短柄五加葉片皂苷對果蠅繁殖力的影響研究

1、隴東學院生命科學與技術學院2013屆本科生畢業(yè)論文編號 2009041213 畢 業(yè) 論 文（設 計）（ 2013 屆本科）論文題目：短柄五加葉片皂苷對果蠅繁殖力的影響研究學 院： 生命科學與技術學院 專 業(yè)： 生物教育 班 級： 09級生科2班 作者姓名： 王 富 宏 指導教師： 李東波 職稱： 講師 完成日期： 2013 年 5 月 1 日目 錄誠 信 聲 明20 引言41實驗部分41.1實驗材料、儀器及藥品41.2 藥品及培養(yǎng)基的配制51.2.1 皂苷溶液的配制51.2.2 培養(yǎng)基的配制51.3實驗方法51.3.1 親本果蠅分組與培養(yǎng)51.3.2 F1果蠅數(shù)量統(tǒng)計51.3.3 F1果蠅分

2、組方法61.3.4 F2果蠅數(shù)量統(tǒng)計61.4 數(shù)據處理方法62 結果與分析62.1 皂苷對F1羽化果蠅數(shù)量的影響62.2 整個發(fā)育期皂苷對果蠅繁殖力的影響72.3 幼蟲期皂苷對果蠅繁殖力的影響72.4 果蠅唾液腺的剝離及制片73 討論與結論104 展望10隴東學院全日制普通本科生畢業(yè)論文 誠 信 聲 明 本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文是本人在指導老師的指導下，進行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產權爭議。除文中已經注明引用的內容外，本論文不含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體在文中均作了明確的說明并表示了謝意。本人完全意識到本聲明的法律結

3、果由本人承擔。 作者簽名：2013年5月1日第 0 頁短柄五加葉片皂苷對果蠅繁殖力的影響研究李東波 王富宏 (隴東學院生命科學與技術學院 甘肅 慶陽 745000)摘要:本文研究了短柄五加葉片皂苷對果蠅繁殖力的影響，在對照組培養(yǎng)基中加入不同體積66mgmL-1短柄五加葉片皂苷溶液對果蠅進行培養(yǎng)，在35d內統(tǒng)計完成羽化的F1、F2果蠅數(shù)量。F1羽化果蠅數(shù)量與對照組相比，0.132 mgmL-1、0.264mgmL-1藥物組第一次統(tǒng)計羽化果蠅數(shù)量有顯著增加(P0.05)，增值率分別達到17.15%和35.75%，但隨著對果蠅處理時間延長，子代果蠅數(shù)量減少越來越顯著，增值率達到-85.80%。對F2

4、羽化果蠅數(shù)量統(tǒng)計表明，在果蠅整個發(fā)育期均添加皂苷和只在幼蟲發(fā)育期添加皂苷，其結果大致相同，藥物組F2羽化果蠅數(shù)量與對照組相比減少均達極顯著水平(P0.01)。實驗結果表明皂苷有抑制果蠅繁殖力的作用，本研究為開發(fā)新的農藥提供了科學依據。關鍵詞:短柄五加；果蠅；繁殖力；皂苷Acanthopanax brachypus leaves saponins on Drosophila melanogaster breeding impact studyLI Dong-bong,WANG Fu-hong(Longdong College of Life Science and Technology, Gan

5、su Qingyang 745000)Abstract:This paper studies Acanthopanax brachypus leaf saponin effect on Drosophila melanogaster fecundity,In the control group culture medium with different svolume Acanthopanax brachypus leaves saponins 66 mg mL - 1 leaf saponins solution was carried out Drosophila melanogaster

6、,Within the 35d statistics to complete the number of F1, F2 Drosophila melanogaster.Formula one feather fly number compared with the control group,0.132 mg mL-1, 0.264 mg mL-1 feather fly number for the first time statistics have drug group increased significantly(P0.05),Increment rate reached 17.15

7、% and 35.75%, respectively,But as for Drosophila melanogaster extend processing time,The decrease in the number of children fly more and more significant，Increment rate reached to 85.80%.Statistics show that on the number of F2 feather flies，Add saponins in Drosophila melanogaster the whole growth p

8、eriod and only add saponins in larval development period,The result is roughly same,F2 feather fly number compared with the control group to reduce drug group have reached very significant level (P 0.01).The experimental results showed that saponins have inhibitory effect of Drosophila melanogaster

9、breeding, this study provides scientific basis for the development of new pesticides.Keywords: Acanthopanax brachypus; Drosophila melanogaster; fecundity; saponins0 引言短柄五加(Acanthopanax brachypus)為五加科(Araliaceae)五加屬(Acanthopanax)多年生落葉小灌木，在世界范圍內的分布范圍極其狹窄，主要分布于我國西北黃土高原上的陜西、甘肅、寧夏等地，是我國特有的民間藥用植物。短柄五加含有黃酮

10、和皂苷等活性成分。藥用和食用價值很高，其藥用部位主要為莖皮和根。據研究表明：其根莖的提取物除具有治療神經衰弱、男子性功能障礙、繼發(fā)性高血壓、低血壓、白細胞減少等疾病外，還有防癌抗癌功效；其皮的醇提物具有抗炎作用，還可抑制佐劑關節(jié)炎及、型變態(tài)反應性炎癥2。黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)是生物學研究中最重要的模式生物之一，是一種體長約3mm的昆蟲，因其常聚集在腐爛的水果周圍而得名果蠅(fruit fly)。它作為模式生物的優(yōu)勢主要有體積小、易于操作、飼養(yǎng)簡單、成本低廉、生命周期短、繁殖力強、子代數(shù)量多，以及便于進行表型分析、有利于一般實驗室使用等?；谇逦倪z傳背景和便

11、捷的遺傳操作，果蠅在發(fā)育生物學、生物化學、分子生物學等領域都占據了不可替代的位置。2000年，果蠅全基因組測序基本完成，只有4對染色體，全基因組約165 Mb (人類基因組約3300Mb，約有30000個基因)。編碼蛋白的基因有13600種，約一半蛋白與哺乳動物蛋白有序列同源性3。超過60%的人類疾病基因在果蠅中有直系同源物。這就是本文選用黑腹果蠅作為研究對象的原因。1實驗部分1.1實驗材料、儀器及藥品材料：以隴東學院生科院遺傳實驗室飼喂的黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)野生品系為材料。短柄五加(Acanthopanax brachypus)葉片采自正寧縣中灣林場（鑒

12、定人：郭小強）；葉片皂苷（隴東學院生物技術室已提?。?。儀器：智能型光照培養(yǎng)箱（MGC-300A），電熱恒溫鼓風干燥箱(DNG-9070A，上海一恒科技有限公司），電子天平(BS223S，賽多利斯科學儀器有限公司），電爐，燒杯，量筒，玻璃棒，移液管，試管，試管架，洗耳球等。藥品：玉米粉（散稱，市售），瓊脂（卡拉膠條狀，海南省瓊海市長坡瓊脂廠），酵母浸粉(250g,北京奧博星生物技術有限公司)，白糖(散稱，市售），乙醚（分析純，500mL，天津市化學試劑二廠），丙酸（分析純，500mL，西安化學試劑廠）。1.2 藥品及培養(yǎng)基的配制1.2.1 皂苷溶液的配制根據藥物培養(yǎng)基中皂苷的質量濃度(0.660

13、mgmL-1、0.132mgmL-1、0.264mgmL-1)將皂苷配制成66mgmL-1的溶液100mL，只需稱取6.6g的皂苷加入100mL的蒸餾水進行溶解，即得66mgmL-1的皂苷溶液。要配制含皂苷質量濃度為0.6600mgmL-1、0.132mgmL-1、0.264mgmL-1藥物培養(yǎng)基只需分別加入0.5mL、1mL和2mL皂苷溶液。1.2.2 培養(yǎng)基的配制 A液：準確稱取5.6g玉米粉，4.4g白糖將其置于燒杯中，加入30mL蒸餾水用電爐加熱并不斷攪拌直至糊狀。B液:稱取0.5g瓊脂放入燒杯中，加入20mL蒸餾水用電爐加熱并不斷攪拌直至瓊脂完全溶解。將A液和B液混合均勻后，依次加入

14、0.5g酵母粉，0.4mL丙酸并攪拌均勻即可得對照組培養(yǎng)基。藥物組培養(yǎng)基配制方法與對照組培養(yǎng)基配制方法相同，只需在加入丙酸后再加入所需的皂苷溶液。1.3實驗方法1.3.1 親本果蠅分組與培養(yǎng)收集8h內羽化親本果蠅，分雌雄后，雌雄果蠅隨機組合成20對，分別放入事先裝有皂苷濃度為0mgmL-1、0.660mgmL-1、0.132mgmL-1、0.264mgmL-1培養(yǎng)基的4組試管中，每組5個平行組，共20支，每支試管中雌雄果蠅各1只，置于培養(yǎng)箱中室溫培養(yǎng)。1.3.2 F1果蠅數(shù)量統(tǒng)計每對親本果蠅在試管中培養(yǎng)7d后，轉移至含相同皂苷濃度培養(yǎng)基的試管(新管)中繼續(xù)培養(yǎng)。移除親本的試管(原管)也繼續(xù)培養(yǎng)

15、。再過7d后，在移除親本的試管(原管)中開始有新羽化的F1果蠅出現(xiàn)。每天統(tǒng)計新羽化果蠅數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計7d，作為第一次統(tǒng)計數(shù)據。轉移至另一試管中(新管)繼續(xù)培養(yǎng)的親本，在新試管中培養(yǎng)7d后做同上處理，作為第二次統(tǒng)計數(shù)據，同上，統(tǒng)計第三次數(shù)據，求每次統(tǒng)計的增值率。增殖率=(處理組羽化果蠅數(shù)對照組羽化果蠅數(shù))/對照組羽化果蠅數(shù)100%1.3.3 F1果蠅分組方法統(tǒng)計F2果蠅，實施了兩個實驗方案：一個是收集8h內羽化的4個處理的F1果蠅，分雌雄后，分別對應放入裝有對照組培養(yǎng)基和藥物組培養(yǎng)基的20支試管中培養(yǎng)。共4個處理，每個處理5個平行組，如表2。這樣，處理組果蠅從幼蟲期直至成蟲期均用短柄五加葉片皂苷

16、處理。另一個是收集8h內羽化的4個處理的F1果蠅，分雌雄后，分別對應放入裝有對照組培養(yǎng)基的20支試管中培養(yǎng)。共4個處理，每個處理5個平行組，如表3所示。這樣，處理組果蠅僅幼蟲期用短柄五加葉片皂苷處理。1.3.4 F2果蠅數(shù)量統(tǒng)計每對F1雌雄果蠅在試管中培養(yǎng)7d后，移除F1果蠅。移除F1果蠅的試管繼續(xù)培養(yǎng)。再過7d后，在移除F1果蠅的試管中開始有新羽化的F2果蠅出現(xiàn)。每天統(tǒng)計新羽化果蠅數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計7d，作為F2果蠅統(tǒng)計數(shù)據。1.4 數(shù)據處理方法數(shù)據用SPSS16軟件處理，應用完全隨機設計的單因素方差分析中的LSD法進行分析比較。2 結果與分析2.1 皂苷對F1羽化果蠅數(shù)量的影響對F1羽化果蠅數(shù)

17、量進行統(tǒng)計，結果如表1所示。與對照組比較，0.132 mgmL-1、0.264mgmL-1藥物組第一次統(tǒng)計數(shù)據有顯著增加(P0.05)，增值率分別達到17.15%和35.75%，表明皂苷有增加果蠅繁殖力的作用。但第二、三次統(tǒng)計結果表明，隨著對果蠅處理時間延長，子代果蠅數(shù)量減少越來越顯著，第三次統(tǒng)計結果與對照組相比均達極顯著水平(P0.01),說明皂苷對果蠅繁殖力有抑制作用，但并無劑量效應，組間無顯著差異。表1 短柄五加葉片皂苷對果蠅F1羽化成蟲數(shù)量的影響皂苷濃度/mgmL-1 第一次統(tǒng)計數(shù)據 增值率/% 第二次統(tǒng)計數(shù)據 增值率/% 第三次統(tǒng)計數(shù)據 增值率/% 0 23.33 0.882 22.

18、13 0.465 23.45 0.333 0.660 22.002.517a -5.70 10.670.2642a -51.78 4.330.333A -81.54 0.132 27.33 2.603ab 17.15 12.001.528a -45.77 4.000.577A -82.94 0.264 31.670.333b 35.75 8.670.882a -69.89 3.330.333A -85.802.2 在整個發(fā)育期皂苷對果蠅繁殖力的影響在果蠅整個發(fā)育過程中均添加短柄五加葉片皂苷，統(tǒng)計F2羽化果蠅數(shù)量結果如表2所示。與對照組相比，各處理組的F2羽化果蠅數(shù)量的減少均達極顯著水平(P0.

19、01)，表明皂苷嚴重減弱了果蠅的繁殖力。表2 整個發(fā)育期短柄五加葉片皂苷對果蠅F2羽化成蟲數(shù)量的影響皂苷濃度(幼蟲期)/mgmL-1 皂苷濃度( 成蟲期)/mgmL-1 統(tǒng)計數(shù)據 增殖率/% 0 0 23.330.882 0.660 0.660 0.67 0 .333A -97.13 0.132 0.132 0.67 0 .333A -97.13 0.264 0.264 0. 33 0 .333A -98.59 2.3 在幼蟲期皂苷對果蠅繁殖力的影響僅在果蠅幼蟲發(fā)育過程中添加短柄五加葉片皂苷，統(tǒng)計F2羽化果蠅數(shù)量結果如表3所示。0.132mgmL-1和0.264mgmL-1藥物組中沒有F2果蠅

20、產生，雖然0.660mgmL-1藥物組中有F2果蠅產生，但其增值率卻為 -98.56 %，與對照組相比，各處理組的F2羽化果蠅數(shù)量的減少均達極顯著水平(P0.01)，表明皂苷嚴重減弱了果蠅的繁殖力。表3 幼蟲期短柄五加葉片皂苷對果蠅F2羽化成蟲數(shù)量的影響皂苷濃度(幼蟲期)/mgmL-1 皂苷濃度( 成蟲期)/mgmL-1 統(tǒng)計數(shù)據 增殖率/% 0 0 23.330.882 0.660 0 2.671.202A -98.56 0.132 0 0 -100 0.264 0 0 -100 2.4 果蠅唾液腺剝離及制片為了研究皂苷對果蠅繁殖力的影響，在本實驗之前做了一些前期預備工作，對果蠅三齡幼蟲進行

21、唾液腺剝離及制片，在基因水平研究皂苷的藥理效應。將正常果蠅染色體與藥物處理果蠅染色體進行對比，觀察是否出現(xiàn)染色體斷裂、缺失、異位等基因突變現(xiàn)象，再進一步定位到具體的基因上，從而得出藥物引起果蠅繁殖力減弱的直接原因。前期實驗的成果如下圖所示：圖1 果蠅唾液腺圖2-1 果蠅唾液腺染色體圖2-2 果蠅唾液腺染色體圖2-3 果蠅唾液腺染色體3 討論與結論在野外調查發(fā)現(xiàn)短柄五加葉片不易受蟲侵害。研究顯示，由F1統(tǒng)計結果表明短柄五加葉片皂苷對果蠅的繁殖力有嚴重的影響作用，在皂苷處理初期一定程度上可以增加F1果蠅數(shù)量，表明皂苷有增進果蠅精子和（或）卵子產生的作用，或對果蠅受精有促進作用。但隨處理時間延長，其

22、F1果蠅數(shù)量急劇減少，表明皂苷對果蠅生殖腺有損害作用，造成果蠅不育或不孕。由表1第一次統(tǒng)計數(shù)據可以表明，皂苷并不具有殺精、殺卵或抑制排精、排卵的作用。由F2統(tǒng)計結果表明，在果蠅全發(fā)育時期和幼蟲時期用皂苷處理其結果大致相同，說明皂苷對果蠅幼蟲生殖腺損害作用更為嚴重。這種損害作用是由親本基因突變引起還是由幼蟲自身抗藥性能力弱引起，還需進一步研究。本文研究得出的結論為：短柄五加葉片皂苷對果蠅的生殖腺有嚴重的損害作用，導致果蠅子代數(shù)量嚴重下降，這用來開發(fā)農藥具有廣闊的前景。4 展望由于時間限制和能力不足，本論文有許多不完善之處，致使論文還有許多工作要做。如果按下列實驗方案，將親本果蠅雌雄分開分別用對照、0.132mgmL-1藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)7d、14d、21d，每7d更換一次培養(yǎng)基。然后按下列實驗方案組合，用對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，每個處理5個平行組，統(tǒng)