分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(生技生科)下游-2017

1、分分 子子 生生 物物 學(xué)學(xué) 實(shí)實(shí) 驗(yàn)下驗(yàn)下 專業(yè)：生物科學(xué)專業(yè)：生物科學(xué) 生物技術(shù)生物技術(shù) 實(shí)驗(yàn)流程一實(shí)驗(yàn)流程一 實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)安排 準(zhǔn)備材料：重組工程菌目標(biāo)蛋白的表達(dá)準(zhǔn)備材料：重組工程菌目標(biāo)蛋白的表達(dá) 第第1次次 菌體超聲破壁、離心、包涵體復(fù)性、裝菌體超聲破壁、離心、包涵體復(fù)性、裝 離子交換柱離子交換柱 第第2次次 測酶活、定蛋白、測酶活、定蛋白、 離子交換層析離子交換層析 第第3次次 親和柱層析，并對收集樣親和柱層析，并對收集樣 品進(jìn)行測活、定蛋白等品進(jìn)行測活、定蛋白等 第第4次次 對分離純化各樣品進(jìn)行蛋白電泳分析對分離純化各樣品進(jìn)行蛋白電泳分析 第第5次次 Western blottin

2、g， 繪出分離純化表繪出分離純化表 繪制包涵體復(fù)性曲線繪制包涵體復(fù)性曲線 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 第第1次：次： 菌體超聲破壁、離心、包涵體復(fù)性、裝離子交換柱菌體超聲破壁、離心、包涵體復(fù)性、裝離子交換柱 實(shí)驗(yàn)順序：實(shí)驗(yàn)順序：超聲破壁超聲破壁-離心（洗滌，注意平衡）離心（洗滌，注意平衡）-裝柱裝柱 -平衡平衡-包涵體溶解（包涵體溶解（2hr） -復(fù)性復(fù)性-測活測活 涉及單元實(shí)驗(yàn)：涉及單元實(shí)驗(yàn)：破壁破壁、離心離心、裝柱裝柱、復(fù)性、酶活測定復(fù)性、酶活測定 掌握要點(diǎn)：破壁原理掌握要點(diǎn)：破壁原理 裝離子交換柱方法裝離子交換柱方法 包涵體復(fù)性原理及方法包涵體復(fù)性原理及方法 脂肪酶測活原理脂肪酶測活原理 O- O

3、- O- O P NO2 Na+ Na+ 對硝基苯酚磷酸酯對硝基苯酚磷酸酯 p-NPP 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 對硝基苯酚對硝基苯酚 p-NP NO2 OH 酯酶測活原理酯酶測活原理 以對硝基酚磷酸二鈉為底物，根據(jù)水解磷酯鍵所產(chǎn)生的對以對硝基酚磷酸二鈉為底物，根據(jù)水解磷酯鍵所產(chǎn)生的對 硝基酚量測定酶活力。在硝基酚量測定酶活力。在3737、pH10.0pH10.0條件下，每分鐘轉(zhuǎn)條件下，每分鐘轉(zhuǎn) 化產(chǎn)生化產(chǎn)生1mol/L1mol/L對硝基酚的酶量為對硝基酚的酶量為1 1個酶單位個酶單位 每每10秒記一個數(shù)（秒記一個數(shù)（0、10、20、120） 將時間及其對應(yīng)的將時間及其對應(yīng)的A405導(dǎo)入導(dǎo)入EXC

4、EL文檔中，文檔中， 做時間做時間tA405曲線，得到斜率，曲線，得到斜率， 用公式：用公式：酶活酶活=（OD405-自分解）自分解）*18231.26*稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) （此處為（此處為1000）（）（u/ml） （注：注：OD405為曲線斜率、為曲線斜率、自分解為如果底物未分解（無黃色），視為自分解為如果底物未分解（無黃色），視為0， 否則需要將底物以否則需要將底物以KPB為對照進(jìn)行標(biāo)定為對照進(jìn)行標(biāo)定） 定量測活與定性測活定量測活與定性測活 （2分鐘測一個點(diǎn)）分鐘測一個點(diǎn)） 對每個收集管進(jìn)行對每個收集管進(jìn)行A280A280與酶活力定性測定與酶活力定性測定 酶標(biāo)定性測活酶標(biāo)定性測活 每組一條

5、酶標(biāo)版（每組一條酶標(biāo)版（8孔孔 單位單位 uL） 孔號12345678 破碎 上清 原液 原液 稀釋 10倍 原液 稀釋 100倍 原液 稀釋 1000 倍 原液 稀釋 10000 倍 包涵 體復(fù) 興液 空白 對照 無 KPB （磷 酸緩 沖液） 174174174174174174194 酶液2020202020200 底物6666666 底物留待即將酶標(biāo)測定時加底物留待即將酶標(biāo)測定時加 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1次序安排次序安排 1 1 超聲離心保留上清超聲離心保留上清 沉淀沉淀洗滌離心洗滌離心 - - 保留沉淀保留沉淀 2 2 包涵體溶解包涵體溶解復(fù)性復(fù)性-放置冰箱，每次實(shí)驗(yàn)測活放置冰箱，每次實(shí)驗(yàn)測活

6、3 3 洗柱、裝柱洗柱、裝柱 ：水：水 1 1：1 1介質(zhì)介質(zhì) 平衡平衡50-100 ml50-100 ml 4 4 洗試管，自然倒扣晾干（紙巾墊）洗試管，自然倒扣晾干（紙巾墊） 5 5 注意留樣注意留樣! !（上清（上清0.5ml -200.5ml -20度保存）度保存） 注意標(biāo)清組號！注意標(biāo)清組號！ 6 登記測活數(shù)據(jù)（老師本子）登記測活數(shù)據(jù)（老師本子） 8 8 值日：值日： A A室、室、B B室室 （2 2組組/ /次）次） 公用臺物品不得挪用公用臺物品不得挪用 桌面整齊桌面整齊 出席率出席率- -平時分！平時分！ 冰箱分配冰箱分配 測活次序測活次序 上午定性測活！上午定性測活！ 實(shí)驗(yàn)二

7、內(nèi)容實(shí)驗(yàn)二內(nèi)容 對上一次制備的上清液（8ml8ml）/2/2 進(jìn)行離子交 換層析 樣品活性分析及蛋白濃度測定蛋白濃度測定 繪制純化表 純度分析 (蛋白電泳) 蛋白質(zhì)分離純化方法蛋白質(zhì)分離純化方法 離子交換離子交換 凝膠過濾凝膠過濾 親和層析親和層析 疏水層析疏水層析 凝膠過濾的工作原理凝膠過濾的工作原理 離子交換層析離子交換層析 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 可解離基團(tuán)：可解離基團(tuán)： - -氨基，氨基， - -羧基，側(cè)鏈羧基，側(cè)鏈R R 基團(tuán)基團(tuán) 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：在某一蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：在某一pHpH值，蛋白所帶值，蛋白所帶 正負(fù)電荷相等，即凈電荷為零時溶液的正負(fù)電荷相等，即凈電荷為零時溶液

8、的 pHpH稱為該蛋白等電點(diǎn)稱為該蛋白等電點(diǎn) 離子交換層析離子交換層析 柱層析程序： 裝柱、平衡、上樣、洗滌、洗脫、合并樣品 種類：種類： O OCH2CH2CH2CH2N+N+(CH2CH3)3(CH2CH3)3 二乙基氨基乙基纖維素（二乙基氨基乙基纖維素（DEAEDEAE） 葡聚糖葡聚糖 瓊脂糖瓊脂糖 纖維素纖維素 離子交換層析的洗脫過程示意離子交換層析的洗脫過程示意 離子強(qiáng)度梯度：通過不斷增加離子強(qiáng)度，吸附到 交換劑上的物質(zhì)根據(jù)其靜電引力的大小而不斷競 爭性的解脫 pH梯度：當(dāng)pH梯度接近各樣品離子的等電點(diǎn)時， 該物質(zhì)就被解脫 連續(xù)的（稱梯度洗脫），不連續(xù)的（稱階段洗脫） 待分離物質(zhì)洗脫

9、時常用的兩種方法待分離物質(zhì)洗脫時常用的兩種方法 實(shí)驗(yàn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)設(shè)計 離子交換原理離子交換原理 離子交換層析根據(jù)化合物的凈電荷進(jìn)行離子交換層析根據(jù)化合物的凈電荷進(jìn)行 分離分離 ？應(yīng)該選用哪種層析介質(zhì)？應(yīng)該選用哪種層析介質(zhì) ？pHpH如何選擇如何選擇 吸附條件及最佳吸附條件吸附條件及最佳吸附條件 ? ? 平衡判斷的標(biāo)準(zhǔn)平衡判斷的標(biāo)準(zhǔn) 操作手冊？操作手冊？ 實(shí)驗(yàn)二內(nèi)容實(shí)驗(yàn)二內(nèi)容 對上一次制備的上清液（8ml8ml）/2/2 進(jìn)行離子交 換層析 樣品活性分析及蛋白濃度測定蛋白濃度測定 繪制純化表 純度分析 (蛋白電泳) 層析操作一般過程 裝柱、平衡、上樣、洗滌、洗脫、合并樣品裝柱、平衡、上樣、洗滌、洗脫

10、、合并樣品 上樣前后樣品活性樣品活性測定-當(dāng)天測定 上樣前后蛋白濃度蛋白濃度測定-最后一天測定 上樣前后樣品體積樣品體積測定-當(dāng)天測定 步驟步驟總體積總體積 （ml） 蛋白濃度蛋白濃度 （mg/ml） 蛋白總量蛋白總量 （mg） 酶濃度酶濃度 （U/ml） 比活力比活力 （U/mg蛋白）蛋白） 總活力總活力 （U） 產(chǎn)率產(chǎn)率 （）（） 提純提純 倍數(shù)倍數(shù) 粗無細(xì)胞抽提液粗無細(xì)胞抽提液1000121200050.41650001001.00 50 C熱變性除雜蛋白熱變性除雜蛋白1000880004.80.604800961.44 硫酸銨分級硫酸銨分級30-50飽和度飽和度 沉淀部分沉淀部分 25

11、0375011.03.672730558.83 DEAE-凝膠層析，凝膠層析，pH梯度第梯度第 50-60管（管（5ml/管）經(jīng)透析、管）經(jīng)透析、 濃縮濃縮 259225889.822004423.6 DEAE-纖維素纖維素KCl梯度，第梯度，第 21-31管（管（2ml/管）經(jīng)透析、管）經(jīng)透析、 濃縮濃縮 573536452182036.4125 凝膠過濾葡聚糖凝膠凝膠過濾葡聚糖凝膠G-100 第第31-40管（管（1ml/管）合并管）合并 100.929.2170185170034444 羥基磷灰石層析，磷酸鹽梯羥基磷灰石層析，磷酸鹽梯 度，第度，第15-18管（管（1ml/管）合管）合

12、并并 40.7533755001500301200 蛋白純化過程分析 純化過程評價指標(biāo) 純度檢測方法 柱效的初步判斷： OD280曲線和OD405曲線的重疊與純化效果 A瓶 0 N NaCl 100ml B瓶 1 N NaCl 100ml 1)1)在梯度洗脫儀中的洗脫瓶在梯度洗脫儀中的洗脫瓶A A（混合器）和洗脫瓶（混合器）和洗脫瓶B B（貯存器）（貯存器） 內(nèi)各裝入內(nèi)各裝入100100毫升緩沖液毫升緩沖液和緩沖液和緩沖液（注意加溶液的方法），（注意加溶液的方法）， 注意液面應(yīng)處于同一水平面，同時應(yīng)排除連接管內(nèi)的氣泡注意液面應(yīng)處于同一水平面，同時應(yīng)排除連接管內(nèi)的氣泡 2) 2) 開動梯度洗脫儀

13、中的電磁攪拌器開關(guān)，調(diào)節(jié)攪拌速度，以開動梯度洗脫儀中的電磁攪拌器開關(guān)，調(diào)節(jié)攪拌速度，以 混合器內(nèi)緩沖液旋轉(zhuǎn)而無明顯旋渦為宜混合器內(nèi)緩沖液旋轉(zhuǎn)而無明顯旋渦為宜 3) 3) 將洗脫瓶將洗脫瓶A A、洗脫瓶、洗脫瓶B B與層析柱上端連接管道打開，同時將與層析柱上端連接管道打開，同時將 層析柱下端接收樣品層析柱下端接收樣品 4)4)控制洗脫流速，收集洗脫流出液約控制洗脫流速，收集洗脫流出液約2020管（管（3 3毫升毫升/ /管），管）， 編號！編號！ 操作要點(diǎn)操作要點(diǎn) 同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線：同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線： 較快的流速下得到的冼脫峰也寬較快的流速下得到的冼脫峰也寬 流速

14、低洗脫峰窄而高流速低洗脫峰窄而高-分辨率較高，樣品分辨率較高，樣品 稀釋較少稀釋較少 流速對洗脫曲線的影響流速對洗脫曲線的影響 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)2次序安排次序安排 1 1 上樣（稀釋一倍左右）速度要慢！洗滌（上樣（稀釋一倍左右）速度要慢！洗滌（202030ml30ml左右）左右） 安裝梯度洗脫裝置安裝梯度洗脫裝置 200mlbuffer200mlbuffer于左側(cè)瓶，平衡后關(guān)閉通道，左側(cè)加于左側(cè)瓶，平衡后關(guān)閉通道，左側(cè)加6gNaCl6gNaCl，然然 后進(jìn)行梯度洗脫，（注意流速！后進(jìn)行梯度洗脫，（注意流速！1d/51d/5秒秒 5 5分分/ /管），管），試管編號！試管編號！ 定性定性測活及測活及OD

15、OD280 280，注意： ，注意：酶活最高管留樣酶活最高管留樣100ul100ul！將有酶活試將有酶活試 管合并，精確測活管合并，精確測活 酶液上清合并液酶液上清合并液留樣留樣0.5ml(0.5ml(上清液上清液) )用于分析，其余量好體積用于分析，其余量好體積 登記數(shù)據(jù)（上樣前后精確測酶活性，體積）登記數(shù)據(jù)（上樣前后精確測酶活性，體積） 定性測活和定量測活定性測活和定量測活 定性測蛋白和定量測蛋白定性測蛋白和定量測蛋白 ！ 留樣？ 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 第第2 次：次： 測酶活、測酶活、定蛋白、定蛋白、 離子交換層析分析離子交換層析分析 實(shí)驗(yàn)順序：離心實(shí)驗(yàn)順序：離心/ /留樣留樣/ /量體積！

16、量體積！-上柱上柱-定蛋白定蛋白-紫外吸收紫外吸收 測蛋白峰、測蛋白峰、 酶活曲線測定酶活曲線測定-收集樣品收集樣品/ /留樣留樣/量體積！量體積！ 涉及單元實(shí)驗(yàn)：測酶活、定蛋白、離子交換層析涉及單元實(shí)驗(yàn)：測酶活、定蛋白、離子交換層析 掌握要點(diǎn)：紫外吸收法繪蛋白濃度曲線方法掌握要點(diǎn)：紫外吸收法繪蛋白濃度曲線方法 離子交換層析原理及方法離子交換層析原理及方法 BSBS100100自動部分收集器安裝圈自動部分收集器安裝圈 1反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定 螓絲；8報警板；9.試管；10收集盤；11.時間選揮旋鈕；12.時間選擇固定 螺釘；13自動開關(guān)；14、

17、指示燈；15.電源開關(guān)；16換向開關(guān)（逆、 順）；17手動開關(guān) 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 第第3次：次：粗酶樣品制備，粗酶樣品制備，親和層析，并對收集樣品進(jìn)行分析親和層析，并對收集樣品進(jìn)行分析 實(shí)驗(yàn)順序：實(shí)驗(yàn)順序：親和層析親和層析 -紫外吸收測蛋白峰紫外吸收測蛋白峰 -酶活曲線測定酶活曲線測定(3(3管管)-)-考馬斯亮藍(lán)法定蛋白考馬斯亮藍(lán)法定蛋白 涉及單元實(shí)驗(yàn)：涉及單元實(shí)驗(yàn)：破壁破壁、離心離心、裝柱裝柱、層析層析、分析、留樣、分析、留樣 掌握要點(diǎn)：掌握要點(diǎn)：親和層析親和層析原理和操作原理和操作 親和層析親和層析 合并液量體積、精確測活、合并液量體積、精確測活、定蛋白定蛋白 計算比活、純化倍數(shù)、計算比

18、活、純化倍數(shù)、回收率（登記數(shù)據(jù)）回收率（登記數(shù)據(jù)） 鎳柱純化實(shí)驗(yàn)流程鎳柱純化實(shí)驗(yàn)流程 一一上清液測活上清液測活 二二NiNi柱純化步驟：柱純化步驟： 裝柱裝柱: :清洗玻璃柱，連接好橡皮管，將層析柱安裝到鐵架清洗玻璃柱，連接好橡皮管，將層析柱安裝到鐵架 臺上向柱內(nèi)加入臺上向柱內(nèi)加入1-2ml 1-2ml 蒸餾水，再加蒸餾水，再加1-2ml 1-2ml 鎳柱介質(zhì)鎳柱介質(zhì) （助教完成）（助教完成） 平衡平衡: :先用水先用水15-20ml15-20ml洗介質(zhì)洗介質(zhì), ,再用再用5-10ml5-10ml 平衡液（實(shí)驗(yàn)平衡液（實(shí)驗(yàn) 臺上臺上20mM Tris 20mM Tris pH8.0pH8.0）

19、平衡柱子）平衡柱子( (流速慢流速慢!)!)。平衡液。平衡液 沿柱內(nèi)壁緩慢加入沿柱內(nèi)壁緩慢加入 上樣上樣: :取取3ml3ml上清液上樣，上樣過程中的穿出夜收集起來，上清液上樣，上樣過程中的穿出夜收集起來， 再重新上樣，如此再重新上樣，如此循環(huán)循環(huán)3 3次?。鞔┮簻y活）次?。鞔┮簻y活） 洗滌洗滌: :上樣完成之后，用上樣完成之后，用3-5ml3-5ml洗滌液（實(shí)驗(yàn)臺上洗滌液（實(shí)驗(yàn)臺上10mM 10mM Tris pH8Tris pH8，50mM 50mM 咪唑）洗去沒有結(jié)合的蛋白咪唑）洗去沒有結(jié)合的蛋白（洗滌液（洗滌液 測活）測活） 洗脫洗脫: :用用3ml3ml洗脫液（實(shí)驗(yàn)臺上洗脫液（實(shí)

20、驗(yàn)臺上10mM Tris pH810mM Tris pH8，300mM 300mM 咪咪 唑）洗脫目標(biāo)蛋白。唑）洗脫目標(biāo)蛋白。1ml/1ml/管管，收集收集3-53-5管管。各管洗脫液各管洗脫液 測活。測活。 三三復(fù)性液測活復(fù)性液測活 各樣品測活、測蛋白稀釋倍數(shù)及加樣量參考表各樣品測活、測蛋白稀釋倍數(shù)及加樣量參考表 待測液測酶活待測液測酶活 DEAEDEAE離子交換離子交換: :上清液上樣稀釋上清液上樣稀釋500-1000500-1000倍倍 復(fù)性液復(fù)性液: :直接測活直接測活 DEAEDEAE洗脫合并液洗脫合并液: : Ni-NTANi-NTA上清液上清液: :稀釋稀釋250-500250-

21、500倍測活倍測活 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 第第4-5次：次：對分離純化各樣品進(jìn)行蛋白電泳分析對分離純化各樣品進(jìn)行蛋白電泳分析/ /Western bloting ， 繪出分離純化表繪出分離純化表 實(shí)驗(yàn)順序：實(shí)驗(yàn)順序：蛋白電泳，同時進(jìn)行數(shù)據(jù)分析蛋白電泳，同時進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 涉及單元實(shí)驗(yàn)：涉及單元實(shí)驗(yàn)：蛋白電泳蛋白電泳 掌握要點(diǎn)：掌握掌握要點(diǎn)：掌握蛋白電泳方法及蛋白電泳方法及/Western bloting 了解分離純化樣品純度鑒定的各種方法了解分離純化樣品純度鑒定的各種方法 繪制酶的分離純化表繪制酶的分離純化表 1.1. 包涵體復(fù)性上樣液包涵體復(fù)性上樣液 2.2. 上清上樣液（上清上樣液（Ni柱沉淀柱

22、沉淀） 3. DE3. DE管活性最高管管活性最高管 4 Ni4 Ni柱洗脫活性最高管柱洗脫活性最高管 5. Mark5. Mark（蛋白電泳位置蛋白電泳位置） 6.6. 7.7. 8.8. 9. 9. 1010 點(diǎn)樣量：點(diǎn)樣量：20ul20ul樣品樣品 （不足用（不足用bufferbuffer補(bǔ)足）補(bǔ)足） 20ulloadingbuffer20ulloadingbuffer 煮沸煮沸3 3分鐘，離心分鐘，離心 NiNi柱點(diǎn)樣：上清（柱點(diǎn)樣：上清（1/31/3量）量） 、洗脫、洗脫 WestenWesten電泳位置！電泳位置！ Mark Mark 點(diǎn)在最邊上，點(diǎn)在最邊上，并空行，用于染色并空行

23、，用于染色 要求點(diǎn)兩塊板，順序一致！要求點(diǎn)兩塊板，順序一致！ 預(yù)染預(yù)染Mark 樣品處理勿忘！樣品處理勿忘！ NiNi柱點(diǎn)樣：柱點(diǎn)樣： NiNi柱洗脫活性最高管柱洗脫活性最高管1-81-8組組 Mark Mark 點(diǎn)在最邊上，點(diǎn)在最邊上，并空行，用于染色并空行，用于染色 要求點(diǎn)兩塊板，順序一致！要求點(diǎn)兩塊板，順序一致！ 走電泳時左右方向不能錯，走電泳時左右方向不能錯， 電泳結(jié)束后剪下電泳結(jié)束后剪下Mark泳道，氨基黑染色泳道，氨基黑染色 Western blotingWestern bloting 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理 Western blotingWestern bloting技術(shù)是

24、用來檢測蛋白表達(dá)的靈敏方法技術(shù)是用來檢測蛋白表達(dá)的靈敏方法 由蛋白質(zhì)的由蛋白質(zhì)的SDS-PAGESDS-PAGE、電轉(zhuǎn)及雜交幾部分組成、電轉(zhuǎn)及雜交幾部分組成 雜交技術(shù)主要有雜交技術(shù)主要有NCNC膜封閉，靶蛋白與第一抗體的反應(yīng)，結(jié)合靶蛋膜封閉，靶蛋白與第一抗體的反應(yīng)，結(jié)合靶蛋 白的一抗和二抗的反應(yīng)，顯色等組成白的一抗和二抗的反應(yīng)，顯色等組成 將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NCNC膜上，用其他蛋白作為封閉液，將膜膜上，用其他蛋白作為封閉液，將膜 上余下的其他蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉，加入與檢測蛋白特異性結(jié)合的上余下的其他蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉，加入與檢測蛋白特異性結(jié)合的 第一抗體，經(jīng)免疫反應(yīng)，一抗

25、與靶蛋白結(jié)合，經(jīng)洗膜后，膜上僅第一抗體，經(jīng)免疫反應(yīng)，一抗與靶蛋白結(jié)合，經(jīng)洗膜后，膜上僅 在靶蛋白處結(jié)合抗體。在靶蛋白處結(jié)合抗體。 然后加入與第一抗體有免疫特異性的二抗，使之與一抗反應(yīng)，反然后加入與第一抗體有免疫特異性的二抗，使之與一抗反應(yīng)，反 應(yīng)后經(jīng)洗膜液洗滌，二抗僅存在于結(jié)合靶蛋白的一抗上。因?yàn)檫@應(yīng)后經(jīng)洗膜液洗滌，二抗僅存在于結(jié)合靶蛋白的一抗上。因?yàn)檫@ 種二抗都為酶標(biāo)抗體，通過酶顯色反應(yīng)，膜上結(jié)合靶蛋白位置即種二抗都為酶標(biāo)抗體，通過酶顯色反應(yīng)，膜上結(jié)合靶蛋白位置即 將呈現(xiàn)一定的顏色將呈現(xiàn)一定的顏色 WESTERN BLOT 從負(fù)極從負(fù)極(黑孔板黑孔板)到正極到正極(白孔板白孔板)依次為：依次

26、為： 黑孔板黑孔板、凝膠支持纖維墊、濾紙、凝膠、凝膠支持纖維墊、濾紙、凝膠 凝膠支持纖 維墊 濾紙 凝膠支持纖 維墊 膜 濾紙 蛋白凝膠 大小剪裁：大小剪裁： 膠準(zhǔn)備：去除濃縮膠，去除一個角以定位，電轉(zhuǎn)膠準(zhǔn)備：去除濃縮膠，去除一個角以定位，電轉(zhuǎn)buffer浸浸10min 電轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)12小時小時 電轉(zhuǎn)后用鑷子取下膜，在電轉(zhuǎn)后用鑷子取下膜，在Mark位置剪下條帶，染色位置剪下條帶，染色10分鐘；分鐘； 膜封閉：膜封閉：pH7.5，PBS （含（含5脫脂奶粉），脫脂奶粉），0.1吐溫吐溫20 冰箱過夜冰箱過夜 洗滌：洗滌： PBS（無（無Milk）洗三遍，每次）洗三遍，每次10分鐘分鐘 一抗：一抗： 用用PBS （含（含1脫脂奶粉，脫脂奶粉， 0.1吐溫吐溫20 ）稀釋）稀釋 1：1