PCR的退火溫度選擇

1、精品文檔熔解溫度（ Tm）是引物的一個(gè)重要參數(shù)。這是當(dāng)50的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度 .Tm 對于設(shè)定 PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高， 以減少非特異性結(jié)合。 合理的退火溫度從55到 70 。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm 低 5。設(shè)定 Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18 堿基的引物。有的是根據(jù) GC含量估算 Tm。確定引物 Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會

2、差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的 Tm5 ，以 2 為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的 Tm差異如果超過 5 ，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的 Tm低 5或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低 Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝

3、。當(dāng)引物長度低于20 個(gè) bp 可以根據(jù)Tm=3GC+2AT,對于更長的寡聚核苷酸，Tm計(jì)算公式為：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (%GC) 600/size公式中， Size =引物長度。1歡迎下載精品文檔退火溫度取決于引物長度及序列，GC含量越高退火溫度越高，引物的Tm值減去 5-8 度即是引物的退火溫度，引物的Tm值一般都會在引物合成單上體現(xiàn)，如果沒有的話可以在網(wǎng)上搜個(gè)引物退火溫度計(jì)算器輸入序列就可以了。退火時(shí)間一般都是30秒。試試下載一個(gè)Oligo6.0，這個(gè)軟件挺不錯(cuò)的，在計(jì)算出來的退火溫度基礎(chǔ)上上下幅度一點(diǎn)是沒有什么問題的bioxm2.6更專

4、業(yè)軟件很小很方便更能還挺強(qiáng)大我們剛做了 PCR實(shí)驗(yàn)，當(dāng)引物長度小于25bp 時(shí)，退火溫度通過 （Tm-5） 計(jì)算， Tm=4（ G+C）+2（ A+T）增加 PCR的特異性：1.primersdesign這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件a.足夠長 ,18-24bp,以保證特異性. 當(dāng)然不是說越長越好, 太長的引物同樣會降低特異性, 并且降低產(chǎn)量b.GC% 40%60%c.5 端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性d. 避免 3 端 GC rich,最后 3 個(gè) BASE不要有 GC,或者最后 5個(gè)有 3 個(gè)不要是 GCe.避免 3 端的

5、互補(bǔ) ,否則容易造成DIMERf. 避免 3 端的錯(cuò)配g. 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)h.附加序列 (RT site,Promotersequence) 加到 5 端 ,在算 Tm值時(shí)不算 , 但在檢測互補(bǔ)和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們i.使用兼并引物時(shí) ,要參考密碼子使用表 , 注意生物的偏好性, 不要在 3端使用兼并引物 , 并使用較高的引物濃度 (1uM-3uM)。2歡迎下載精品文檔j.最好學(xué)會使用一種designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Onlinedesginetal.*引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈D

6、NA分子時(shí)的溫度 .Tm 對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下， 退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55到 70 。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低 5 。設(shè)定 Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18 堿基的引物。有的是根據(jù) GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^分析幾個(gè)逐步

7、提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5 ，以 2 為增量， 逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5 ，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。 如果兩個(gè)引物 Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的 Tm低 5或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2.stabilityofprimers定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)

8、量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100 M。 TE 比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20 。以大于10 M濃度溶于TE 的引物在 -20 可以穩(wěn)定保存 6 個(gè)月，但在室溫 （ 15 到 30 ）僅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20 保存至少 1年，在室溫（ 15 到 30 ）最多可以保存 2 個(gè)月。3.optimizereactantsconcentrationa. magnesiom ionsMg離子的作用主要是dNTP-Mg與核酸骨架相互作用并

9、能影響Polymerase 的活性，一般的情況下Mg的濃度在0.5-5mM 之間調(diào)整， 同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度，對實(shí)時(shí)定量PCR，使用 3 到 5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液b.其他的離子NH4+K+都會影響PCR，增加 K+的濃度后 ,會因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度 , 從而降低了 PCR的嚴(yán)謹(jǐn)性 (stringency)，NH4+也有相同的作用.MBI 公司的 TAQ酶就提供了兩種BUFFER,一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4 的，當(dāng)然 ,過高的陽離子濃度(KCL0.2M) 時(shí) ,DNA在 94 度根本不會

10、發(fā)生變性,當(dāng)然也就無從談起PCR了.c.polymerase。3歡迎下載精品文檔不同公司的酶效有所不同, 需要 operator自己掌握適合的酶的濃度，一些高保真沒的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 Taqpolymerase, 所以可能需要的酶的量也要大一些.另外 ,一般的情況下 ,變性的溫度可以使用9092 度 ,變性的時(shí)間也可以縮短, 從而保證 polymerase的活性d.template50ulPCR SYSTEM=humangDNA 0.1ug-1ugE.Coli10ng-100ngLamadaDNA 0.5ng-5ngPlasmidDNA 0.1ng-10ng=4.termperaturea.de

11、naturation常規(guī)是 94度 5 分鐘 ,GCRich 的摸板是95度 5 分鐘除了 GCRich 外,常規(guī)的 APPLICATIONS可以將這部分時(shí)間縮短到1 到 2 分鐘 ,或者在 CYCLE 1時(shí)給予較長的時(shí)間, 而取消開始的denaturationb. annealing重點(diǎn)到了： 一般情況下 ,是從 55 度開始 . 根據(jù)情況配合以 Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整.有條件的可以做 gradientpcr.退火的時(shí)間在30-60S, 時(shí)間短一些可以得到更好的效果.因?yàn)? polymerase在annealingtemp. 時(shí)也會有一些活性. 所以在 A.T. 的時(shí)間過長 ,會極大的增加非特

12、異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，另外, 在對于一些困難戶 ,比如從 gDNA里擴(kuò)增大片段 ,還可使用 two stepPCR.5. touchdown PCR原理很簡單 , 但的確是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子，ANNEALING TEMP.55 度945min94 30s60 30s721min2cycles94 30s5930s721min2cycles94 30s5830s721min2cycles9430s5130s72 1min2cycles9430s5030s721min20cycles72 5min6.hotstartPCR熱啟動(dòng) PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡

13、管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始， 保溫溫度低于退火溫度時(shí)會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。限制 TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜， 但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動(dòng)通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度

14、。包括延緩加入。4歡迎下載精品文檔Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90 度時(shí)， PAUSE，將溫度保持在 70 度以上，手工加入polymerase ，但這個(gè)方法過于煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，入鎂離子或酶， 包裹起來， 或者將反應(yīng)成分， 如模板和緩沖液，物理地隔離開。 在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。=ampliwaxPCRGems(PerkinElmer)Taq BeadHotStartPolymerase(Promega)Magnesiumwaxbeads(Stratagene).

15、=象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactiveDNA Polymerase.polymerase 被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過 70 度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。7.BoosterPCR我們知道1ughumangenomicDNA 大約在 3X105 冪個(gè)模板分子 , 這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合.當(dāng)模板的濃度過低, 比如低于100 個(gè)分子時(shí) ,引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng) .引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體. 這樣就有來了個(gè)boosterPCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個(gè)boost

16、er.具體是這樣的 . 開始幾個(gè)cycles 保持 primer的低濃度 , 保證 primer:template的 molarratio在107108.以確保開始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性. 然后 boostePrimer 的濃度到正常的水平8. 循環(huán)數(shù)和長度確定循環(huán)數(shù)的基本原理是 : 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的最小循環(huán)數(shù). 因?yàn)檫^多的循環(huán)數(shù)容易造成 ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累產(chǎn)物的量不夠 , 優(yōu)化的方法有 :1.增加 TEMPLATE2.增加循環(huán)數(shù)如何確定循環(huán)數(shù) , 有一個(gè)方法 .做一個(gè) PCR體系 ,40 循環(huán) ,50ul,分別在 20,25,30,35 循環(huán)時(shí)從體系中取5ul, 一起跑電泳

17、分析. 從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個(gè)會影響PCR特異性的是PCR cycling時(shí)在兩個(gè)溫度間變化的速率(rampingrate).當(dāng)然是越高越好 . 不過咱們大部分條件有限, 就那么幾臺 PCR儀, 也沒有多少挑選的余地9.thermalcyclerPCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視. 長時(shí)間的使用后需要調(diào)整PCR儀 , 以保證其能夠到達(dá)正確的溫度 . 現(xiàn)在的 PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).10.PCR additives。5歡迎下載精品文檔附加物或者說enhancer實(shí)在是多種多樣 .基本上包括幾類 , 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子 ,DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑

18、. 基本的原理不外是增加引物退火特異性, 減少錯(cuò)配,增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量 .在 GC Rich 情況中 ,additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定, 從而提高擴(kuò)增的效率. 而在另一種情況下 ,additive由于造成錯(cuò)配的 primer-template復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴(kuò)增的忠實(shí)性 . 要注意的是 , 沒有萬能的 enhancer全部通用 , 需要你根據(jù)自己的情況, 最好結(jié)合gradientpcr 選擇最優(yōu)條件 .=dimethylsulfoxide(DMSO)upto 10%formamideat5%trimethylammoniumchloride10-100uMdet

19、ergentssuchasTween 20 0.1-2.5%polyethyleneglycol(PEG)6000 5-15%glycerol10-15%singlestrandedDNAbindingproteinsGene32protein1nME.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM7 deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uM dGTPTaqExtender(stratagene)PerfectMatchPCR Enhancer(stratagene)Q-solution(Qiagen)=要注意的是 ,DMSO,GLY

20、CEROL等會抑制 polymerase的活性 , 所以需要 scouting 出最適的濃度11. Template DNA preparation提取 DNA時(shí)的試劑會抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行. 因此需要對 TEMPLATE DNA進(jìn)行純化 . 特別是SDS(0.01%)的情況下就能強(qiáng)烈抑制PCR的進(jìn)行 .可以加入一些nonionic試劑 , 如Tween,Nonid,Trition之類的反過來抑制SDS.還有 proteinaseK 也要除干凈 ,不然會降解polymerase.12. Nested PCR簡單點(diǎn)說設(shè)計(jì)兩對引物,一對是長的 ,一對是包含在長引物內(nèi)的,用長引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第

21、二次擴(kuò)增的模板, 這樣可以增加產(chǎn)物的量.而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況.增加 PCR的保真性高保真酶高溫 DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或 RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在。6歡迎下載精品文檔特定的引物指導(dǎo)下按3-5方向合成 DNA.包括 3 種類型a.5-3方向的 DNA合成能力 , 沒有 3-5方向的外切酶特性. 如 Taq 及其突變體 . 這類酶的合成能力強(qiáng) , 因?yàn)樗患m正合成中出現(xiàn)的突變b. 與 a 類似 , 有合成活性 , 沒有 3-5 的外切活性 . 但他們能以 RNA為模板 , 合成 DNA.如TthDNA Polymerasec. 有 DN

22、A聚合活性 , 沒有逆轉(zhuǎn)錄活性, 但有 3-5 方向的外切酶活性. 如pfuDNA Polymerase. 可以提高忠實(shí)性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比TaqDNA聚合酶低。酶的混合物將 TaqDNA聚合酶同帶有3 到 5 外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)TaqDNA聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長模板。其他因素除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200M降低到 25-50 M可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。1簡介寡聚核苷酸引物的選擇，

23、通常是整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值這個(gè)和擴(kuò)增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在 RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。 引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量：若使用設(shè)計(jì)粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒有；而使用正確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。計(jì)算機(jī)輔助引物設(shè)計(jì)比人工設(shè)計(jì)或隨機(jī)選取更有效。一些影響PCR反應(yīng)中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，

24、易于在計(jì)算機(jī)軟件中被編碼和限定。計(jì)算機(jī)的高速度可完成對引物位置、長度以及適應(yīng)用戶特殊條件的其他有關(guān)引物的變換可能性的大量計(jì)算。通過對成千種組合的檢測，調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)，可提出適合用戶特殊實(shí)驗(yàn)的引物。因此通過計(jì)算機(jī)軟件選擇的引物的總體 “ 質(zhì)量 ” （由用戶在程序參數(shù)中設(shè)定）保證優(yōu)于通過人工導(dǎo)出的引物。需要指出的是， 引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動(dòng)子序列、限制酶識別位點(diǎn)或5端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙PCR反應(yīng)，而會在以后使用擴(kuò)增子時(shí)發(fā)揮作用。2基本 PCR引物設(shè)計(jì)參數(shù)引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率。 特異性不好或劣等的引物

25、會產(chǎn)生額外無關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子， 在 EB 染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長量的接。7歡迎下載精品文檔近程度。引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/ 模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18 到 24個(gè)堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘?。引物越長，擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性?？偟膩碚f，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4 倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長

26、度為18個(gè)核苷酸。引物設(shè)計(jì)時(shí)使合成的寡核苷酸鏈（1824 聚物）適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。引物的二級結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3 末端形成的二聚體，應(yīng)控制其G大于 -5.0kcal/mol或少于三個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5 端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以 3 端或近 3 端對引物 - 模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免 3 末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。引物

27、 GC含量和 Tm值PCR引物應(yīng)該保持合理的 GC含量。含有 50的 G+C的 20 個(gè)堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56 62范圍內(nèi)，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和 Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。 協(xié)調(diào)性差的引物對的效率和特異性都較差，因?yàn)榻档土?Tm值導(dǎo)致特異性的喪失。 這種情況下引物Tm值越高，其錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時(shí)，這種GC含量和 Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。 一般來說， 一對引物的 Tm值相差盡量不超過23 攝氏度， 同時(shí)引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大， 20 攝

28、氏度范圍內(nèi)較好。引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、限制酶切位點(diǎn)或者GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以使用加長的引物。一般說來，引物5 端添加無關(guān)序列不會影響引物特異序列的退火。有時(shí)候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進(jìn)行4到 5個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；然后在假定引物 5 端序列已經(jīng)加入到模板中， 計(jì)算得出的退火溫度下進(jìn)行其余的循環(huán)。在引物上添加限制酶位點(diǎn)時(shí)一個(gè)重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的 5 端有 2 至 3個(gè)非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個(gè)缺點(diǎn)是影響溶解溫度的精確計(jì)算，

29、而這對于確定PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度又是必須的。對于低于 20 個(gè)堿基的引物， Tm值可以根據(jù) Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“ 最近鄰位 ”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。引物的 3 末端核苷酸組成引物 3 末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物 3 末端最后 5到 6 個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。如果 3 末端的錯(cuò)配過多，通過降低反應(yīng)的退火溫度來補(bǔ)。8歡迎下載精品文檔償這種錯(cuò)配不會有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。引物 3 末端的另一個(gè)問題是防止一對引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補(bǔ)，

30、尤其是在 3 末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的 PCR產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴(kuò)增。 這將會在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。引物 3 末端的穩(wěn)定性由引物3 末端的堿基組成決定，一般考慮末端5 個(gè)堿基的G。此值的大小對擴(kuò)增有較大的影響，負(fù)值大，則3 末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高，同時(shí)也更易于異位引發(fā)。需要注意的是，引物3末端應(yīng)盡量避免T。實(shí)驗(yàn)證明，以T 結(jié)尾的引物即使與T,G或 C錯(cuò)配仍可有效延伸。PCR產(chǎn)物的長度及在耙序列內(nèi)的位置所有的計(jì)算機(jī)程序都提供對PCR產(chǎn)物長度范圍的選擇。一般說來， PCR產(chǎn)物長度對擴(kuò)增效率有影響。特定的應(yīng)用情況

31、下，PCR產(chǎn)物長度部分取決于模板材料。預(yù)期產(chǎn)物的特定長度經(jīng)常取決于應(yīng)用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨床檢驗(yàn)方法，120 300bp的小 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可能是最好的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實(shí)驗(yàn)的足夠信息。這一長度范圍的產(chǎn)物可以通過采用兩步擴(kuò)增循環(huán)方法得到，從而減少擴(kuò)增時(shí)間。其他 PCR方法有不同的最佳產(chǎn)物長度。例如，通過定量的 RNA-PCR檢測基因表達(dá)時(shí)， 產(chǎn)物應(yīng)該足夠大以便構(gòu)成競爭性模板，這樣，產(chǎn)物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產(chǎn)物一般在 250 750bp范圍內(nèi)。補(bǔ)充說明若在 cDNA序列內(nèi)找尋PCR引物，需特別注意兩點(diǎn)：首先，盡力將引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)，因?yàn)檫@是生成蛋白質(zhì)的獨(dú)特序列，不像3 末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引