熒光檢測(cè)復(fù)習(xí)題參考答案

1、熒光檢測(cè)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用-復(fù)習(xí)題 第一章總論熒光的發(fā)生及基本檢測(cè)原理1 何謂發(fā)光分子吸收輻射被激發(fā)后以光的形式釋放， 輻射躍遷而衰變回到電子基 態(tài)T發(fā)光2熒光與磷光的區(qū)別熒光：激發(fā)后馬上發(fā)光，第一電子激發(fā)單重態(tài)輻射躍遷；延遲10-910-7秒后?；鶓B(tài)SX單重態(tài)S1、S2躍遷-基態(tài)。磷光：延遲時(shí)間長(zhǎng)， 幾毫秒或更長(zhǎng) 1 0-3 1 0秒電子自旋未配對(duì)進(jìn)入受激三重態(tài)，三重態(tài) -躍遷-基態(tài)3 完成良好熒光檢測(cè)的有關(guān)條件1）選擇相應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng) 2）選擇足夠強(qiáng)度的激發(fā)光源，熒光強(qiáng)度與 入射光強(qiáng)度成正比IfflO（1-lt/IO） ; 3）選擇合適（QE）的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)器件； 4）控制好樣品制備與檢測(cè)環(huán)

2、境體系。4 熒光的種類(lèi)根據(jù)激發(fā)方式。 1 ）光化發(fā)光 2）化學(xué)熒光 3）生物熒光。 按熒光素的標(biāo)記過(guò)程可分為： 1）免疫熒光 2）組織熒光 3）誘導(dǎo)熒光 5有哪幾種熒光現(xiàn)象l 次熒光現(xiàn)象：固有或自發(fā)熒光；一經(jīng)輻射就可發(fā)出熒光的物質(zhì)。 ll 次熒光現(xiàn)象及熒光色素 （標(biāo)記物）又稱(chēng)繼發(fā)熒光； 樣品分子不能或只能 發(fā)出很弱的熒光， 對(duì)此類(lèi)分子需先經(jīng)熒光色素標(biāo)記結(jié)合或插入到不發(fā) 光的大分子中去，根據(jù)熒光探針的熒光分析大分子。6影響熒光強(qiáng)度（If ）的因素1光化分解：熒光物質(zhì)吸收光能后，某些鍵斷裂，導(dǎo)致熒光弱。制片 時(shí)應(yīng)避光。2熒光淬滅：（1）溫度淬滅：加快震動(dòng)弛豫而喪失振動(dòng)能 量；增加分子熱運(yùn)動(dòng)高溫?zé)晒?/p>

3、分子與液基環(huán)境中分子碰撞。溫度適宜或低溫。（2）濃度淬滅：濃度大時(shí)發(fā)光分子在樣品中分布不均，深部 的分子吸收不到光子，量子產(chǎn)額反而小。生成二聚體或多聚體，改變 吸收光譜，If降低。（3）雜質(zhì)淬滅：靜態(tài)淬滅，雜質(zhì)與熒光分子組 成另一種化合物。環(huán)境凈化。碰撞、轉(zhuǎn)入三重態(tài)淬滅。3pH影響：破壞熒光物質(zhì)環(huán)鏈結(jié)構(gòu)，芳香族化合物的酸、堿功能團(tuán)對(duì)pH敏感。7半波寬定義：最大透光度Tmax波長(zhǎng)1/2處對(duì)應(yīng)的兩波長(zhǎng)差（入1 - 入2）也稱(chēng)帶寬（Bandwidth）,帶寬窄則光色純。第二章熒光成像檢測(cè)1光學(xué)顯微鏡分辨率定義及簡(jiǎn)易計(jì)算公式定義：公式；D=人卜而爲(wèi)兩個(gè)物點(diǎn)像能被分辯的最小跖離2影響光學(xué)顯微鏡分辨率的主

4、要因素影響分辨率的因素為衍射效應(yīng)：圓斑像 AIRY斑，阻礙分辨率。3聚光鏡與物鏡孔徑光闌的對(duì)應(yīng)調(diào)節(jié)目的：產(chǎn)生與物鏡相應(yīng)的光束，使鏡像的反差和焦深處于最佳狀態(tài)。不同倍率物鏡有不同的NA值，改換物鏡聚光鏡NA應(yīng)做相應(yīng)調(diào)節(jié)。觀 察：與物鏡NA致（100%）,以得到較好的分辨率；照像：相當(dāng)于物 鏡NA的6080%以得到較好的反差、焦深。4光學(xué)顯微鏡的有效放大 =所用物鏡NA值的5001000倍5 熒光量子效率（ QE）熒光量子效 （產(chǎn)） 率=放射量子數(shù)吸收量子數(shù)6醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中熒光檢測(cè)常用的熒光檢測(cè)傳感器是哪兩種I 轉(zhuǎn)換光學(xué)信號(hào)為電子信號(hào) -光學(xué)傳感器 ,2 彩色 CCD7 顯微鏡照相術(shù)的定義 將顯微鏡視

5、場(chǎng)中的微觀圖像記錄為放大圖像的技術(shù)8影響CCD成像效果的主要因素是什么溫度和靈敏度，CCD工作時(shí)，表面會(huì)產(chǎn)生熱量，使得在芯片形成暗電 流，暗流將增加噪音、降低信噪比、導(dǎo)致降低成像質(zhì)量。9 CCD成像放大倍率的計(jì)算公式顯示或照片倍率=OBJ咅率X光學(xué)適配器倍率X顯示或照片對(duì)角線長(zhǎng)度/ CCD寸角線長(zhǎng)度10熒光顯微鏡CCD成像與激光共焦顯微鏡成像的比較數(shù)字CCD優(yōu)點(diǎn)：價(jià)低，使用簡(jiǎn)便，成像塊，測(cè)得 FI同LSCM彩色還 原好，圖像近于鏡下，光化淬滅傷害小。 Ratio 測(cè)鈣、使用 TC 板， 適于標(biāo)本：薄、層次簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：厚標(biāo)本圖像質(zhì)量差，無(wú)光切功能， 整合功能配置價(jià)格不菲 激光共焦掃描顯微鏡，優(yōu)點(diǎn)

6、：分辨率高，光切片， 3D 空間立體結(jié)構(gòu) 觀測(cè)，集成熒光分析功能。缺點(diǎn)：成本高（專(zhuān)人、耗材） ，光化淬滅 傷害較大II 免疫熒光染色的目的將抗體標(biāo)記上熒光素（如 FITC、TRITQ,與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原（目標(biāo) 蛋白）結(jié)合后，通過(guò)觀察、檢測(cè)具有特征性的熒光，定性、定位及定 量的顯示和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)目的蛋白12. 免疫熒光染色常用方法 直接法、間接法和雙標(biāo)記法13. 影響免疫熒光染色結(jié)果的主要因素有1）熒光染料標(biāo)記的抗體的濃度，2）溶液的pH值，3）溶劑14. 舉例說(shuō)明自發(fā)熒光主要包括哪些 動(dòng)物中一般為黃素類(lèi)和卟啉類(lèi)，植物中為葉綠素容易產(chǎn)生自發(fā)熒光。 脂褐素的自發(fā)熒光，彈力蛋白和膠原 UV激發(fā)下呈黃綠色

7、熒光，培養(yǎng) 死細(xì)胞很容易產(chǎn)生自發(fā)熒光。15. 免疫熒光染色前對(duì)細(xì)胞接種密度的要求細(xì)胞密度：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整細(xì)胞接種密度。 對(duì)細(xì)胞個(gè)體進(jìn)行形態(tài)學(xué) 觀察以及定位熒光信號(hào)： 細(xì)胞密度稍稀疏。 使細(xì)胞充分伸展， 顯示出 其應(yīng)有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)； 但也要注意保證視野內(nèi)有一定數(shù)目的細(xì)胞， 以 便選取有代表性的細(xì)胞采圖，要求細(xì)胞所占面積不低于視野的20%。定量測(cè)定熒光強(qiáng)度（觀察某種蛋白的表達(dá)量） ：細(xì)胞密度應(yīng)稍高。用 于做大量細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)定量，細(xì)胞至少要占到視野面積的80%；這時(shí)細(xì)胞要布滿(mǎn)視野但相互之間還有空隙，細(xì)胞排列均勻，不聚堆擁擠，防 止細(xì)胞間擠壓變形，影響定量結(jié)果。達(dá)到通常所說(shuō)的亞融合狀態(tài)。16 熒光顯微

8、鏡觀察免疫熒光染色需要設(shè)置的對(duì)照及意義 正確設(shè)置對(duì)照組（非常必要） ：1.陽(yáng)性對(duì)照：已知抗原陽(yáng)性的樣品與 待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色， 對(duì)照樣品呈陽(yáng)性結(jié)果， 用于檢驗(yàn)免 疫熒光染色全過(guò)程是否符合要求，包括孵育溫度、時(shí)間，一抗、二抗 是否有問(wèn)題，分析可能原因。如果陽(yáng)性對(duì)照呈陰性，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程 有問(wèn)題，需要對(duì)每個(gè)條件加以分析改進(jìn)。 2. 陰性對(duì)照：已知抗原陰性 的樣品作對(duì)照，對(duì)照樣品應(yīng)呈陰性結(jié)果。包括空白對(duì)照（ PBS代替一 抗）和替代對(duì)照（非免疫血清代替一抗） ，用于排除非特異性染色。 如果陰性對(duì)照呈陽(yáng)性表達(dá)，同樣檢測(cè)樣品的結(jié)果也是不可信的。 3. 不染色細(xì)胞空白組：不經(jīng)免疫熒光染色，直接上

9、機(jī)觀察，用于檢測(cè)由 于細(xì)胞本身或固定造成的細(xì)胞自發(fā)熒光。17共聚焦掃描顯微鏡（LCSM光學(xué)成像原理 檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦于同一點(diǎn)， 使聚焦平面以外被激發(fā)的熒 光不能進(jìn)入檢測(cè)針孔 - 高分辨率的光學(xué)切片18共聚焦掃描顯微鏡（LSCM與傳統(tǒng)熒光顯微鏡比較的優(yōu)點(diǎn)1 ）提高了敏感性及分辨率， 2）擴(kuò)大獲取信息范圍， 3）實(shí)現(xiàn)了圖像 三維重建， 4）客觀記錄熒光信息， 5）同時(shí)顯示多種標(biāo)記物19. 定義：熒光漂白恢復(fù)（FRAP）：經(jīng)熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞的某一區(qū)域 一旦被高強(qiáng)度的激光照射后 ,熒光物質(zhì)的光化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞 , 熒光強(qiáng) 度下降, 但此處熒光強(qiáng)度會(huì)漸漸恢復(fù) ,熒光強(qiáng)度和恢復(fù)的快慢和多少 ,代

10、表周?chē)肿訑U(kuò)散的速率 , 或分子運(yùn)動(dòng)速度。20. 定義：熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）:受激態(tài)熒光素將其能量向另一 個(gè)熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過(guò)程稱(chēng)熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量 的提供者叫供體熒光素，能量的接受者叫受體熒光素。第三章熒光光度檢測(cè)1熒光分光光度計(jì)的構(gòu)造示意圖光源T激發(fā)單色器T樣品杯T發(fā)射單色器T檢測(cè)器T電子放大及控 制T顯示2 微孔板熒光檢測(cè)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用1）利用報(bào)告基因檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)：將報(bào)告基因引入細(xì)胞DNA使之與某一特定分子事件相關(guān)， 可以為這一分子事件帶來(lái)可測(cè)性。 通常 檢測(cè)的分子事件是基因功能，具有可測(cè)性的是發(fā)光。目前，市場(chǎng)上有 許多發(fā) 光 報(bào)告基因 出售。包括： 螢

11、火蟲(chóng)熒光 素酶（ firefly luciferase ）, B半乳糖苷酶（B-galactosidase ）等。2） ATP 水 平測(cè)定：所有活細(xì)胞都含有 ATP ATP可以從細(xì)胞中提取出來(lái)，用螢 火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)。熒光強(qiáng)度與樣品中ATP的含量成比例，相應(yīng)的與 提取ATP所用的細(xì)胞數(shù)成比例?？梢詸z測(cè)樣品中的所有微生物，因而 被用于檢測(cè)水中的大腸桿菌含量，用于藥品，化妝品，牛奶以及其它 食品的微生物控制， 測(cè)定土壤和沉積物中的全部活生物含量， 評(píng)價(jià)抗 生素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，了解不同藥物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的影響等。 3）離子測(cè)定：如細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定。3活細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定的方法 即從測(cè)量出的熒光

12、信號(hào)中定量地計(jì)算出鈣離子濃度。 對(duì)于單波長(zhǎng)激發(fā) 或發(fā)射的熒光指示劑，可按下式計(jì)算 Ca2+=Kd（F 一 Fmin）/（Fmax 一 F）, Kd:熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數(shù)，F(xiàn)min和Fmax為最小 熒光強(qiáng)度和最大熒光強(qiáng)度。 對(duì)于雙波長(zhǎng)的熒光指示劑， 用率比值信號(hào)來(lái)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+濃度，用下式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，Ca2+=Kd(Fd/Fs)(R Rmin)/(Rmax R) Kd :熒光劑與 Ca2+形成 配合物的解離常數(shù).Fd和Fs分別表示熒光劑沒(méi)有結(jié)合 Ca2+和被Ca2+ 飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度.，R為實(shí)驗(yàn)觀察到的熒光比值.Rmin為細(xì)胞內(nèi)熒光劑最小量結(jié)合 Ca2+

13、寸的熒光比值.，Rmax為胞內(nèi) 熒光劑被Ca2+飽和時(shí)的熒光比值.4 fura2 指示劑測(cè)鈣原理Fura2: 由紫外激發(fā)的一種率測(cè)量指示劑， 因有較強(qiáng)的親水性， 難以進(jìn) 入細(xì) 胞， 在其負(fù)性基團(tuán)部位結(jié)合上親脂的 乙酰羥甲基酯成為 Fura-2/AM 后，與細(xì)胞溫孵時(shí)很容易透過(guò)細(xì)胞膜，胞漿內(nèi)的酯酶可將 Fura-2/AM 水解成 Fura-2 而滯留在胞漿內(nèi)，后者與胞內(nèi)游離的鈣離 子結(jié)合形成Fura-2-鈣離子復(fù)合物。當(dāng)Fura-2與Ca2+吉合后吸收峰 發(fā)生改變，在最大和最小 Ca2+濃度時(shí),它的最大吸收峰分別在335nm 和363nm處，在作率測(cè)量時(shí)，經(jīng)常選用的波長(zhǎng)是 340nm和380nm

14、結(jié) 合鈣和游離鈣形式Fura2的發(fā)射峰都是510nm,其發(fā)射光的強(qiáng)度與鈣 離子的濃度呈比例關(guān)系第四章熒光細(xì)胞激活分選、分析1 簡(jiǎn)述流式細(xì)胞儀的工作原理 流式細(xì)胞儀的工作原理:將待測(cè)標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液 , 經(jīng)熒光染色 后由氣壓裝置送入流動(dòng)室 , 流動(dòng)室由樣品管和鞘液管組成 , 鞘液管充 滿(mǎn)流動(dòng)的鞘液 ,鞘液流與樣品流壓力不等 , 當(dāng)兩者壓力差達(dá)到一定程 度時(shí) , 鞘液裹挾著樣品流迫使細(xì)胞有序地排列成單列 , 逐個(gè)進(jìn)入激光 聚焦區(qū)。經(jīng)激光束激發(fā) , 產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。通過(guò)一些波長(zhǎng)選擇 通透性濾光片 , 即可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)。散射 光和熒光信號(hào)接收后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)送計(jì)算機(jī)處

15、理 , 可在計(jì)算機(jī)上直 觀地統(tǒng)計(jì)染上各種熒光染料的細(xì)胞各自的百分率。2 簡(jiǎn)述流式細(xì)胞儀的構(gòu)造1)流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 2)激光光源及光束成形系統(tǒng) 3)光學(xué)系統(tǒng) 4)信號(hào)檢測(cè)與存貯、顯示、分析系統(tǒng) 5)細(xì)胞分選系統(tǒng)3 前向角散射定義 (FSC， Forward Scatter)前向角散射 (FSC，F(xiàn)orward Scatter) ：0散射, 與被測(cè)細(xì)胞的大小和 面積有關(guān)，確切說(shuō)與細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來(lái)排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞干擾。4側(cè)向角散射定義 (SSC， Side Scatter) 側(cè)向角散射 (SSC， Side S

16、catter) ：90散射 ,對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜 的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。5 試述 Annexin V/PI 染色應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的基本原理 基本原理： 細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面， 這些細(xì)胞膜表面的 改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。 PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于 細(xì)胞膜的內(nèi)面， 在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱(chēng) 性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Ann exin V是一種Ca2+依賴(lài)的磷 脂結(jié)合蛋白，具有易于結(jié)合到磷脂類(lèi)如PS的特性,對(duì)PS有咼度的親和 性。該蛋白可

17、充當(dāng)敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。6 簡(jiǎn)述 PI (碘化丙啶)染色時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡峰的原理 在凋亡細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞核的解聚和凋亡小體的形成，核內(nèi)的總 DNA 含量下降。由于在凋亡細(xì)胞內(nèi) DNA含量下降，在G1峰前出現(xiàn)亞二倍 體峰，稱(chēng)亞G1期峰，又稱(chēng)凋亡細(xì)胞峰。7試述PI (碘化丙啶)染色應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的原理 碘化丙啶是一種雙鏈DNA勺熒光染料，可以和DNA吉合，通過(guò)流式細(xì) 胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA吉合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含 量的多少。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的 DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的G1 /G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細(xì)

18、胞 的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此， 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞 周期各時(shí)相區(qū)分為G1/GO期,S期和G2/M期,并可通過(guò)特殊軟件計(jì)算 各時(shí)相的百分率。8流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選原理 流式細(xì)胞儀的分選功能是通過(guò)流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴而實(shí)現(xiàn) 的。在流動(dòng)室的噴嘴上裝有一個(gè)超聲振蕩壓電晶體片 , 該裝置在充電 后以每秒上萬(wàn)次的振動(dòng)頻率 , 使液束成為上萬(wàn)個(gè)液滴，待測(cè)細(xì)胞分散 在這些液滴中。此時(shí) , 細(xì)胞的熒光和散射光信號(hào)已被測(cè)量 ,經(jīng)邏輯判 斷，給流束一個(gè)充電脈沖信號(hào) , 小水滴就全部帶上了正負(fù)不同的電荷， 當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾

19、千伏的偏轉(zhuǎn)板時(shí)， 在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)， 落入 各自的收集容器中。9 與其他分選方法相比流式細(xì)胞分選的特點(diǎn)1）少量細(xì)胞分選時(shí)，流式細(xì)胞分選精度高，速度快。先進(jìn)的流式分 選速度可達(dá) 25000個(gè)細(xì)胞/ 秒以上；一次分離的最大合理量為 108次 方個(gè)細(xì)胞。 2）可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè) Marker 分選，正選負(fù)選同時(shí)進(jìn)行， 也可以進(jìn)行 4 路分選。 3）不僅僅限于表面標(biāo)記物，流式細(xì)胞儀可以 根據(jù)任何能檢測(cè)到的散射光（如細(xì)胞體積）或熒光（如DNA,RN威蛋白含量，酶活性，特異抗原）強(qiáng)度差異來(lái)分離細(xì)胞。4）如果只是偶爾做幾次細(xì)胞分選的話， 用流式細(xì)胞分選還是比較劃算， 只需準(zhǔn)備樣 品和抗體，交納一定的儀器使用費(fèi)用即可，不需要購(gòu)買(mǎi)配套的設(shè)備。10 同型對(duì)照 同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來(lái)源、 相同亞型、 相同劑量和相同的 免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，