大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選課件

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、 重組重組DNA的轉(zhuǎn)化、克隆篩選的轉(zhuǎn)化、克隆篩選 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 2 1. 實驗?zāi)康暮鸵髮嶒災(zāi)康暮鸵?通過本實驗學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿通過本實驗學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受轉(zhuǎn)入受 體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技 術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子 生物學(xué)研究中的意義。生物學(xué)研究中的意義。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆

2、篩選 3 2. 相關(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells): 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl， RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的 通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源 D N A 的 載 體 分 子 通 過 的 感 受 態(tài) 細(xì) 胞的 載 體 分 子 通 過 的 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 (competent cell) 。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 4 轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation）： 是將異源是將異源DNA分子

3、引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì) 胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程 等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。 進(jìn)入細(xì)胞的進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實現(xiàn)分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實現(xiàn) 遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性 狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修 飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和 甲基化酶的突變株。甲基化酶的突變株。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選

4、 5 轉(zhuǎn)化的方法：轉(zhuǎn)化的方法： 化學(xué)的方法化學(xué)的方法(熱擊法熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如；使用化學(xué)試劑（如 CaCl）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處 理將載體理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；分子導(dǎo)入受體細(xì)胞； 1. 電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的 感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 6 克隆的篩選：克隆的篩選： 主要用不同抗生素基因篩選。常用的主要用不同抗生素基因篩選。常用的 抗生素有：氨芐青霉

5、素、卡那霉素、抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等； 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 7 將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有 異源異源DNA分子的受體細(xì)胞。否則，如果將分子的受體細(xì)胞。否則，如果將 轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng) 基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細(xì)菌菌落，基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細(xì)菌菌落， 將難以確認(rèn)哪一個克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。將難以確認(rèn)哪一個克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。

6、雖然只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌才能雖然只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌才能 在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對 于連接混合物而言，此時并不能確定哪個于連接混合物而言，此時并不能確定哪個 克隆含有插入片段?？寺『胁迦肫?。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 8 重組質(zhì)?？寺〉蔫b定重組質(zhì)?？寺〉蔫b定 鑒定帶有重組質(zhì)?？寺〉姆椒ǔＳ玫挠需b定帶有重組質(zhì)?？寺〉姆椒ǔＳ玫挠?- 互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)?；パa(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、進(jìn)行酶切分析、 插入失活、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。最以及雜交篩選的方法。最 常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)

7、粒常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶進(jìn)行酶 切分析，對于帶有切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以基因的載體還可以 結(jié)合結(jié)合 -互補(bǔ)現(xiàn)象來篩選?；パa(bǔ)現(xiàn)象來篩選。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 9 -互補(bǔ)現(xiàn)象：互補(bǔ)現(xiàn)象： 因為許多載體都帶有一個因為許多載體都帶有一個LacLacZ Z基因的調(diào)控序基因的調(diào)控序 列和頭列和頭146146個氨基酸的編碼信息，編碼個氨基酸的編碼信息，編碼 - -互補(bǔ)互補(bǔ) 肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型 - -半乳糖半乳糖 苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（ -互補(bǔ)互補(bǔ)）。）。當(dāng)這種載當(dāng)這種載 體轉(zhuǎn)入可編碼體

8、轉(zhuǎn)入可編碼 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部分序列的端部分序列的 宿主細(xì)胞中時，在異丙基宿主細(xì)胞中時，在異丙基- - -D-D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 （IPTGIPTG）的誘導(dǎo)下，）的誘導(dǎo)下，宿主可同時合成這兩種宿主可同時合成這兩種 肽段，肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們雖然它們各自都沒有酶活性，但它們 可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所 以稱這種現(xiàn)象為以稱這種現(xiàn)象為 - -互補(bǔ)現(xiàn)象?；パa(bǔ)現(xiàn)象。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 10 由互補(bǔ)產(chǎn)生的由互補(bǔ)產(chǎn)生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ)Z)能夠作能夠作 用于生色

9、底物用于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所 以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列 之間人工放入一個多克隆位點，當(dāng)插入一個之間人工放入一個多克隆位點，當(dāng)插入一個 外源外源DNADNA片段時，會造成片段時，會造成LacLacZ(Z( ) )基因的失活，基因的失活， 破壞破壞 -互補(bǔ)作用，互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。就不能產(chǎn)生具有活性的酶。 所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重 組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色

10、。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 11 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 12 重組重組DNADNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過轉(zhuǎn)化細(xì)菌過 程示意圖程示意圖 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 13 3儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑 無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心 機(jī)，移液器，微型離心管等；機(jī)，移液器，微型離心管等； 菌株：菌株：E.coliE.coli DH5 DH5 質(zhì)粒：質(zhì)粒：pBluscript KS+DNA 片段的質(zhì)粒以及片段的質(zhì)粒以及 pBluscript KS 空質(zhì)粒；空質(zhì)粒； LBLB

11、培養(yǎng)基；含抗菌素的培養(yǎng)基；含抗菌素的LBLB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉平板培養(yǎng)基（氨芐青霉 素，濃度素，濃度50-10050-100g gmLmL，X-gal 20-48X-gal 20-48g/ml, g/ml, IPTG 100 IPTG 100 g/mlg/ml。一般將抗生素、。一般將抗生素、X-galX-gal和和IPTGIPTG 配制成配制成10001000 儲備液，用時按培養(yǎng)基的量再加儲備液，用時按培養(yǎng)基的量再加 入入）；）； 預(yù)冷預(yù)冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol0.1molL L） 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 14 4操作步驟操作步驟 1）大腸

12、桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法法) （1）從新活化的）從新活化的E.coli DH5菌平板上挑取菌平板上挑取 一單菌落，接種于一單菌落，接種于35ml LB液體培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)中， 37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。左右，直至對數(shù)生長期。 將該菌懸液以將該菌懸液以1:1001:50轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)接于100ml LB液液 體培養(yǎng)基中，體培養(yǎng)基中，37振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液 開始出現(xiàn)混濁后，每隔開始出現(xiàn)混濁后，每隔2030min測一次測一次 OD600nm，至，至OD600nm0.5時停止培養(yǎng)；時停止培養(yǎng)； 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組

13、DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 15 （2）每組取培養(yǎng)液）每組取培養(yǎng)液3個個2ml轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入2ml離心管離心管 中，在冰上冷卻中，在冰上冷卻20-30min，于，于4，4000r min離心離心10min（從這一步開始，所有（從這一步開始，所有 操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）；操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）； （3）倒凈上清培養(yǎng)液，用）倒凈上清培養(yǎng)液，用1ml冰冷的冰冷的 0.1mo1L CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰 浴；??； 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 16 （4）04，4000rmin離心離心10min； （5）棄去上清液，加入）棄去上清液，加入5

14、00l冰冷的冰冷的0.1mo1 L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞。溶液，小心懸浮細(xì)胞。04，4000r min離心離心10min； （6）棄去上清液，加入）棄去上清液，加入100l冰冷的冰冷的0.1mo1 L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻 后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液； （7）制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)）制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn) 化實驗，也可加入占總體積化實驗，也可加入占總體積15左右高壓滅菌左右高壓滅菌 過的甘油，混勻后分裝于過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置離心管中，置 于于-70條件下，可

15、保存半年至一年。條件下，可保存半年至一年。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 17 2）細(xì)胞轉(zhuǎn)化）細(xì)胞轉(zhuǎn)化 (1) 分別取分別取3個個100l感受態(tài)細(xì)胞懸液感受態(tài)細(xì)胞懸液(如是如是 冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的 操作操作)，第一組，加入，第一組，加入10 l重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒 DNA(體積不超過體積不超過10l)+ 100l感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞， 此管為轉(zhuǎn)化實驗組。第二組，插入此管為轉(zhuǎn)化實驗組。第二組，插入DNA片片 段對照組，即酶切后段對照組，即酶切后DNA片段片段25ng+100l 感受態(tài)細(xì)胞懸液；第三組，質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞懸液；第

16、三組，質(zhì)粒DNA對照對照 組，即組，即1ng 未酶切未酶切pBluescript 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA十十 100l感受態(tài)細(xì)胞懸液。感受態(tài)細(xì)胞懸液。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 18 (2) 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20- 30min，于，于42水浴中保溫水浴中保溫12min，然后，然后 迅速冰上冷卻迅速冰上冷卻2min (3) 立即向上述管中分別加入立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體液體 培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到 0.5ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖

17、勻后 于于37振蕩培養(yǎng)約振蕩培養(yǎng)約45-60min ，使受體菌恢復(fù)，使受體菌恢復(fù) 正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因 產(chǎn)物產(chǎn)物(Ampr)。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 19 3) 平板培養(yǎng)（有時需要稀釋）平板培養(yǎng)（有時需要稀釋） (1)取各樣品培養(yǎng)液取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于，分別接種于 含抗菌素含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻平板培養(yǎng)基上，涂勻 （如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過 后稍微涼一下再用，不要過燙）。后稍微涼一下再用，不要過燙）。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選

18、 20 (2) 菌液完全被培養(yǎng)基吸收后菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)皿， 于于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時小時)， 待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng)， 對于可以藍(lán)白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來說，此對于可以藍(lán)白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來說，此 時應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落。時應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落。 用用 CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克法制備的感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克 超螺旋質(zhì)粒超螺旋質(zhì)粒 DNA產(chǎn)生產(chǎn)生5 106-2 107個轉(zhuǎn)化菌個轉(zhuǎn)化菌 落。在實際工作中，每微克有落。在實際工作中，每微克有105以上的轉(zhuǎn)以上的轉(zhuǎn) 化菌落足以滿足一般的克隆實驗?；渥阋詽M足一般的克隆實驗。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備重組 DNA的轉(zhuǎn)化克隆篩選 21 4) 檢出轉(zhuǎn)化體和計算轉(zhuǎn)化率檢出轉(zhuǎn)化體和計算轉(zhuǎn)化率 統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實驗組統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實驗組 培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長狀況應(yīng)如表所示培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長狀