試述基因工程研究的原理與基本路線并舉例說明其在轉(zhuǎn)基因動物方面的應(yīng)用

1、試述基因工程研究的原理與基本路線并舉例說明其在轉(zhuǎn)基因動物方面的應(yīng)用基因工程是按照人們的愿望對攜帶遺傳信息的分子（DNA）進行設(shè)計和改造,從而培育生物新類型或治療遺傳疾病的一種現(xiàn)代的、嶄新的、分子水平的生物工程技術(shù);包括基因重組、克隆、表達；其核心是構(gòu)建重組體DNA的技術(shù)，因而基因工程和DNA重組技術(shù)有時成為同義詞。當(dāng)代人類社會所面臨的人口的增加、食品的短缺、疑難病的治療、資源的匱乏、環(huán)境染的加劇等重大問題,都在不同程度上依賴于生物技術(shù)的研究加以解決。因為生物技術(shù)能利用生物資源的可再生性,在常溫常壓下生產(chǎn)珍貴藥品;節(jié)約能源和資源、減少環(huán)境污染;能創(chuàng)造動植物優(yōu)良新品種,增加糧食生產(chǎn),開辟食物新來源

2、;解決疑難病的治療,并能對相關(guān)的傳統(tǒng)行業(yè)技術(shù)改造和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整產(chǎn)生極其深遠的作用。所以生物技術(shù)蘊藏著巨大的經(jīng)濟潛力和社會效益。生物技術(shù)的發(fā)展,僅有20多年的歷史。然而在世界范圍內(nèi)給醫(yī)學(xué)帶來了一場革命性的變化,給農(nóng)業(yè)帶來了新的綠色革命,使輕工、食品、環(huán)保、海洋、能源開發(fā)等有關(guān)領(lǐng)域得到了前所未有的發(fā)展。一、基因工程的原理現(xiàn)在人們常說的生物技術(shù)實際上就是現(xiàn)代生物技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等五大工程技術(shù)。其中基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA的重組技術(shù)，也就是基因克隆技術(shù)。既然基因工程這么重要,那么什么是基因工程呢? 基因工程（

3、genetic engineering），是在分子水平上對基因進行操作的復(fù)雜技術(shù)，是指利用DNA體外重組或PCR擴增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞，以期獲得基因表達的過程1。根據(jù)這個概念，人們可以從一個生物的基因中提取有用的基因片斷，植入到另外一個生物體內(nèi)，從而使該生物獲得某些新的遺傳性狀。從而獲得所需要的新的生物的變種，運用基因工程可以加快生物的變異，并使生物的變異朝著有益于人類的方向發(fā)展。同時，這個定義表明，基因工程具有以下幾個重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生

4、物中進行繁殖，能夠跨越天然物種屏障，把來自任何一種生物的基因放置到新的生物中，而這種生物可以與原來生物毫無親緣關(guān)系，這種能力是基因工程的第一個重要特征。第二個特征是，一種確定的DNA小片段在新的寄主細胞中進行擴增，這樣實現(xiàn)很少量DNA樣品拷貝出大量的DNA，而且是大量沒有污染任何其它DNA序列的、絕對純凈的DNA分子群體?？茖W(xué)家將改變?nèi)祟惿臣毎鸇NA的技術(shù)稱為“基因系治療”（germlinetherapy），通常所說的“基因工程”則是針對改變動植物生殖細胞的。無論稱謂如何，改變個體生殖細胞的DNA都將可能使其后代發(fā)生同樣的改變。而且基因工程是處在分子水平上的操作，因而可以跨越不同的物種進行操

5、作，大大改善了傳統(tǒng)的只能同類生物雜交并且不能控制變異方向的方法。不同種的生物一般是不能交配的，例如魚和牛，就不能進行交配而生出下一代。但是利用基因工程，我們可以把魚的某些基因移植到牛的受精卵上，或者把牛的基因移植到魚的受精卵上，加以培養(yǎng)，就可以產(chǎn)生既有牛的性狀又有魚的性狀的新的物種。雖然基因工程有這么多的好處，但是也不是說可以濫用的。因為每種生物經(jīng)過適者生存的自然選擇，都能適應(yīng)所處的生存環(huán)境.如果移植了外來的基因，可能會打破其體內(nèi)的細胞的平衡，從而導(dǎo)致細胞的快速衰老甚至死亡。可見，基因工程要正確處理好細胞的相容性。二、基因工程的基本路線：一般來說，基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，它是用人為

6、方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)-DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源遺傳物質(zhì)在其中“安家落戶”，進行正常復(fù)制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?（如圖1）：從復(fù)雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或多聚酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。在體外，將帶有目的的基因的外源DNA片斷連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，現(xiàn)成重組DNA分子。將重組DNA分子轉(zhuǎn)

7、移到適當(dāng)?shù)氖荏w細胞，并與之一起增殖。從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA分子的受體細胞克隆。從這些篩選出來的受體細胞克隆中提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究實用。將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能的表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 圖1 基因工程的一般步驟（一）、目的基因的獲取1直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離，較少采用2人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。3.從mRNA合成cDNA：采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其

8、互補DNA（cDNA）4從基因文庫中篩選5利用PCR合成（二）、目的基因與載體DNA體外重組1. 粘性末端連接法（如圖2）：即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采用同一種制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法2.人工接尾法（如圖3）3.人工接頭連接法（如圖4） 圖2 粘性末端連接法 圖3 人工結(jié)尾法 圖4 人工接頭連接法（三）、重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞重組DNA需導(dǎo)入宿主細胞才能進行增殖或表達。重組質(zhì)粒可通過轉(zhuǎn)化（transformation）方式導(dǎo)入宿主細胞。如果是用噬菌體作為載體的重組體，則需要用外殼蛋白進行包裝，使之成為具有感染能力的噬菌體，再通過轉(zhuǎn)染(transfe

9、ction)方式將重組噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌等宿主細胞。（四）篩選并鑒定無性繁殖含重組分子的受體細胞（轉(zhuǎn)化子）1.根據(jù)重組體的表型進行篩選：對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法（如圖5）進行篩選。 圖5 插入滅活法2. 根據(jù)標(biāo)志互補進行篩選轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。 受體菌： his- 在不含組氨酸的 外源基因：his+ 培養(yǎng)基中生長3.根據(jù)DNA限制酶譜進行分析（如圖6） 圖64.用核酸雜交法（如圖7）進行分析鑒定采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽性，即可確定重組體中帶目的基因。 圖7 核

10、酸雜交法（五）、外源基因的表達1 、原核表達體系大腸桿菌是當(dāng)前采用最多的原核表達體系 ，尚有一些不足之處：缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，只能表達克隆cDNA，不宜表達真核基因組DNA，缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機制，表達真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)折疊或進行糖基化修飾；很難表達大量的可溶性蛋白等。2、真核表達體系與原核表達體系比較，真核表達體系如酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞表達體系顯示了較大優(yōu)勢性。常用于細胞轉(zhuǎn)染的方法有：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及顯微注射。三、基因工程在轉(zhuǎn)基因動物上的應(yīng)用：（一）轉(zhuǎn)基因動物的概念 借助基因工程技術(shù)把外源目的基因?qū)肷臣毎?、胚胎干細胞和早期胚胎，并在?/p>

11、體染色體上穩(wěn)定整合，使之經(jīng)過各種發(fā)育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個體，即轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）3。轉(zhuǎn)入的目的基因稱為轉(zhuǎn)基因（transgene），這種轉(zhuǎn)移目的基因的過程稱為轉(zhuǎn)基因作用（transgenesis）。關(guān)于“轉(zhuǎn)基因”的概念，通常只限于動、植物中經(jīng)基因工程技術(shù)進行的基因轉(zhuǎn)移，因此品種間不論有性或無性雜交獲得新基因的途徑都不屬此范疇。（二）轉(zhuǎn)基因動物技術(shù) 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是20世紀80年代初發(fā)展起來的一項生物技術(shù)，它克服了物種之間的生殖隔離，實現(xiàn)了動物物種之間遺傳物質(zhì)的交換和重組。根據(jù)外源基因?qū)氲姆椒ê蛯ο蟮牟煌?，至今主要?種途徑可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，即顯

12、微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒法和胚胎干細胞法。 1受精卵原核顯微注射法 顯微注射技術(shù)是從動物胚胎學(xué)研究移核實驗的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。顯微注射法(microinjection)是指通過顯微操作儀把外源基因注入受體動物的受精卵，外源基因整合到受體細胞染色體上，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)4。1974年，Jaenisch5應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了SV40 DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。1981年，Costantini6將兔一珠蛋白基因注入小鼠的受精卵，使受精卵發(fā)育成小鼠，表達出了兔一珠蛋白。20世紀80年代初期人們利用這一方法向動物生殖細胞轉(zhuǎn)移外源基因，成功地建立了轉(zhuǎn)基因小鼠。1985年轉(zhuǎn)基因綿羊和轉(zhuǎn)基因豬問世，

13、以后轉(zhuǎn)基因大鼠、兔、雞、牛、魚等都已陸續(xù)取得成功，可見顯微注射法是迄今應(yīng)用得較為普遍而又最有成效的一種獲得轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)。本方法是在顯微鏡下，用直徑約為1m的玻璃管直接插入受精卵的雄原核內(nèi)，將毛細管內(nèi)所帶有的外源基因的DNA注入原核，然后將其移植到假孕母體輸卵管或子宮內(nèi)并發(fā)育成子代個體。為了解轉(zhuǎn)基因的整合情況，可酌情應(yīng)用斑點雜交、多聚酶鏈式反應(yīng)或Southern印跡雜交等方法對子代個體DNA進行檢測。顯微注射法的優(yōu)點是導(dǎo)入的外源基因片段可長達50 kb，且無需載體，外源基因在宿主染色體上的整合率相對較高。其不足之處是外源基因的整合是隨機的，因而難以控制其整合率；再者，對外源基因能否穩(wěn)定整合于

14、受體基因組的檢測，必須等到子一代個體出生后經(jīng)過選擇才能確定，不利于在生育期長、產(chǎn)仔少的大家畜中應(yīng)用。2胚胎干細胞介導(dǎo)法 胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）是指從哺乳動物胚胎囊胚期內(nèi)的細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，這種細胞具有發(fā)育的多能性，能夠分化出各種組織7。20世紀80年代中期人們開始研究利用ES細胞獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法。這個途徑是將外源基因直接導(dǎo)入ES細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體囊胚腔中，與其中的囊胚細胞聚集在一起，成為受體胚胎的一部分，參與其分化。由這種胚胎發(fā)育而成嵌合體的轉(zhuǎn)基因動物，即其中有一部分組織來源于整合有外源基因的供體ES細胞。在嵌合過程中

15、，被轉(zhuǎn)化的ES細胞分化而成的生殖細胞可通過雜交將引入的外源基因傳遞下去。在以胚胎干細胞為媒介獲得轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)中，既可以用多種方法將外源基因?qū)隕S細胞，且細胞的鑒定、篩選比較方便，又可預(yù)先在細胞水平上測定外源基因的拷貝數(shù)、定位和表達的水平以及插入的穩(wěn)定性等，而且將ES細胞注入囊胚的操作較易進行，整合率相對較高。只是建立ES細胞系本身就是一項難度極高的工作，目前小鼠ES細胞系雖已建立，但在豬、羊中還未能得到真正穩(wěn)定的ES細胞株。3.反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移基因反轉(zhuǎn)錄病毒感染法(retrovirus-mediated gene transfer)主要是利用反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的長末端重復(fù)序列(LTR)區(qū)域具

16、有轉(zhuǎn)錄啟動子活性這一特點，將外源基因連接到LTR下部進行重組后，包裝成高滴度病毒顆粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中，攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上8。反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含有RNA的動物病毒，它的基因組進入寄主細胞內(nèi)，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下合成DNA。反轉(zhuǎn)錄病毒的這種特性說明它有可能是一種天然的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可經(jīng)人工操作改建為動物基因的轉(zhuǎn)移載體。另外，反轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高，但卻不會招致寄主細胞的死亡，被它感染或轉(zhuǎn)化的動物細胞常可持續(xù)許多世代。反轉(zhuǎn)錄病毒可用作載體的另一個優(yōu)點是其寄主范圍廣泛，包括無脊椎動物和脊椎動物，其中有的還能夠在人體細胞中生長。 （三）轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因動

17、物的研究內(nèi)容非常廣泛，20世紀8090年代以來從基礎(chǔ)理論到應(yīng)用技術(shù)在深度和廣度上都有了很大發(fā)展，并已日漸由實驗室走向生產(chǎn)實踐。1在基因表達調(diào)控研究方面的應(yīng)用 利用轉(zhuǎn)基因動物可作為在體內(nèi)研究外源基因表達調(diào)控的“反應(yīng)器”，下面僅就DNA順式調(diào)控元件和基因在發(fā)育中的時空調(diào)節(jié)為例予以介紹。（1）順式調(diào)控元件的研究 異常的脂蛋白水平與動脈粥樣硬化等疾病有關(guān)。人類有5種脂蛋白，各自含有不同的載脂蛋白。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約有17種載脂蛋白，它們的編碼基因已測序，是用于研究心血管疾病的候選基因。把載脂蛋白基因轉(zhuǎn)入小鼠，可用來研究人脂蛋白代謝、調(diào)控以及動脈粥樣硬化。在研究載脂蛋白基因組織特異性表達的順式調(diào)控元件時，發(fā)現(xiàn)有

18、兩簇載脂蛋白基因凋節(jié)的組織特異性表達。一簇包括A、C-和 A-基因，定位于人11號染色體長臂2區(qū)3帶（11q23），是按A、C、A的順序組成。C的轉(zhuǎn)錄方向與其他兩個基因相反。 A-和C-主要在肝和小腸中表達，A-主要在小腸表達。在 C-基因的-0.2-1.4bp之間是調(diào)節(jié) A基因在小腸中表達的區(qū)域。這個區(qū)域也是 C和A基因在小腸表達的凋控元件，表明這一元件可以調(diào)節(jié)整個載脂蛋白基因簇在小腸的表達。另一基因簇定位于19號染色體長臂1區(qū)3帶（19q13），包含有E、C和C-基因，它們按E、C、C順序排列。E基因主要在肝臟和大部分身體組織中表達，但表達水平低。以后發(fā)現(xiàn)在C基因和C基因之間有一調(diào)控區(qū)可使

19、E基因在肝臟內(nèi)高水平表達，該區(qū)長約154 bp。此外，還證實這個調(diào)控區(qū)也調(diào)節(jié)該座位其他兩個載脂蛋白基因 C和 C在肝臟的表達。（2）與發(fā)育相關(guān)基因的表達與調(diào)控 用轉(zhuǎn)基因動物可研究基因在發(fā)育中的時空調(diào)控。珠蛋白基因是研究發(fā)育調(diào)控的最好例子。人類珠蛋白基因分為、兩簇，分別定位于16號和11號染色體，各長30kb和60kb。據(jù)1993年的報道，為分析完整的-珠蛋白基因中人的珠蛋白基因的開關(guān)調(diào)控，Peterson等把一個含有248 kb長的人-珠蛋白基因簇的酵母人工染色體（YAC）轉(zhuǎn)入小鼠。對轉(zhuǎn)基因小鼠中此基因簇的表達分析表明，在成年的轉(zhuǎn)基因動物中只有人-珠蛋白表達；在子一代和子二代動物中證實YAC

20、座位有樣珠蛋白基因的發(fā)育開關(guān)調(diào)控，即在卵黃囊中有-和-珠蛋白基因表達，在14天的肝臟中有少量和大量表達，而在成年動物中則僅有珠蛋白基因的mRNA表達。采用先在酵母細胞內(nèi)通過同源重組的方式使YAC發(fā)生突變，然后把這種突變的YAC導(dǎo)入小鼠，就可以詳細研究整個座位上基因的調(diào)控機制，如珠蛋白基因在發(fā)育與分化中的基因表達、定點誘變的基因?qū)Πl(fā)育凋節(jié)的影響等等。 除前述有關(guān)基因表達凋控的研究外，把轉(zhuǎn)基因動物用于遺傳病動物模型的研制近年來發(fā)展也很快，如把pro-膠原突變基因?qū)胄∈蠡蚪M，可產(chǎn)生類似人的骨發(fā)育不全癥的轉(zhuǎn)基因小鼠，這對了解人類遺傳病的發(fā)病機理意義重大。2用于基因產(chǎn)品的制備在轉(zhuǎn)基因動物中，導(dǎo)入的目

21、的基因表達，人們就可以從該動物的乳汁和血液里獲得目的基因產(chǎn)物，因此，可把轉(zhuǎn)基因動物看作是一種個體表達系統(tǒng)（whole animal expression system），以制備某種基因產(chǎn)物。這樣的轉(zhuǎn)基因動物常被稱作動物生物反應(yīng)器（animal bioreactor）。1982年P(guān)almiter把大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠，成功地獲得高效表達生長激素的小鼠，其體積明顯增加，證實了用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)外源基因產(chǎn)品的可行性。近年來的報道已證實在轉(zhuǎn)基因家畜（如豬）的乳腺中可高效合成自身不含有的異源蛋白，如乳清蛋白等。目前，英國正在研究通過羊-乳球蛋白啟動子和乳清蛋白啟動子的控制，在轉(zhuǎn)基因羊體內(nèi)表達人1抗胰蛋

22、白酶和凝血因子；在美國已有在轉(zhuǎn)基因小鼠、乳羊和乳牛乳汁中分別表達產(chǎn)生tPA和促性腺素的研究報道。我國利用轉(zhuǎn)基因動物為反應(yīng)器生產(chǎn)基因制品的工作也在展開，最近有關(guān)單位已從轉(zhuǎn)基因羊乳汁中獲得促紅細胞生成素。3動物品種的培育與改良通過外源基因的導(dǎo)人，改造動物的基因組，可達到使家畜、家禽的生長速度加快，肉、蛋或奶產(chǎn)量及品質(zhì)提高，飼料利用率提高、抗病力加強的目的。加上體細胞克隆技術(shù)能使優(yōu)良種畜迅速擴群，可在短時間培育出新品種。對于動物遺傳資源保護的意義更加深遠，對瀕危物種挽救是必不可少的。目前這方面的應(yīng)用也是轉(zhuǎn)基因動物最具經(jīng)濟開發(fā)前景的領(lǐng)域之一。把具有優(yōu)良性狀的基因或抗病基因?qū)胄笄菀耘嘤碌钠贩N，這是轉(zhuǎn)

23、基因動物研究中的一個極重要的方面。如已培育出抗雞白細胞組織增生病毒的轉(zhuǎn)基因雞新品種。丘才良9把一種寒帶比目魚抗凍蛋白基因(AFP)成功地轉(zhuǎn)移到大西洋鮭中，為提高某些魚類的抗寒能力做了積極的嘗試，魏彥章10利用人生長激素基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速增長的效應(yīng)。1985年我國學(xué)者朱作巖在國際上首次將小鼠MThGH融合基因注入金魚受精卵中，獲得轉(zhuǎn)基因金魚，其F1比轉(zhuǎn)基因魚的同代大兩倍。以后該類實驗中還陸續(xù)獲得其他鯽、鯉等幾種轉(zhuǎn)入生長激素基因的魚。四、展望基因工程技術(shù)以其巨大的生命力影響著人類的生活 ，并已逐步滲透到人類生活的各個領(lǐng)域。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域的不斷拓展，在實驗室獲得的新突破和技術(shù)成果不斷地運用到生產(chǎn)實踐中去，創(chuàng)造出更多具有優(yōu)良經(jīng)濟性狀的不同種類的轉(zhuǎn)基因動物，使地球的生物圈變得更加豐富多彩。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展為研究動物改良、抗病育種方面，探明人類疾病發(fā)病機理研究以及建立人類遺傳疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，建立動物生物反應(yīng)器來生產(chǎn)天然活性藥物蛋白和基因治療以及生產(chǎn)人類器官代用品等方面極具有開發(fā)潛力，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟和推廣將給人類帶來無限光明 。參考文獻：1李立家，肖庚富基因工程 M 北京：科學(xué)出版社，2 0 0 4 ：1 2蘇明學(xué)“基因工程的基本操作程序”的教學(xué)分析與設(shè)計J生物學(xué)通報，2009（44）：33基因工程與轉(zhuǎn)基因動物J中國禽業(yè)導(dǎo)刊。2001（1