實驗四、PCR基因擴增

1、PCR基因擴增基因擴增 實驗四實驗四 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?1）學(xué)習(xí)掌握PCR反應(yīng)原理 2）掌握PCR技術(shù)的操作過程 3）通過PCR獲得銀杏黃酮代謝過程中的一個關(guān)鍵酶基因CHS基 因（查爾酮異構(gòu)酶基因） 二、二、實驗原理實驗原理 類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴增DNA 模板加熱變性解鏈， 隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序 列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以 延伸。 這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就 是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。 三、實驗試劑、材料、儀器三、實驗試劑、材料、儀器 試劑試劑：Taq DNA聚合酶

2、，PCR緩沖液（含MgCl2），dNTP （每種2.5mmol/L）混合物，引物(終濃度各0.5mol/L) ；瓊脂糖， 50TAE 緩沖液，無菌雙蒸水等 材料材料：銀杏DNA 儀器儀器：微量移液器，吸頭，0.2ml PCR薄壁管，PCR儀，臺式 離心機，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，微波爐等 四、操作步驟四、操作步驟 1）取一個干凈的PCR薄壁管 2）往PCR管里面加入各種試劑： 1l Primer1 1l Primer2 1l DNA模板 15l PCR反應(yīng)液 12l 無菌ddH2O 30l Note 3）設(shè)定好PCR反應(yīng)程序如下： 95 4 min 95 50s 61 1.5 min 35 cyc

3、les 72 2min 72 10 min End 4）開始PCR 5）1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果 五、注意事項五、注意事項 ）PCR非常靈敏， 注意移液器的規(guī)范使用，保證各種反應(yīng)試劑吸取 的精確性。 ）所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染；吸頭、離心管應(yīng)高壓 滅菌，每次吸頭用畢應(yīng)更換，不要互相污染試劑。 3） PCR的所用試劑應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻 。 六、作業(yè) 1）將你PCR實驗結(jié)果的電泳圖片附在實驗報告上，并根據(jù)圖片分析你 擴增的結(jié)果 2）思考：有哪些因素會影響PCR的質(zhì)量？ DNA的結(jié)構(gòu)（的結(jié)構(gòu)（1） 三磷酸核糖核苷NTP 三磷酸脫氧核糖核苷dNTP 三磷酸雙脫氧核糖核苷

4、ddNTP 補充：補充：PCR 原理原理 DNA的結(jié)構(gòu)（的結(jié)構(gòu)（2） A腺嘌呤 G鳥嘌呤 C胞嘧啶 U尿嘧啶 T胸腺嘧啶 五 種 堿 基 A-T C-G DNA的結(jié)構(gòu)（的結(jié)構(gòu)（3） 氫鍵維持了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) DNA的復(fù)制（的復(fù)制（1） 3-OH進(jìn)攻5- Pi DNA聚合酶催化 DNA的延伸方向:5-3 DNA的復(fù)制（的復(fù)制（2） DNA復(fù)制相關(guān)蛋白在復(fù)制起始點打開雙鏈DNA，然后DNA解鏈 酶結(jié)合到單鏈DNA上進(jìn)一步解開雙鏈DNA DNA的復(fù)制（的復(fù)制（3） DNA的復(fù)制的復(fù)制 和和 體外的模擬體外的模擬 模板（母鏈） 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 打開雙鏈 解鏈酶 加熱變性 維持單鏈 單鏈結(jié)合蛋白

5、 高溫 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 聚合酶 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 反應(yīng)環(huán)境 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境 緩沖液 PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性 PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性 PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性 PCR循環(huán)循環(huán)退火退火 PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸 PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸 PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸 PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸 PCR整個過程整個過程 討論討論1：為何酶促反應(yīng)需要那么高的溫度：為何酶促反應(yīng)需要那么高的溫度 v為了確保模板是單鏈，尤其是第一次反應(yīng)的模板 v防止非特異性的引物退火 v延伸的溫度必須大于退火溫度，而小于變性溫度 DNADNA聚合酶不能熱變性，所以選用耐高溫的聚合酶聚合酶不

6、能熱變性，所以選用耐高溫的聚合酶 常規(guī)用的PCR DNA聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌分離出來的DNA聚合酶。 酶活性在100 條件下，能保持幾個小時。而其最適合酶促溫度在72 左右。 討論討論2：影響：影響PCR質(zhì)量的一些因素質(zhì)量的一些因素 模板：選用純度較高的DNA作模板，雜質(zhì)蛋白和RNA的存在都會影響 到DNA聚合酶與引物和模板的結(jié)合。 目的片斷：目的片斷或者目的片斷相鄰的DNA含GC量較高，或者有重 復(fù)序列存在，都會導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的存在?？稍诜磻?yīng)體系里加入DMSO， 破壞模板的二級結(jié)構(gòu)。 引物的設(shè)計：引物太短，要求退火的溫度就低，錯配的可能性就大， 再者，兩條引物不能存在較長的互補片斷 。 酶：

7、純度、可信度，堿基錯配率1/10000。 討論討論3：PCR的應(yīng)用的應(yīng)用 q從藍(lán)藻里面克隆從藍(lán)藻里面克隆SODSOD (超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) SOD作用：清除人體內(nèi)細(xì)胞中自由基 抗氧化、抗輻射、消炎、抗衰老、抗癌 高壓氧中毒、肺氣腫、糖尿病、早衰 食品、保健品、藥品、化妝品 基因庫檢索 SOD的序列 設(shè)計引物以藍(lán)藻總DNA位模板做PCR 獲得的基因片斷連接在表達(dá)載體原核表達(dá)蛋白 討論討論3：PCR的應(yīng)用的應(yīng)用 q檢測粉末樣品是否含檢測粉末樣品是否含 有炭疽桿菌有炭疽桿菌 炭疽菌恐慌，降臨美國，席卷全球 生命力強、傳染快、發(fā)作快、死亡率高。 有兩對引物是根據(jù)編碼炭疽桿菌EF因子的基因序列設(shè)計的，僅與各 種炭疽桿菌的EF因子同源。PCR產(chǎn)物是1247bp和208bp的片斷。非炭疽 桿菌均呈陰性。 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)2小時取培養(yǎng)液直接作PCR PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)的一項技術(shù)是現(xiàn)代分子生