第4章第2講免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及在食品中的應(yīng)用

1、第第4章章 第第2講講 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及 在食品安全中的應(yīng)用在食品安全中的應(yīng)用 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù) 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) o 利用免疫學(xué)技術(shù)可以檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、利用免疫學(xué)技術(shù)可以檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、 寄生蟲(chóng)、各種毒素、蛋白寄生蟲(chóng)、各種毒素、蛋白 o 還可檢測(cè)激素、藥物殘留、抗生素及其他生還可檢測(cè)激素、藥物殘留、抗生素及其他生 理活性物質(zhì)理活性物質(zhì) 1酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)ELISA檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù) ELISA o 全稱(chēng)：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme- linked immuno sorben

2、t assay） p 將抗原抗體的特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié)將抗原抗體的特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié) 合，使得食品在未經(jīng)分離提取的前提下，即合，使得食品在未經(jīng)分離提取的前提下，即 能進(jìn)行定性或定量檢測(cè)能進(jìn)行定性或定量檢測(cè) p 廣泛用于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、各種廣泛用于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、各種 毒素等大分子蛋白，以及激素、農(nóng)獸藥殘留、毒素等大分子蛋白，以及激素、農(nóng)獸藥殘留、 抗生素能小分子物質(zhì)的檢測(cè)抗生素能小分子物質(zhì)的檢測(cè) 可檢測(cè)標(biāo)本類(lèi)型廣泛可檢測(cè)標(biāo)本類(lèi)型廣泛 體液：體液：血清、血漿、胸腹水、灌洗液、腦脊液血清、血漿、胸腹水、灌洗液、腦脊液 分泌物：分泌物：唾液唾液 排泄物：排泄物：尿液

3、、糞便等尿液、糞便等 細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞培養(yǎng)上清 組織勻漿組織勻漿 1.1 ELISA 的發(fā)展歷程的發(fā)展歷程 o 免疫酶標(biāo)記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分免疫酶標(biāo)記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分 析之后發(fā)展起來(lái)的一大新型的血清學(xué)技術(shù)。析之后發(fā)展起來(lái)的一大新型的血清學(xué)技術(shù)。 o 1966年，年，Nakane和和Avrameas等分別報(bào)道用酶等分別報(bào)道用酶 代替熒光素標(biāo)記抗體，建立了酶標(biāo)抗體技術(shù)用于生物代替熒光素標(biāo)記抗體，建立了酶標(biāo)抗體技術(shù)用于生物 組織中抗原的定位和鑒定。組織中抗原的定位和鑒定。 o 1971年，年，Engvall ，Van Weemen 等報(bào)道了酶等報(bào)道了酶 聯(lián)免疫吸

4、附試驗(yàn)，從而建立了酶標(biāo)抗體的定量檢測(cè)技聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，從而建立了酶標(biāo)抗體的定量檢測(cè)技 術(shù)術(shù) o 目前，免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測(cè)和分子目前，免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測(cè)和分子 生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。 ELISA板板 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 測(cè)吸光度測(cè)吸光度 ELISAELISA是一種是一種免疫免疫測(cè)定技術(shù)：基于抗原抗體反應(yīng)測(cè)定技術(shù)：基于抗原抗體反應(yīng) 酶聯(lián)酶聯(lián)：抗原或抗體的：抗原或抗體的酶標(biāo)記酶標(biāo)記 吸附吸附：抗原或抗體的：抗原或抗體的固相化固相化 測(cè)定測(cè)定：加入酶反應(yīng)的底物后，被酶催化成為加入酶反應(yīng)的底物后，被酶催化成為有色產(chǎn)物有色

5、產(chǎn)物，產(chǎn)物產(chǎn)物 的量的量與標(biāo)本中與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定直接相關(guān)，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定 1.2 解釋?zhuān)好嘎?lián)免疫吸附測(cè)定解釋?zhuān)好嘎?lián)免疫吸附測(cè)定 間接法間接法 夾心法夾心法 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法 捕獲法捕獲法 1.3 類(lèi)類(lèi) 型型 酶酶 抗抗抗抗 體體 酶標(biāo)記酶標(biāo)記 抗抗體抗抗體 抗體抗體 抗原抗原 固相載體固相載體 1.將抗原包被在固相載體上。將抗原包被在固相載體上。 2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合如樣品中含有抗體，則結(jié)合 為抗原抗體復(fù)合物。為抗原抗體復(fù)合物。 3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié) 合為抗原合為抗原-抗體抗體-酶標(biāo)記抗抗體酶標(biāo)記抗抗體 復(fù)合物

6、。復(fù)合物。 4.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色。 （1）間接法）間接法 間接法間接法測(cè)抗體測(cè)抗體 洗滌洗滌 洗滌洗滌 洗滌洗滌 待測(cè)抗體待測(cè)抗體 酶標(biāo)抗抗體酶標(biāo)抗抗體 病原體病原體抗體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷 （2）雙抗體夾心法雙抗體夾心法 固相載體固相載體 抗體抗體 抗原抗原 酶酶 抗體抗體 酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗體 1.將抗體包被在固相載體上。將抗體包被在固相載體上。 2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合如樣品中含有抗原，則結(jié)合 為抗原抗體復(fù)合物。為抗原抗體復(fù)合物。 3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合 為抗體為抗體-抗原抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合酶標(biāo)記抗體復(fù)

7、合 物。物。 4.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色。 夾心法夾心法測(cè)抗原測(cè)抗原 洗洗 滌滌 洗洗 滌滌 洗洗 滌滌 待測(cè)抗原待測(cè)抗原 在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原蛋白質(zhì)等大分子抗原， 例如例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP、hCGhCG等等 產(chǎn)品舉例產(chǎn)品舉例 o 氟苯尼考（氟苯尼考（FF）ELISA快速檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)試劑盒 （Green Spring ） o 可用于動(dòng)物組織（肌肉、肝臟）、尿液、血可用于動(dòng)物組織（肌肉、肝臟）、尿液、血 清、蜂蜜、腸衣、牛奶以及水產(chǎn)品等樣品中清、蜂蜜、腸衣、牛奶以及水產(chǎn)品等樣品

8、中 氟苯尼考藥物殘留的檢測(cè)。氟苯尼考藥物殘留的檢測(cè)。 o 人金黃色葡萄球菌腸毒素人金黃色葡萄球菌腸毒素(SE) ELISA 檢檢 測(cè)試劑盒測(cè)試劑盒 （3）酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法）酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法 固相載體固相載體 抗體抗體 抗原抗原 酶酶 酶標(biāo)記抗原酶標(biāo)記抗原 1.將抗體包被在固相載體上。將抗體包被在固相載體上。 2.如樣品中含有抗原，則優(yōu)先如樣品中含有抗原，則優(yōu)先 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，結(jié)合 為抗原抗體復(fù)合物。為抗原抗體復(fù)合物。 3.同時(shí)加入酶標(biāo)記抗原，抗原同時(shí)加入酶標(biāo)記抗原，抗原 沒(méi)有結(jié)合的位點(diǎn)酶標(biāo)記抗原沒(méi)有結(jié)合的位點(diǎn)酶標(biāo)記抗原 去占據(jù)，則結(jié)合為酶標(biāo)記抗去占據(jù)，則結(jié)合為酶標(biāo)記抗 原原-抗體

9、復(fù)合物?？贵w復(fù)合物。 4.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色。 抗原抗原 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)小分子抗原測(cè)小分子抗原 洗滌洗滌 洗滌洗滌 待測(cè)抗原待測(cè)抗原 酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原 小分子激素、藥物等小分子激素、藥物等ELISAELISA測(cè)定多用此法。測(cè)定多用此法。 4 捕獲法示意圖捕獲法示意圖 酶酶 抗體抗體 酶標(biāo)記酶標(biāo)記 抗體抗體 抗原抗原 抗抗體抗抗體 固相載體固相載體 抗體抗體 1.將抗抗體包被在固相載體上。 2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合 為抗抗體-抗體復(fù)合物。 3. 加入抗原及酶標(biāo)記抗體， 則結(jié)合為抗抗體-抗體-抗原- 酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。 4.酶催化底物并顯色。 固相抗固相抗IgM 特異特異IgM

10、 非特異非特異IgM 標(biāo)本標(biāo)本 特異抗原特異抗原 抗原特異酶標(biāo)抗體抗原特異酶標(biāo)抗體 底物底物 此法常用于病毒性感染的早期診斷。此法常用于病毒性感染的早期診斷。 捕獲法捕獲法 1.4 操作流程操作流程 o 將抗原或抗體固定在固相載體上的過(guò)程稱(chēng)為包將抗原或抗體固定在固相載體上的過(guò)程稱(chēng)為包 被被(coating)(coating)。 o 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附物理吸附結(jié)結(jié) 合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與 固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。 o 大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含

11、有更多的大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的 疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。 （1 1） 包被包被 包被的條件包被的條件 pH9.6 pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液 pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL緩沖液。緩沖液。 o 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置過(guò)夜，冰箱中放置過(guò)夜， 3737中保溫中保溫2 2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的 性質(zhì)可有很大的變化，性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶 結(jié)合

12、物的濃度協(xié)調(diào)選定。結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度一般蛋白質(zhì)的包被濃度 為為10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。 （2 2）封）封 閉閉 o 封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋 白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)大量不相關(guān) 的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISAELISA后的步后的步 驟中干擾物質(zhì)的再吸附。驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 o 常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%B

13、SA; 10%的小牛血清的小牛血清 或或1%1%明膠明膠; ;脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用比較價(jià)廉，可以高濃度使用 （5%5%）。）。 o 所有的所有的ELISAELISA固相均需封閉。固相均需封閉。 （3 3）加樣）加樣 o 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚次加樣步聚 o 即加樣本，加酶結(jié)合物，加底物。即加樣本，加酶結(jié)合物，加底物。 o 加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免板孔的底部，避免 加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣 泡。泡。 （4 4）保）保 溫溫 o 抗

14、原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育 o 應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。 為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多 于兩塊板同時(shí)測(cè)定。于兩塊板同時(shí)測(cè)定。 （5 5）洗滌）洗滌 o 洗滌在洗滌在ELISAELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定 著實(shí)驗(yàn)的成敗。著實(shí)驗(yàn)的成敗。 o ELSIAELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。 o 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的清

15、除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的 干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的， 而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下 來(lái)。來(lái)。 o 可以說(shuō)在可以說(shuō)在ELISAELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。 (6)(6)顯色顯色 o 顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫 育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的 因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，因素。在一定時(shí)間

16、內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色， 而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng) 提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。 酶酶 o 在在ELISAELISA中，可以采用的有中，可以采用的有HRPHRP，APAP，葡萄糖，葡萄糖 氧化酶，氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。 o HRPHRP（辣根過(guò)氧化物酶）（辣根過(guò)氧化物酶）是一種糖蛋白，含糖是一種糖蛋白，含糖 量約為量約為18%18%，分子量為，分子量為4400044000，是一種復(fù)合酶，是一種復(fù)合酶， 由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié) 合

17、而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 底物底物 o HRPHRP的底物的底物 o DH2+ H2O2 D+ 2H2O o DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色 的產(chǎn)物。的產(chǎn)物。 o DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺、四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)等。等。 o OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色橙紅色，用酸終止酶反，用酸終止酶反 應(yīng)后，在應(yīng)后，在492nm492nm處有最高吸收峰，靈敏度高處有最高吸收峰，靈敏度高 o TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色藍(lán)色。TMBTMB性質(zhì)較性質(zhì)較 穩(wěn)定

18、，可配成溶液試劑，只需與穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液溶液 混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMBTMB產(chǎn)物產(chǎn)物 由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適 吸收波長(zhǎng)為吸收波長(zhǎng)為450nm450nm。 1.5ELISA 影響因素影響因素 固相載體：固相載體：ELISA ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。 抗原：可溶性、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高?？乖嚎扇苄?、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。 試驗(yàn)樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為試

19、驗(yàn)樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為 ELISA ELISA 的試驗(yàn)樣品。的試驗(yàn)樣品。 結(jié)合物：酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，結(jié)合物：酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性， 產(chǎn)量高及成本低。產(chǎn)量高及成本低。 底物：各種酶都有對(duì)底物的底物：各種酶都有對(duì)底物的特異性特異性，不同種類(lèi)的酶要求有不同的底物。，不同種類(lèi)的酶要求有不同的底物。 作用時(shí)間：加底物后終止時(shí)間？作用時(shí)間：加底物后終止時(shí)間？ 結(jié)果判斷結(jié)果判斷:ELISA :ELISA 的試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷，的試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷， 也可用也可用分光光度計(jì)分

20、光光度計(jì)作精確測(cè)定。作精確測(cè)定。 試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度）試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度） ：通常用：通常用變異系數(shù)變異系數(shù)來(lái)表示。來(lái)表示。 思考：如何研發(fā)商品化的思考：如何研發(fā)商品化的 ELISA試劑盒？試劑盒？ 需要什么原料，得到哪些組分，需要什么原料，得到哪些組分， 摸清哪些條件，才能夠進(jìn)行組摸清哪些條件，才能夠進(jìn)行組 裝？裝？ 2 2免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) （膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)、膠體金層析）（膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)、膠體金層析） 大腸桿菌大腸桿菌O157:H7快速檢測(cè)快速檢測(cè) 試紙（膠體金）試紙（膠體金） 2.1 2.1 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 介介 膠體金試紙條診斷是采用膠體金免疫層膠體金試紙條診斷是采用膠

21、體金免疫層 析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是9090年代初在免疫年代初在免疫 滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免 疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激 素（素（HCGHCG）的測(cè)定和乙型肝炎病毒表面抗原的測(cè)定和乙型肝炎病毒表面抗原 （HBsAgHBsAg）等檢測(cè)。等檢測(cè)。 p膠體金膠體金（Colloidal goldColloidal gold）是氯金酸是氯金酸 （HAuClHAuCl4 4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作的水溶膠，氯金酸在還原劑的作 用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜用下，聚合

22、成特定大小的金顆粒，并由于靜 電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。故稱(chēng)膠體電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。故稱(chēng)膠體 金金 用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、 也就是不同顏色的膠體金顆粒也就是不同顏色的膠體金顆粒 質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球 形，大小均一，無(wú)棱角。形，大小均一，無(wú)棱角。 質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀 各異。各異。 膠體金的質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)膠體金的質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn) p膠體金標(biāo)記的原理：膠體金標(biāo)記的原理： p膠體金在堿性條件下帶負(fù)電荷

23、，與蛋白質(zhì)分膠體金在堿性條件下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)分 子的正電荷基團(tuán)靜電吸引而形成牢固結(jié)合。子的正電荷基團(tuán)靜電吸引而形成牢固結(jié)合。 p膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸 附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。 p標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅 色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中 2.22.2膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理 以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜以硝酸纖維素膜為載體，利用

24、了微孔膜 的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢 慢向另一端滲移，通過(guò)抗原抗體結(jié)合，并利慢向另一端滲移，通過(guò)抗原抗體結(jié)合，并利 用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測(cè)抗原用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測(cè)抗原/ / 抗體?？贵w。 檢測(cè)線檢測(cè)線 質(zhì)控線質(zhì)控線 吸收墊吸收墊 樣品墊樣品墊 硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜 膠體金墊膠體金墊 背襯背襯 （底板）（底板） 膠體金試紙條示意圖膠體金試紙條示意圖 2.3 分類(lèi)分類(lèi) o 間接法間接法-測(cè)抗體測(cè)抗體 o 雙抗夾心法雙抗夾心法-測(cè)大分子抗原測(cè)大分子抗原 -食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè) o 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法-測(cè)小分

25、子抗原測(cè)小分子抗原 -食品中瘦肉精、黃曲霉毒素的檢測(cè)食品中瘦肉精、黃曲霉毒素的檢測(cè) 沙門(mén)氏菌單克隆抗體沙門(mén)氏菌單克隆抗體 可能含有可能含有 沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌 的樣品的樣品 （1）雙抗夾心法檢測(cè)抗原）雙抗夾心法檢測(cè)抗原測(cè)大分子抗原測(cè)大分子抗原 沙門(mén)氏菌多沙門(mén)氏菌多 克隆抗體克隆抗體 抗抗體抗抗體 （2）思考）思考 o競(jìng)爭(zhēng)法的原理？競(jìng)爭(zhēng)法的原理？ o檢測(cè)線噴的是純化的抗原，與待檢測(cè)線噴的是純化的抗原，與待 檢測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng) o這種情況下的結(jié)果判定？這種情況下的結(jié)果判定？ 2.4 2.4 膠體金快速診斷技術(shù)的特點(diǎn)膠體金快速診斷技術(shù)的特點(diǎn) p簡(jiǎn)捷快速：簡(jiǎn)捷快速：操作簡(jiǎn)單，一般只要操作簡(jiǎn)單，一般

26、只要5 5-10min -10min 就會(huì)就會(huì) 出結(jié)果，而其它方法如出結(jié)果，而其它方法如ELISAELISA需要需要1 1-2h-2h，PCR PCR 需要時(shí)間更長(zhǎng)。需要時(shí)間更長(zhǎng)。 p結(jié)果易于判定：結(jié)果易于判定：陰、陽(yáng)性呈色很明顯，肉眼很陰、陽(yáng)性呈色很明顯，肉眼很 容易判斷。容易判斷。 p特異性好：特異性好：因?yàn)樵摷夹g(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，因?yàn)樵摷夹g(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記， 這決定了它具有很好的特異性。這決定了它具有很好的特異性。 2.5 技術(shù)分項(xiàng)技術(shù)分項(xiàng) 樣品墊樣品墊 吸水墊吸水墊 粘性底板粘性底板 NCNC膜膜 膠體金墊膠體金墊 干燥方法干燥方法 抗原抗體生物原料抗原抗體生物原料 膠體金制備

27、膠體金制備 標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù) 溶液噴點(diǎn)溶液噴點(diǎn) 溶液體系分析溶液體系分析 裝配裝配 切條切條 包裝包裝 （1）金標(biāo)墊與樣品墊的處理）金標(biāo)墊與樣品墊的處理 o 1，金標(biāo)墊裁剪成長(zhǎng)，金標(biāo)墊裁剪成長(zhǎng)10，寬，寬8長(zhǎng)條長(zhǎng)條 o 2，樣品墊裁剪成長(zhǎng)，樣品墊裁剪成長(zhǎng)30，寬，寬2.5長(zhǎng)條長(zhǎng)條 o 3，將裁剪好的金標(biāo)墊與樣品墊，分別用金標(biāo)墊，將裁剪好的金標(biāo)墊與樣品墊，分別用金標(biāo)墊 處理液與樣品墊處理液浸潤(rùn)，放入處理液與樣品墊處理液浸潤(rùn)，放入37溫箱中烘溫箱中烘 干儲(chǔ)存在干燥器中置干儲(chǔ)存在干燥器中置4冷庫(kù)中備用。冷庫(kù)中備用。 抗體抗體 Antibody 來(lái)源差異來(lái)源差異: 鼠抗鼠抗,兔抗和羊抗兔抗和羊抗 種類(lèi)

28、差異種類(lèi)差異: 單抗單抗,多抗多抗 腹水的處理腹水的處理: 飽和硫酸銨沉淀法飽和硫酸銨沉淀法 特異性特異性:親和層析柱親和層析柱 濃度濃度: 濃縮濃縮 溶解液溶解液:不含鹽不含鹽,例如例如PB （2）抗原抗體生物原料）抗原抗體生物原料 抗原抗原 Antigen 偶聯(lián)抗原物質(zhì)偶聯(lián)抗原物質(zhì): BSA, OVA等等 毒品檢測(cè)來(lái)源毒品檢測(cè)來(lái)源: 合成抗原合成抗原 （3）標(biāo)記技術(shù)）標(biāo)記技術(shù) Conjugate 容器硅化處理容器硅化處理 金顆粒制備金顆粒制備 (負(fù)電負(fù)電) 顏色與顆粒的關(guān)系顏色與顆粒的關(guān)系. 最佳標(biāo)記顆粒大小最佳標(biāo)記顆粒大小40nm. 蛋白質(zhì)最適用量測(cè)定蛋白質(zhì)最適用量測(cè)定:鹽析法鹽析法 （

29、4）膠體金制作流程 1，向硅化過(guò)的三角瓶中加入向硅化過(guò)的三角瓶中加入100ml去離子水，再加入去離子水，再加入1ml濃度濃度 為為1%的氯金酸的氯金酸 2,將三角瓶放入微波爐中加熱，沸騰時(shí)取出，一次性迅速加將三角瓶放入微波爐中加熱，沸騰時(shí)取出，一次性迅速加 入入1850l濃度濃度1%檸檬酸三鈉，搖動(dòng)約檸檬酸三鈉，搖動(dòng)約20s（檸檬酸三鈉經(jīng)（檸檬酸三鈉經(jīng)0.22濾濾 膜過(guò)濾）膜過(guò)濾） 3,再將三角瓶放入微波爐中大火再將三角瓶放入微波爐中大火1分鐘，調(diào)中火繼續(xù)加熱五分分鐘，調(diào)中火繼續(xù)加熱五分 鐘。鐘。 4，拿出來(lái)冷卻，待溫度降至室溫時(shí)用去離子水補(bǔ)足到，拿出來(lái)冷卻，待溫度降至室溫時(shí)用去離子水補(bǔ)足到1

30、00ml, 用用0.1M的碳酸鉀調(diào)節(jié)的碳酸鉀調(diào)節(jié)PH至略高于待標(biāo)記蛋白的等電點(diǎn)，至略高于待標(biāo)記蛋白的等電點(diǎn)，0.22過(guò)過(guò) 濾轉(zhuǎn)移至硅化過(guò)的平底藍(lán)蓋瓶中。濾轉(zhuǎn)移至硅化過(guò)的平底藍(lán)蓋瓶中。 5，藍(lán)蓋瓶中放入攪拌子，攪拌，向金溶液中加入蛋，藍(lán)蓋瓶中放入攪拌子，攪拌，向金溶液中加入蛋 白白,標(biāo)記量為標(biāo)記量為2g/ml，緩慢加入標(biāo)記蛋白。，緩慢加入標(biāo)記蛋白。 6,攪拌攪拌,半小時(shí)后加入濃度為半小時(shí)后加入濃度為10%的的BSA至終濃度為至終濃度為 0.2%，繼續(xù)攪拌一小時(shí)。，繼續(xù)攪拌一小時(shí)。 7，將標(biāo)記好的溶液轉(zhuǎn)至，將標(biāo)記好的溶液轉(zhuǎn)至50ml離心管中，離心管中， 3500rpm/min，4離心離心30min.棄去沉淀，收集上棄去沉淀，收集上