基因工程-7章PCR技術(shù)及其應(yīng)用教學(xué)課件

1、 圖圖 1 口腔腺中提取的口腔腺中提取的RNA M: DL2000 marker; 1: 5 L RNA; 2: 10 L RNA; 3: 15 L RNA. M 1 2 3 28S 18S 5S 7/22/20214 第七章 PCR技術(shù)及其應(yīng)用 一、一、PCR技術(shù)原理技術(shù)原理 二、二、PCR技術(shù)的主要類型技術(shù)的主要類型 三、三、PCR技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 7/22/20215 PCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史 DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 DNADNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5 53 TAGCGCTATCGCATCGA

2、CGCTGGATCG 3 35 解鏈酶 DNADNA 解旋解鏈解旋解鏈 合成引物合成引物 子鏈延長子鏈延長 一、一、 PCR技術(shù)原理技術(shù)原理 7/22/20216 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 DNA變性與復(fù)性 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 引物酶 引物酶 RNARNA引物引物 RNARNA引物引物 7/22/20217 PCR技術(shù)簡史 DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 DNADNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性 聚合酶鏈反應(yīng)

3、的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNADNA 解旋解鏈解旋解鏈 合成引物合成引物 子鏈延長子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3 ATAGCGTAGCTGCGACCTACC 3 DNADNA 聚合酶聚合酶 DNADNA 聚合酶聚合酶 7/22/20218 PCRPCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 DNA變性與復(fù)性 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明 7/22/20219 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 DNA變性與復(fù)性 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明

4、 n1971年，年，Khorana提出：經(jīng)過提出：經(jīng)過 DNA變性，與合適引物雜交，用變性，與合適引物雜交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不斷重聚合酶延伸引物，并不斷重 復(fù)該過程便可克隆復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。基因。 n但由于測序和引物合成的困難，但由于測序和引物合成的困難， 以及以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明年代基因工程技術(shù)的發(fā)明 使克隆基因成為可能，所以，使克隆基因成為可能，所以， Khorana設(shè)想被人們遺忘了設(shè)想被人們遺忘了 7/22/202110 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 DNA變性與復(fù)性 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 n1985年，美國年，美國PE-Cetus公司的公司的 Mulli

5、s等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 n基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制。復(fù)制。 n最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過，由于該酶不耐熱，使這一過 程耗時，費(fèi)力，且易出錯。程耗時，費(fèi)力，且易出錯。 n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶的應(yīng)用使得的應(yīng)用使得PCR能能 高效率的進(jìn)行高效率的進(jìn)行 7/22/202111 DNA polermases for PCR: Thermus aquaticus 古細(xì)菌古細(xì)菌-水生棲熱菌水生棲熱菌 最適生長溫度最適生長溫度70，具有，具有 5 3聚合酶活性和

6、聚合酶活性和5 3 外切酶活性外切酶活性 7/22/202112 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 7/22/202113 引物引物 引物引物 7/22/202114 7/22/202115 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 DNA變性與復(fù)性 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶的應(yīng)用使得的應(yīng)用使得PCR能能 高效率的進(jìn)行，隨后高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推公司推 出了第一臺出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀自動化熱循環(huán)儀 PCR的基本原理 類似于類似于DNADNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNADNA模板加模板加

7、 熱熱變性變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫 度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火退火， 再將溫度升高使退火引物在再將溫度升高使退火引物在DNADNA聚合酶作用下得聚合酶作用下得 以以延伸延伸。這種熱變性。這種熱變性- -復(fù)性復(fù)性- -延伸的過程就是一延伸的過程就是一 個個PCRPCR循環(huán)，循環(huán)，PCRPCR就是在合適條件下的這種循環(huán)就是在合適條件下的這種循環(huán) 的不斷重復(fù)。的不斷重復(fù)。 7/22/202116 7/22/202117 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template

8、 DNA by Heat (95) 7/22/202118 Target Sequence Target Sequence PCRPCR原理示意圖原理示意圖 模板模板DNA的變性：模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至93-95左右一定時間左右一定時間 后后,使模板使模板DNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離解離,使之使之 成為單鏈成為單鏈,以便它與引物結(jié)合以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target s

9、equences 7/22/202119 Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5 3 5 5 3 5 3 3 模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性) )：模板：模板DNADNA經(jīng)加熱變性成單鏈后經(jīng)加熱變性成單鏈后, , 溫度降至溫度降至5555左右左右, ,引物與模板引物與模板DNADNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementa

10、ry nucleotides are incorporated 7/22/202120 Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5 3 5 5 3 5 3 3 Taq DNA Polymerase 引物的延伸：引物的延伸： DNADNA模板模板- -引物結(jié)引物結(jié) 合物在合物在TaqDNATaqDNA聚聚 合酶的作用下，合酶的作用下， 以以dNTPdNTP為反應(yīng)原為反應(yīng)原 料，靶序列為模料，靶序列為模 板，按堿基配對板，按堿基配對 與半保留復(fù)制原與半保留復(fù)制原 理，合成一條新理，合成一條新 的與模板的與模板DNA DNA 鏈。鏈。 En

11、d of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence 7/22/202121 Target Sequence Target Sequence 每完成一個循環(huán)每完成一個循環(huán) 需需2 24 4分鐘，分鐘， 2 23 3小時就能將小時就能將 待擴(kuò)目的基因擴(kuò)待擴(kuò)目的基因擴(kuò) 增放大幾百萬倍。增放大幾百萬倍。 7/22/202122 被擴(kuò)增的被擴(kuò)增的DNADNA片段片段 模板模板 DNA DNA 變性變性 引物與模板退火引物與模板退火 引物延伸引物延伸 模板模板DNADNA變性變性 引物與模板退火引物與模板退火 引物延伸引物延伸 引

12、物延伸引物延伸 循環(huán)循環(huán)1 1 循環(huán)循環(huán)2 2 循環(huán)循環(huán)3 3 模板模板 DNA DNA 變性變性 引物與模板退火引物與模板退火 2 21 12 2 2 22 24 4 2 23 38 8 2525次循環(huán)后，被擴(kuò)增的次循環(huán)后，被擴(kuò)增的DNADNA片片 段的拷貝數(shù)為段的拷貝數(shù)為 2 225 25 附圖 附圖 Target Amplification Target Amplification 7/22/202123 No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 1

13、 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 7/22/202124 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 緩沖溶液緩沖溶液(Mg2+是是DNA聚合酶的激活劑聚合酶的激活劑) 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 脫氧核糖三磷酸核苷酸脫氧核糖三磷酸核苷酸 (dNTPs) 模板模板DNA或或cDNA 上游引物、下游引物上游引物、下游引物 7/22/202125 （1）

14、PCR反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 Mg2+是是DNA聚合酶的激活劑。聚合酶的激活劑。 1.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過低會使?jié)舛冗^低會使Taq酶活性喪失、酶活性喪失、PCR產(chǎn)量產(chǎn)量 下降；下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、 EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。濃度。 7/22/202126 （2）Taq DNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-5 U/100 L 酶量增加使反應(yīng)特異性下降酶量增加使

15、反應(yīng)特異性下降; 酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 7/22/202127 （3）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度應(yīng)相等,一般為一般為50-200 mol/L 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則 降低反應(yīng)產(chǎn)量降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與可與Mg2+結(jié)合，使游離的結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，濃度下降， 影響影響DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 7/22/202128 （4）模板）模板 單、雙鏈單、雙鏈DNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、D

16、NA聚合酶抑制聚合酶抑制 劑、劑、DNA結(jié)合蛋白類。結(jié)合蛋白類。 一般一般100ng DNA模板模板/100 L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 7/22/202129 （5）引物濃度）引物濃度 0.1-1 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性反應(yīng)特異性 下降。下降。 PCR引物的設(shè)計一般原則引物的設(shè)計一般原則 引物長度一般以引物長度一般以1530bp為宜為宜,過短則降低特異過短則降低特異 性，過長則會引起引物間退火而影響有效擴(kuò)增。性，過長則會引起引物間退火而影響有效擴(kuò)增。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避

17、免序列內(nèi)有較長避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長 的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 G/C和和A/T堿基均勻分布，堿基均勻分布，G/C含量在含量在4555%之之 間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避 免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。 7/22/202130 要避免兩個引物間特別是要避免兩個引物間特別是3末端堿基序列互補(bǔ)以末端堿基序列互補(bǔ)以 及同一引物自身及同一引物自身3末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們 不能形成引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。不能形成引物二聚體或

18、發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 引物引物3末端堿基一般應(yīng)與模板末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對，并嚴(yán)格配對，并 且且3末端為末端為G、C或或T時引物效率較高。時引物效率較高。 引物引物5末端堿基可不與模板末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與匹配，可添加與 模板無關(guān)的序列模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序 列、列、ATG起始密碼子或啟動子序列等起始密碼子或啟動子序列等)，便于克，便于克 隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。 引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。 7/22/202131 7/22/2021

19、32 例例 1. 引物的引物的 3 末端形成雜交末端形成雜交 5 GGCTATACCGATTCGAATCA 3 3 ACTAAGCTTAGCCATATCGG 5 例例 2. 引物的引物的 5 末端形成雜交末端形成雜交 5 ATCGATCGATGGCATGGTAT 3 3 TATGGTACGGTAGCTAGCTA 5 例例 3. 引物的中間部分形成雜交引物的中間部分形成雜交 5 AACGAGCTTCGAAGGCTAA 3 3 AACGAGCTTCGATGGCTAA 5 例例 4. 5 CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC 3 引物設(shè)計軟件：引物設(shè)計軟件：Primer 5, Oligo6 目

20、的基因上游引物設(shè)計目的基因上游引物設(shè)計 目的基因下游引物設(shè)計目的基因下游引物設(shè)計 7/22/202141 PCR一般循環(huán)參數(shù)一般循環(huán)參數(shù) 變性變性 使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA解鏈為單鏈解鏈為單鏈,95 3,95 35 5分鐘分鐘 (2)(2)退火退火 溫度由引物長度和溫度由引物長度和GC含量決定含量決定, 適宜的退火溫度大適宜的退火溫度大 約低于引物約低于引物Tm值值45-55 ，介于，介于45-55 。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低降低 溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 Tm值值就是就是DNA熔解溫度，指把熔解溫度，指把DN

21、A的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。 Tm（）（）（）（） 7/22/202142 （3 3）延伸）延伸 7272，延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定，延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定 （4 4）循環(huán)次數(shù)）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版主要取決于模版DNADNA的濃度的濃度 一般為一般為25-3525-35次次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加 標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： 10緩沖液緩沖液 10 L 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 各各10100pmol 模板模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶聚合

22、酶 2.5U Mg 2+ 1.5mmol/L 7/22/202143 7/22/202144 PCR儀儀 7/22/202145 模板DNA 95 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 7/22/202146 50 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 7/22/202147 引物1 引物2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 7/22/202148 72 第1輪結(jié)束 第2輪開始 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 7/22/202149

23、 95 50 72 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 7/22/202150 72 第2輪結(jié)束 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 7/22/202151 重復(fù)30輪后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1輪擴(kuò)增 第2輪擴(kuò)增 第3輪擴(kuò)增 第4輪擴(kuò)增 第5輪擴(kuò)增 第6輪擴(kuò)增 理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù) 實際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 附圖 PCR反應(yīng)注意的事項反應(yīng)注意的事項 （一）防止污染（一）防止污染 試劑小量分裝試劑小量分裝 吸頭及吸頭及EPEP管一次性使

24、用管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 （二）設(shè)立對照（二）設(shè)立對照： 陽性對照：陽性對照： 陽性模板陽性模板 陰性對照：陰性對照： 陰性模板陰性模板 試劑對照：試劑對照： 除模板外的所有組分除模板外的所有組分 7/22/202152 PCR反應(yīng)的特點(diǎn)反應(yīng)的特點(diǎn) 靈敏度高靈敏度高 皮克皮克(pg=10(pg=10-12 -12) )量級擴(kuò)增到微克 量級擴(kuò)增到微克(ug=10(ug=10-6 -6) )水平 水平 能從能從100100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞 病毒檢測的靈敏度可達(dá)病毒檢測的靈敏度可達(dá)3 3個個RFURFU（空斑形成單位

25、）（空斑形成單位） 細(xì)菌檢測的最小檢出率為細(xì)菌檢測的最小檢出率為3 3個細(xì)菌個細(xì)菌 簡便、快速簡便、快速 一次性加好反應(yīng)液，一次性加好反應(yīng)液，2 24 h4 h完成擴(kuò)增完成擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析 對標(biāo)本的純度要求低對標(biāo)本的純度要求低 u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織 的粗提的粗提DNADNA 7/22/202153 空斑形成單位又稱蝕斑形成單位，是計量病毒（或噬菌體空斑形成單位又稱蝕斑形成單位，是計量病毒（或噬菌體 ）的一種單位，但只限于用在有產(chǎn)生空斑能力的病毒。其）的一種單位，但只限于用在有產(chǎn)生空斑能力

26、的病毒。其 原理是：用少量有破壞宿主細(xì)胞能力的病毒去感染已形成原理是：用少量有破壞宿主細(xì)胞能力的病毒去感染已形成 致密單層狀態(tài)的宿主細(xì)胞群體時，經(jīng)過一定培養(yǎng)時間使每致密單層狀態(tài)的宿主細(xì)胞群體時，經(jīng)過一定培養(yǎng)時間使每 個感染細(xì)胞周圍的細(xì)胞逐漸感染崩潰，形成肉眼可見的空個感染細(xì)胞周圍的細(xì)胞逐漸感染崩潰，形成肉眼可見的空 斑（噬菌體時可直接觀察，病毒時則需借助于活體染色的斑（噬菌體時可直接觀察，病毒時則需借助于活體染色的 方法）。在理論上，一個病毒體就可以形成一個空斑，但方法）。在理論上，一個病毒體就可以形成一個空斑，但 實際上有不同程度誤差，因此不能準(zhǔn)確的與其他計量單位實際上有不同程度誤差，因此不

27、能準(zhǔn)確的與其他計量單位 互換。用互換。用PFUPFU計量病毒的方法叫作計量病毒的方法叫作PFUPFU法。法。 1、反轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 2、反向、反向PCR 3、復(fù)合、復(fù)合PCR 4、不對稱、不對稱PCR 5、嵌套、嵌套PCR 6、3Full RACE 7、5Full RACE 8、實時定量、實時定量PCR 7/22/202155 二、二、PCR技術(shù)的主要類型技術(shù)的主要類型 1、反轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 是指以是指以mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成 cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的第一鏈為模板進(jìn)行的PCR。 用于測定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄用于測定基因表

28、達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄 序列是否發(fā)生突變序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性多態(tài)性,克隆克隆 mRNA的的5和和3末端序列末端序列,以及從非常少量以及從非常少量 的的mRNA樣品構(gòu)建大容量的樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫。文庫。 7/22/202156 7/22/202157 反轉(zhuǎn)錄酶具有依賴于反轉(zhuǎn)錄酶具有依賴于RNA的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和 RNA酶酶H活性，活性， AMV(42)和和MMLV（37）。）。 雙向外切雙向外切DNA-RNADNA-RNA雜合鏈中的雜合鏈中的RNARNA鏈鏈 7/22/202158 7/22/202159 5 3AAAAA 53 5 3 35 53 3

29、5 53 RT-PCR 原理原理 mRNA 1st cDNA 反轉(zhuǎn)錄酶、下游引物、反轉(zhuǎn)錄酶、下游引物、dNTPs Taq DNA聚合酶聚合酶、上游及下游引物、上游及下游引物、dNTPs 5 5 3 3特異特異 PCR 產(chǎn)物產(chǎn)物 5 53 3 經(jīng)經(jīng) 30 個循環(huán)，產(chǎn)生個循環(huán)，產(chǎn)生 230 個分子拷貝個分子拷貝 5 53 3 7/22/202160 MLV RT催化催化 的的 cDNA合成合成 RT-PCR引物選擇 7/22/202163 2、反向、反向PCR (reverse PCR) 是用反向引物對某個已知是用反向引物對某個已知DNA片段兩側(cè)未知片段兩側(cè)未知 序列進(jìn)行的序列進(jìn)行的PCR。 可對

30、未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接如探索鄰接 已知已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的片段的序列；用于僅知部分序列的 全長全長cDNA的克隆的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入擴(kuò)增基因文庫的插入DNA。 已知序列已知序列 未知序列未知序列未知序列未知序列 7/22/202164 已知序列已知序列 未知序列未知序列未知序列未知序列 限制酶限制酶 限制酶限制酶 連接酶連接酶 7/22/202165 3、復(fù)合、復(fù)合PCR(或稱多重或稱多重PCR) 在一個反應(yīng)體系加入多對不同的在一個反應(yīng)體系加入多對不同的PCRPCR引物同時擴(kuò)增，引物同時擴(kuò)增， 獲得多個獲得多個PCRPCR產(chǎn)物，這

31、種產(chǎn)物，這種PCRPCR稱為復(fù)合稱為復(fù)合PCRPCR。用于檢測。用于檢測 特定基因序列的存在或缺失。特定基因序列的存在或缺失。 電電 泳泳 7/22/202166 4、不對稱、不對稱PCR 是指用不等量的一對引物產(chǎn)生大量單鏈?zhǔn)侵赣貌坏攘康囊粚σ锂a(chǎn)生大量單鏈DNA的的PCR。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物 和非限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.01 0.5M,關(guān)鍵是關(guān)鍵是 限制性引物的絕對量。限制性引物的絕對量。 用途：用途： 制備核酸序列測定的模板制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針制備雜交探針

32、基因組基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究結(jié)構(gòu)功能的研究 7/22/202167 高濃度引物 低濃度引物 5、嵌套、嵌套PCR(或稱巢式或稱巢式PCR) u是指先后用兩套引物進(jìn)行擴(kuò)增的是指先后用兩套引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCRPCR。 u用第一套引物擴(kuò)增用第一套引物擴(kuò)增15153030個循環(huán)；個循環(huán)； u再用擴(kuò)增再用擴(kuò)增DNADNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增1515 3030個循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增。個循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增。 7/22/202168 6 6、3Full RACE3Full RACE 7、5Full RACE 5-flanking regio

33、n of chicken ovalbumin gene 8、實時熒光定量、實時熒光定量PCR(real-time PCR): 美國美國PE（Perkin Elmer）公司）公司1995年研制出年研制出 來的一種新的核酸定量技術(shù)。來的一種新的核酸定量技術(shù)。 通過特定設(shè)計的通過特定設(shè)計的PCR儀器檢測儀器檢測PCR擴(kuò)增過程擴(kuò)增過程 每一輪循環(huán)產(chǎn)物標(biāo)記的熒光信號累積數(shù)量，每一輪循環(huán)產(chǎn)物標(biāo)記的熒光信號累積數(shù)量， 從而進(jìn)行實時監(jiān)測整個從而進(jìn)行實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過進(jìn)程，最后通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析,稱為實時稱為實時 熒光定量熒光定量PCR。以參照物為標(biāo)

34、準(zhǔn)，對以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)終產(chǎn) 物進(jìn)行分析或?qū)ξ镞M(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到 評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。 7/22/202176 （1） SYBR Green I 檢測模式檢測模式 通過通過PCRPCR反應(yīng)生成雙鏈反應(yīng)生成雙鏈DNADNA，SYBRSYBR Green I Green I與雙鏈與雙鏈DNADNA 結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測PCRPCR反應(yīng)液中的熒光信號強(qiáng)度反應(yīng)液中的熒光信號強(qiáng)度 ，可以對目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時還可以測定擴(kuò)，可以對目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時還可以測定擴(kuò)

35、 增的目的增的目的DNADNA片段的融解溫度。片段的融解溫度。 SYBR Green I SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)：SYBR Green I SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)是因為的優(yōu)點(diǎn)是因為 其缺點(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈其缺點(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈 DNADNA相結(jié)合，所以相結(jié)合，所以 對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性 較好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，因較好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，因 此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。 7/22/202179 （2） 水解探針

36、模式（水解探針模式（Taqman探針）探針） 發(fā)射基團(tuán)發(fā)射基團(tuán) 熒光淬滅基團(tuán)熒光淬滅基團(tuán) 5 3 該探針可與擴(kuò)增序列內(nèi)的該探針可與擴(kuò)增序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交模板發(fā)生特異性雜交,探針探針 的的5端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán),靠近靠近3端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán),探探 針針3端被磷酸化端被磷酸化以防止探針在以防止探針在PCR擴(kuò)增過程中被延伸。擴(kuò)增過程中被延伸。 7/22/202180 7/22/202181 工作原理是工作原理是利用利用Taq酶的酶的53外切酶活性。外切酶活性。 在在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標(biāo)記探針，它與引反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標(biāo)記探針，它與引 物包

37、含序列內(nèi)的物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交。模板發(fā)生特異性雜交。 探針的探針的5端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)(熒光發(fā)射峰值在熒光發(fā)射峰值在 518nm處處)，3端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán) (熒光發(fā)射峰值熒光發(fā)射峰值 在在582nm處處)且被磷酸化，以防止探針且被磷酸化，以防止探針3端在端在PCR擴(kuò)擴(kuò) 增過程中被延伸。增過程中被延伸。 7/22/202182 當(dāng)探針保持完整時，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光當(dāng)探針保持完整時，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光 發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作 用被解除，用被解除，518nm處的光

38、密度增加而被熒光探測系處的光密度增加而被熒光探測系 統(tǒng)檢測到。統(tǒng)檢測到。 復(fù)性期探針與模板復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨酶隨 引物延伸沿引物延伸沿DNA模板移動，當(dāng)模板移動，當(dāng)Taq酶移動到探針切酶移動到探針切 斷斷,淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。 模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個 熒光信號的釋放。由于熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和 PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系,因此用該技術(shù)可對模因此用該技術(shù)可對模 板進(jìn)行準(zhǔn)確定

39、量。板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 7/22/202183 Lymphocyte IntestineKidneyHeartGill 0 20 40 60 80 Relative Expression Tissues Control Lps ConA 實時定量實時定量PCRPCR法檢測法檢測Lj-HMGB2Lj-HMGB2基因在各組織中含量基因在各組織中含量 7/22/202185 三、三、PCRPCR技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 1. 基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)研究 基因或基因或 cDNA 克?。簭幕驍?shù)據(jù)庫中獲得某一基因克?。簭幕驍?shù)據(jù)庫中獲得某一基因 或或 cDNA 核苷酸序列核苷酸序列, 用用 PCR 方法擴(kuò)增并克隆該基因方法

40、擴(kuò)增并克隆該基因 或或 cDNA。 基因表達(dá)：用基因表達(dá)：用 RT-PCRRT-PCR檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平 的表達(dá)。的表達(dá)。 2. 醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué) 感染性疾病病原體的診斷：感染性疾病病原體的診斷：HIV、結(jié)核桿菌、乙肝、結(jié)核桿菌、乙肝 病毒等。病毒等。 遺傳病相關(guān)基因檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。遺傳病相關(guān)基因檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。 惡性腫瘤的診斷。惡性腫瘤的診斷。 7/22/202186 3. 法醫(yī)學(xué)中的基因和親子鑒定法醫(yī)學(xué)中的基因和親子鑒定 DNA 指紋圖譜指紋圖譜 19841984年英國萊斯特大學(xué)的遺傳學(xué)家年英國萊斯特大學(xué)的遺傳學(xué)家JefferysJef

41、ferys及其合及其合 作者首次將分離的人源作者首次將分離的人源小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNADNA用作基因探針，同用作基因探針，同 人體核人體核DNADNA的酶切片段雜交，獲得了由多個位點(diǎn)上的的酶切片段雜交，獲得了由多個位點(diǎn)上的 等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋 極少有兩個人完全相同，故稱為極少有兩個人完全相同，故稱為DNADNA指紋指紋 ，意思是，意思是 它同人的指紋一樣是每個人所特有的。它同人的指紋一樣是每個人所特有的。 AATG 7 repeats 8 repeats AATGAATG 引物引物 引物引物 引物引物 引物引物 簡單序列重復(fù)簡單

42、序列重復(fù)(SSR)實驗方法實驗方法 現(xiàn)場現(xiàn)場 嫌疑人嫌疑人1 嫌疑人嫌疑人2 嫌疑人嫌疑人3 法醫(yī)鑒定法醫(yī)鑒定 案例一案例一 親子鑒定親子鑒定 案例二案例二 4. 考古學(xué)中生物種類間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑判定考古學(xué)中生物種類間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑判定 5. 基因動、植物的檢測基因動、植物的檢測 轉(zhuǎn)基因動物的檢測：檢測某一基因的遺傳穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因動物的檢測：檢測某一基因的遺傳穩(wěn)定性。 轉(zhuǎn)基因植物的檢測：玉米、大豆等。轉(zhuǎn)基因植物的檢測：玉米、大豆等。 Human HMGB1 P09429 Mouse HMGB1 P63158 Chick HMGB1 Q9PUK9 Frog HMGB1 Q7SZ42

43、Human HMGB2 P26583 Mouse HMGB2 P30681 Chick HMGB2 P26584 Frog HMGB2 Q32NS7 Human HMGB3 O15347 Mouse HMGB3 O54879 Chick HMGB3 P40618 Frog HMGB3 O54879 Lj HMGB1 HQ615991 Amphi HMG1/2 Q6PUE4 Sea urchin HMG1 P40644 99 81 99 99 98 97 99 89 88 94 92 56 0.000.050.100.150.200.250.300.35 物種進(jìn)化圖物種進(jìn)化圖 7/22/2021

44、94 1 1、要求將下面基因片段克隆至表達(dá)載體要求將下面基因片段克隆至表達(dá)載體pET-28apET-28a相應(yīng)位點(diǎn)上，并獲得此基因的表達(dá)。相應(yīng)位點(diǎn)上，并獲得此基因的表達(dá)。 ATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG GAATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG GAC CAT GGC CAT GGT TGG TAT TTA GCT T TGG TAT TTA GCT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TT

45、T TCA GCA TTA GCT AGA TAT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TTT TCA GCA TTA GCT AGA TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CA

46、T C TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CAT CAA GCT TAA GCT TAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGAAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT AAA ACA GGA AAA TCA ATA TAC TAT AGT TAA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT AAA ACA GGA AAA TCA ATA TAC