流式細(xì)胞儀-上課-2014

1、2021-7-261 流式細(xì)胞儀 沈素芹沈素芹 2021-7-262 流式細(xì)胞儀概況 工作原理及數(shù)據(jù)分析 DNA分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) T淋巴細(xì)胞亞群分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) 流式細(xì)胞儀的其他應(yīng)用 主要內(nèi)容 2021-7-263 什么是流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀實(shí)物 BD-Calibur Beckman-Coulter Gallios 2021-7-264 BC MoFlo XDP 對比 流式細(xì)胞儀是一種特殊的顯微鏡 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 顯微鏡顯微鏡 流動的細(xì)胞流動的細(xì)胞 靜止的細(xì)胞樣本靜止的細(xì)胞樣本 數(shù)量大數(shù)量大 數(shù)量少數(shù)量少 高速分選高速分選 樣本難以再利用樣本難以

2、再利用 細(xì)胞群體特征量分布細(xì)胞群體特征量分布 可以揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息可以揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 蛋白膠蛋白膠 多參數(shù)多參數(shù) 單參數(shù)單參數(shù) 量化的分布量化的分布 平均值平均值 容易檢測各個參數(shù)間的相關(guān)性容易檢測各個參數(shù)間的相關(guān)性 不容易不容易 2021-7-267 流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的特點(diǎn) =單個細(xì)胞分析單個細(xì)胞分析 =同時多參數(shù)分析同時多參數(shù)分析 =速度快：速度快：70000個細(xì)胞個細(xì)胞/秒秒 =統(tǒng)計學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的統(tǒng)計學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的 均值和分布情況均值和分布情況 =分選感興趣的細(xì)胞分選感興趣的細(xì)胞 原子 0.1nm 1nm10nm 100nm 1m

3、10m 100m 1mm 氨基 酸 蛋白 質(zhì) 病毒支原體細(xì)菌紅細(xì)胞 上皮細(xì)胞 植物細(xì)胞 電鏡 光學(xué) 顯微鏡 人眼極限 當(dāng)前流式細(xì)胞儀可測量顆粒大小 最小約0.2m 測量對象：顆粒尺度 （單細(xì)胞懸浮液） 流式細(xì)胞儀的測量對象流式細(xì)胞儀的測量對象 大小大小 懸浮在溶液中的相互離散顆粒。懸浮在溶液中的相互離散顆粒。 大小范圍：大小范圍：0.2uM-300uM0.2uM-300uM。 對象類型對象類型 細(xì)胞類型：細(xì)胞類型： （1 1）高等真核細(xì)胞；）高等真核細(xì)胞； （2 2）酵母；）酵母； （3 3）細(xì)菌；）細(xì)菌； （4 4）多細(xì)胞的聚集體，如胰島等。）多細(xì)胞的聚集體，如胰島等。 非生命顆粒：非生命顆

4、粒： 細(xì)胞核、染色體、和其它細(xì)胞器以及乳化微球等。細(xì)胞核、染色體、和其它細(xì)胞器以及乳化微球等。 2021-7-2610 細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu) =細(xì)胞大小細(xì)胞大小 =細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度 =細(xì)胞表面面積細(xì)胞表面面積 =核漿比例核漿比例 =DNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期 =RNA含量含量 =蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量 =染色體分析染色體分析 細(xì)胞功能細(xì)胞功能 =細(xì)胞表面細(xì)胞表面/胞漿胞漿/核的核的 特異性抗原特異性抗原 =細(xì)胞活性細(xì)胞活性 =細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 =酶活性酶活性 =激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn) =細(xì)胞受體細(xì)胞受體 =細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 在上述信號基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選在上述信號基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選

5、流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用 2021-7-2611 1980.1以前： 142 1980.11990.1: 9450 1990.12000.1: 33459 2000.12005.1: 28850 2005.12010.1: 37304 2010.12014.10.21: 46813 美國國立生物技術(shù)信息中心美國國立生物技術(shù)信息中心 / PUBMED 查詢：檢索關(guān)鍵詞：查詢：檢索關(guān)鍵詞： flow cytometry 結(jié)果：結(jié)果： NCBI科技文獻(xiàn)統(tǒng)計 HIV感染與病程動態(tài)監(jiān)測感染與病程動態(tài)監(jiān)測：輔助T淋巴細(xì)胞的絕對計數(shù)；

6、癌癥動態(tài)及治療方案癌癥動態(tài)及治療方案：細(xì)胞DNA含量和增殖活性； 器官移植器官移植：交叉配型； 分選人類染色體分選人類染色體，建立遺傳文庫（genetic libraries）； 動物育種的性別選擇動物育種的性別選擇：分選含x或y染色體的精子； 人類體外受精人類體外受精； 造血干細(xì)胞和其他一大類干細(xì)胞各個分化層次鑒別造血干細(xì)胞和其他一大類干細(xì)胞各個分化層次鑒別； 海洋、環(huán)境微生物研究，發(fā)現(xiàn)未知種屬海洋、環(huán)境微生物研究，發(fā)現(xiàn)未知種屬。 幾個著名的實(shí)際應(yīng)用：幾個著名的實(shí)際應(yīng)用： 2021-7-2613 流式細(xì)胞儀概況 工作原理及數(shù)據(jù)分析 DNA分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) T淋巴細(xì)胞亞群分

7、析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) 流式細(xì)胞儀的其他應(yīng)用 主要內(nèi)容 + + Surface Phenotyping + + Intracellular HOW? 2021-7-2615 將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一 定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細(xì)胞的定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細(xì)胞的 磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管 入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣， 鞘液鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個 圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的

8、包被下單行圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行 排列，依次通過檢測區(qū)域。排列，依次通過檢測區(qū)域。 工作原理工作原理 2021-7-2616 流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過 聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上， 被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下,產(chǎn)生產(chǎn)生 散射光散射光和和激發(fā)熒光激發(fā)熒光。這兩種信號分別被前向。這兩種信號分別被前向 光電二極管和光電二極管和90方向的光電倍增管接收。方向的光電倍增管接收。 光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測；熒光信號光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測；熒光信

9、號 的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色 性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不 同波長的熒光信號。同波長的熒光信號。 工作原理工作原理 2021-7-2617 =散射光信號散射光信號 =熒光信號熒光信號 流式細(xì)胞儀的光信號流式細(xì)胞儀的光信號 2021-7-2618 1. 散射光信號散射光信號 前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter） 入射激光的前向散射光信號，與細(xì)胞相對大小及入射激光的前向散射光信號，與細(xì)胞相對大小及 其表面積正相關(guān)其表面積正相關(guān) ，

10、確切地說，它與細(xì)胞直徑的平，確切地說，它與細(xì)胞直徑的平 方值密切相關(guān)。通常在方值密切相關(guān)。通常在FCMFCM應(yīng)用中，選取應(yīng)用中，選取FSCFSC作閾值，作閾值， 來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避 免對被測細(xì)胞的干擾。免對被測細(xì)胞的干擾。 前向散色光前向散色光FSCFSC 2021-7-2620 1. 散射光信號散射光信號 側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter） 入射激光入射激光9090 角的角的散射光信號，側(cè)向散射光對細(xì)散射光信號，側(cè)向散射光對細(xì) 胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感

11、，可提供有關(guān)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān) 細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。與細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。與細(xì)胞粒度及 細(xì)胞內(nèi)相對細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性正相復(fù)雜性正相 關(guān)。關(guān)。 側(cè)向散色光側(cè)向散色光SSCSSC 2021-7-2622 外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖 （紅細(xì)胞溶解后）（紅細(xì)胞溶解后） 10 to 14 m 15 to 20 m 8 to 10 m 2021-7-2623 2 .熒光信號熒光信號 =熒光素與特異抗體結(jié)合熒光素與特異抗體結(jié)合 =熒光素吸收激光能量熒光素吸收激光能量 =熒光素將吸收能量釋放，釋放較入射光波長更熒光素將吸收

12、能量釋放，釋放較入射光波長更 長的光量子即檢測的長的光量子即檢測的 發(fā)射波長發(fā)射波長 =熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信 號越強(qiáng)號越強(qiáng) =有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來 （陰陽）（陰陽） =高高FL細(xì)胞與低細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱） =多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量 FL-A FL-H FL-W 面積（面積（A A）：熒光總量）：熒光總量 高度（高度（H H）：最大熒光強(qiáng)度）：最大熒光強(qiáng)度 寬度（寬度（W W）：細(xì)胞直徑）：細(xì)胞直

13、徑 PMT：光信號到電脈沖信號 高靈敏度高靈敏度 50MESF50MESF 線性放大器線性放大器 對數(shù)放大器對數(shù)放大器 熒光測量熒光測量 流式細(xì)胞儀測定的結(jié)果 百分比百分比 目標(biāo)細(xì)胞占選定細(xì)胞群或所有細(xì)胞的比例目標(biāo)細(xì)胞占選定細(xì)胞群或所有細(xì)胞的比例 絕對濃度絕對濃度 目標(biāo)細(xì)胞在樣本中的濃度（目標(biāo)細(xì)胞在樣本中的濃度（cells/ul) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度與被檢測物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時與被檢測物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時 一般用該值。一般用該值。 變異系數(shù)變異系數(shù) 所有目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)某一個蛋白的離散程度所有目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)某一個蛋白的離散程度 Histogram plotOverlay plot

14、數(shù)據(jù)分析：流式報告中常見的幾種流式細(xì)胞圖數(shù)據(jù)分析：流式報告中常見的幾種流式細(xì)胞圖 圖中0 100為陰性細(xì)胞， 100以上的（B）為陽性細(xì)胞 2021-7-2628 Contour plot Density plotColor dot plot 2021-7-2629 PRISM濃縮柱形圖濃縮柱形圖Tomogram 2021-7-2630 細(xì)胞分類細(xì)胞分類-門的選擇門的選擇 2021-7-2631 流式細(xì)胞儀概況 流式細(xì)胞儀的工作原理及數(shù)據(jù)分析 DNA分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) T淋巴細(xì)胞亞群分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) 流式細(xì)胞儀的其他應(yīng)用 主要內(nèi)容 2021-7-2632

15、G1 S phase G2 M G1 12 1 DNA含量含量 G1 M G2 S G0 靜止細(xì)胞靜止細(xì)胞 The Cell Cycle 理論基礎(chǔ)理論基礎(chǔ) Propidium Iodide N熒光染料PI（碘化丙啶）是一 種可對雙鏈DNA染色的細(xì)胞核 染色試劑， PI-DNA復(fù)合物的 激發(fā)和發(fā)射波長分別為535 nm 和615 nm. DNA含量含量 G1SG2 M 細(xì)胞數(shù)目細(xì)胞數(shù)目 2021-7-2635 典型的細(xì)胞周期結(jié)果圖典型的細(xì)胞周期結(jié)果圖 G1SG2 Example 1: Compare cycles Day 1 Day 3 生物學(xué)應(yīng)用生物學(xué)應(yīng)用 G1SG2 Example 2: S

16、 phase block T0 T24 G1SG2 Example 3: G2 block T0 T24 Fluorescent protein+DNA: Assessment of cell cycle Hoechst 33342 Green Fluorescent Protein G1S G2/M 2021-7-2640 動物細(xì)胞倍體相關(guān)基因的研究動物細(xì)胞倍體相關(guān)基因的研究 2021-7-2641 細(xì)胞同步化的檢測細(xì)胞同步化的檢測 植物細(xì)胞DNA倍體檢測 2021-7-2642 100101102103104 FL2-H Marker % Gated All100.00 M15.01 M2

17、9.90 M320.25 M43.71 腫瘤診斷腫瘤診斷 DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標(biāo)志異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標(biāo)志 細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生 物學(xué)特征物學(xué)特征 利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA 倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前 病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷。病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷。 2倍體倍體 異倍體異倍體 4倍體倍體 腫瘤組織中的各種腫瘤組織中的各種DNA倍體倍體 實(shí)驗(yàn)步驟 1. 取對數(shù)期生長細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化細(xì)胞，用培

18、取對數(shù)期生長細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化細(xì)胞，用培 養(yǎng)液吹打，養(yǎng)液吹打，1000rpm，離心，離心5min棄上清；棄上清； 2. PBS洗洗2次，加次，加1ml吹勻，務(wù)必吹散；吹勻，務(wù)必吹散； 3. 加入加入70%預(yù)冷乙醇中（標(biāo)準(zhǔn)做法是將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷預(yù)冷乙醇中（標(biāo)準(zhǔn)做法是將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷70酒酒 精），固定時可加入精），固定時可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口以增加膜的通透性）封口膜封口 ，4固定固定1-2h或過夜（可長至一個月）；或過夜（可長至一個月）； 4. 1000rpm5min離心收集細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，PBS洗兩次；洗兩次； 5. 用用0.4mlPBS

19、重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中輕輕吹打；重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中輕輕吹打； 6. 加入加入Rnase-A約約3ul至終濃度至終濃度50ug/ml，37水浴消化水浴消化30min； 7. 加入加入PI約約50ul至終濃度約為至終濃度約為5-50ug/ml，室溫避光染色，室溫避光染色10min； 8. 用用300目濾網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測。目濾網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測。 2021-7-2646 R1 Ungated Gated Doublets Removal of cell clumps 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 2021-7-2648 流式細(xì)胞儀概況 流式細(xì)胞儀的工作原理及數(shù)據(jù)分析 DNA分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意

20、事項(xiàng) T淋巴細(xì)胞亞群分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) 流式細(xì)胞儀的其他應(yīng)用 主要內(nèi)容 細(xì)胞免疫功能檢測細(xì)胞免疫功能檢測 T T細(xì)胞亞群、細(xì)胞亞群、 B B細(xì)胞、細(xì)胞、 NKNK細(xì)胞細(xì)胞 檢測原理檢測原理 不同功能的免疫細(xì)胞表面表達(dá)不同種類不同功能的免疫細(xì)胞表面表達(dá)不同種類 的特征性分子的特征性分子 細(xì)胞表面分化族細(xì)胞表面分化族 ( (cluster differentiation, CD)cluster differentiation, CD) 細(xì)胞表面分化族細(xì)胞表面分化族 ( (cluster differentiation, CD)cluster differentiation, CD

21、) T T細(xì)胞表面分化族：細(xì)胞表面分化族： CD CD3 3+ + CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞 CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞 B B細(xì)胞表面分化族細(xì)胞表面分化族: : CDCD19 19+ + NKNK細(xì)胞表面分化族細(xì)胞表面分化族: : CDCD16 16+ +/ CD / CD56 56+ + 2021-7-2651 FSC/SSC 區(qū)分淋巴細(xì)胞區(qū)分淋巴細(xì)胞 2021-7-2652 運(yùn)用運(yùn)用CD3/CD19來鑒定來鑒定T淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 2021-7-2653 運(yùn)用運(yùn)用CD3/CD4來鑒定來鑒定CD4+T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 2021-7-2654 運(yùn)用運(yùn)用CD3/CD8來鑒

22、定來鑒定CD8+T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 2021-7-2655 運(yùn)用運(yùn)用CD16 +CD56/CD3-來鑒定來鑒定NK細(xì)胞細(xì)胞 淋巴細(xì)胞亞群 2021-7-2656 健康人淋巴細(xì)胞亞群正常值 CD3 9552860/l 59.484.6% CD19 103 363 /l 6.422.6% CD4 4501440/L 28.560.5% CD8 3201250/L 11.138.3% CD16/56 60 360 5.630.9% CD4/CD8 0.93.6 2021-7-2658 實(shí)驗(yàn)步驟 1.采集血液樣品，取100ul抗凝全血加入每支試管中， 注意不要碰到管壁。 2.輕輕混勻，依次加入20ul

23、 Isotype Control(如沒有的話 用沒染色細(xì)胞代替)，另外幾管加入10l熒光抗體。室 溫避光保存20分鐘。 3.加入1紅細(xì)胞溶解液1ml，渦旋混勻避光保存5min ，待管內(nèi)液體透亮，300-500g離心5min，去上清 4.加PBS 2mlPBS渦旋混勻，300-500g離心5min，棄上 清，然后加0.5mlPBS搖勻。過300目尼龍網(wǎng)，4避光 1h內(nèi)上機(jī)檢測； 2021-7-2659 2021-7-2660 激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物的匹配激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物的匹配 熒光標(biāo)記物與濾色片的匹配熒光標(biāo)記物與濾色片的匹配 注意事項(xiàng) 熒光素的選擇原則熒光素的選擇原則 弱表達(dá)抗原選擇較“明亮”

24、的熒光素 細(xì)胞內(nèi)抗原檢測優(yōu)先選擇小分子熒光素 多色檢測時弱表達(dá)抗原放在被干擾較小的檢測通道，強(qiáng)表達(dá) 抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道 表達(dá)互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道 共表達(dá)的抗原避免放在相互干擾的通道 上級抗原檢測通道避免對下級抗原檢測通道造成干擾 2021-7-2662 熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償 2021-7-2663 Uncompensated vs Compensated 2021-7-2664 流式細(xì)胞儀概況 流式細(xì)胞儀的工作原理及數(shù)據(jù)分析 DNA分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) T淋巴細(xì)胞亞群分析 原理、應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng) 流式細(xì)胞儀的其他應(yīng)用 主要內(nèi)容 20

25、21-7-2665 細(xì)胞膜的變化 DNA含量的變化 酶活性 線粒體膜電位變化 側(cè)向散射光 細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡分析 Annexin-V 檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi) 側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi) 側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為3536kD的Ca2+依賴性磷 脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴 露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被 作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素 （PE、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Anne

26、xin V作為熒光探針，利用熒 光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完 整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的 細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞 膜而使細(xì)胞核染紅。因此將 Annexin V與PI匹配使用，就可以 將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分 開來。 2021-7-2666 2021-7-2667 Annexin-V 檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡 正常活細(xì)胞正?；罴?xì)胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細(xì)胞均低染；凋亡細(xì)胞Annexin V 高染、高染、PI低染；壞死細(xì)胞低染；壞死細(xì)胞Annexin V/PI均高染均高染

27、2021-7-2668 細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切 斷核小體間的斷核小體間的基因組基因組DNA。細(xì)胞凋亡時抽提。細(xì)胞凋亡時抽提DNA進(jìn)行電泳檢測進(jìn)行電泳檢測 ，可以發(fā)現(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的的DNA ladder?；蚪M?；蚪MDNA斷裂時，暴斷裂時，暴 露的露的3-OH可以在可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素的催化下加上熒光素 (FITC) 標(biāo)記的標(biāo)記的dUTP (fluorescein

28、-dUTP) ，從而可以通過熒光，從而可以通過熒光 顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，由于正常的或正在增殖的細(xì)胞顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，由于正常的或正在增殖的細(xì)胞 幾乎沒有幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。形成，很少能夠被染色。 這就是這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢法檢 測細(xì)胞凋亡的原理測細(xì)胞凋亡的原理 BrdU檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡 2021-7-2669 TUNEL Assay with anti-BrdU BrdU檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡 DNA degradation 2021

29、-7-2671 Caspase-3 檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡 CasepaseCasepase 3 3是一個凋亡相關(guān)的信號傳導(dǎo)蛋白，以是一個凋亡相關(guān)的信號傳導(dǎo)蛋白，以PEPE標(biāo)記的抗體進(jìn)行標(biāo)記的抗體進(jìn)行 胞漿染色，可以觀察表達(dá)胞漿染色，可以觀察表達(dá)CaspaseCaspase 3 3蛋白的細(xì)胞的比例和強(qiáng)度。蛋白的細(xì)胞的比例和強(qiáng)度。 JC-1 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒 體膜電位(mitochondrial membrane potential)m 的 理想熒光探針。 在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix) 中，形成聚合物(J-aggregates) ，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線 粒體膜電位較低時，JC-1不 能聚集在線粒體的基質(zhì)中， 此時JC-1為單體(monomer)， 可以產(chǎn)生綠色熒光。 2