 曲線查得標本中ALT的卡

7、門氏單位。 參考值范圍：參考值范圍：5-255-25卡門單位卡門單位 【注意事項注意事項】 n1.血清和底物應于37水浴后操作,最好置37水浴 箱中操作。以一定時間加入，各管即時混勻,以第一管 開始計時,準確反應30分鐘,各管加入時間間隔一致,保 證每管反應時間均為30分鐘。 n2.加入2,4-二硝基苯肼溶液后,應充分混勻,使反應完全。 n3.加入NaOH溶液的方法和速度要一致,如液體混合不 完全或加入速度不同均會導致吸光度的差異。 n4.底物和顯色劑均為呈色物質(zhì),稱量必須很準確。 n5.呈色的深淺與NaOH的濃度也有關系,其濃度越大呈 色越深,但其濃度0.25M時,吸光度下降變陡,因此濃度

8、要準確。 【方法學評價【方法學評價 】 n1.重復性差重復性差 n1) 由于限制了-酮戊二酸的用量。使生成量與 酶活性不能呈現(xiàn)良好的線性關系。 n2) 2,4-二硝基苯肼在堿性條件下也能顯色,為了 降低試劑空白的吸光度而不得不使用低濃度的 2,4-二硝基苯肼,此種水平的苯肼僅能與反應體系 中的兩種酮酸的一半反應。 n3) 產(chǎn)物旁路效應：丙酮酸在LDH的催化作用下的 消耗。 【方法學評價【方法學評價 】 2.準確性差準確性差：線性范圍狹窄,盡管標本采用稀釋 后測定,但偏差仍較大。 3.試劑穩(wěn)定性差試劑穩(wěn)定性差 4.操作簡單操作簡單 【臨床意義】【臨床意義】 n 肝細胞中含ALT最豐富，因此當肝臟

9、疾 病致肝細胞受損傷時，ALT即大量釋放入血 液，致使血清中ALT活性增高。測定測定ALTALT是是 檢查肝功能的重要指標之一檢查肝功能的重要指標之一。 n1.ALT顯著增高見于各種急性肝炎及藥物中 毒性肝細胞壞死。 n2.中等程度增高見于肝癌、肝硬化、慢性 肝炎及心肌梗塞。 n3.輕度增高則見于阻塞性黃疸及膽道炎等 疾病。骨骼肌損傷、多發(fā)性肌炎亦可引起 轉(zhuǎn)氨酶活性升高。 【操作步驟操作步驟】 n（2）校正曲線的制備 加入物加入物(ml)01234 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.1 2.0mmol/L丙酮酸標準液丙酮酸標準液00.050.100.150.2

10、0 基質(zhì)緩沖液基質(zhì)緩沖液0.500.450.400.350.30 1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.5 混勻，混勻，37保溫保溫20min 0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.05.0 卡門單位卡門單位0285797150 混勻，室溫放置混勻，室溫放置5min，在波長為，在波長為505nm處比色，處比色，蒸餾水調(diào)蒸餾水調(diào)“0” 【實驗結果實驗結果】 1.校正曲線的制備 以標準管各管的A值-“0”號管的A值,所得差 值與對應酶卡門氏單位作圖,即成校正曲線。 2.測定管 測定管A值-對照管A值,根據(jù)所得差值，從校正 曲線查得標本中ALT的卡門氏單位。 參考值范圍：參考值范圍：5-255-25卡門單位卡門單位 【注意事項注意事項】 n1.血清和底物應于37水浴后操作,最好置37水浴 箱中操作。以一定時間加入，各管即時混勻,以第一管 開始計時,準確反應30分鐘,各管加入時間間隔一致,保 證每管反應時間均為30分鐘。 n