蛋白質(zhì)測定-凱氏定氮法[高教材料]

1、 【基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識】 蛋白質(zhì)概述蛋白質(zhì)概述 蛋白質(zhì)是食品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)，含蛋白質(zhì)是食品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)，含N是蛋白質(zhì)區(qū)是蛋白質(zhì)區(qū) 別其他有機化合物的主要標(biāo)志。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量別其他有機化合物的主要標(biāo)志。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量 接近，一般來說，接近，一般來說，pro的平均含氮量為的平均含氮量為16%，即一份，即一份 氮相當(dāng)于氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。 注意：注意： 不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、 青豆、雞蛋等為青豆、雞蛋等為6.25，花生為，花生為5.46，大米為，大米為

2、5.95，大，大 豆及其制品為豆及其制品為5.71，小麥粉為，小麥粉為5.70、全小麥、大麥、全小麥、大麥、 燕麥、裸麥和小米是燕麥、裸麥和小米是5.83；硬果類為；硬果類為5.30；牛乳及其牛乳及其 制品為制品為6.38。 2優(yōu)質(zhì)課 【一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康摹?1、掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。、掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。 2、學(xué)會使用凱氏定氮裝置。、學(xué)會使用凱氏定氮裝置。 3、了解蛋白質(zhì)系數(shù)在蛋白質(zhì)含量計算中的應(yīng)用。、了解蛋白質(zhì)系數(shù)在蛋白質(zhì)含量計算中的應(yīng)用。 蛋白質(zhì)是食品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。測量食品中蛋蛋白質(zhì)是食品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。測量食品中蛋 白質(zhì)的含量對

3、于評價食品的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利白質(zhì)的含量對于評價食品的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利 用食品資源、指導(dǎo)生產(chǎn)、優(yōu)化食品配方、提高產(chǎn)品用食品資源、指導(dǎo)生產(chǎn)、優(yōu)化食品配方、提高產(chǎn)品 質(zhì)量具有重要的意義。質(zhì)量具有重要的意義。 3優(yōu)質(zhì)課 注意注意：此法測定得到的蛋白質(zhì)含量，實際上包括核酸、生此法測定得到的蛋白質(zhì)含量，實際上包括核酸、生 物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物， 故稱為故稱為粗粗pro。 【二、原理二、原理】 4優(yōu)質(zhì)課 1、消化、消化 儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器及試劑的準(zhǔn)備 儀器：儀器： 【三、實驗步驟三、實驗步驟】 5優(yōu)質(zhì)課 試劑試劑作用作用

4、 硫酸銅硫酸銅 a催化作用催化作用：加速有機物的氧化分解。：加速有機物的氧化分解。 b消化完全的指示劑消化完全的指示劑：藍綠色，澄清，透明；：藍綠色，澄清，透明； c蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑：變深藍色或產(chǎn)生黑色沉淀：變深藍色或產(chǎn)生黑色沉淀 硫酸鉀硫酸鉀 提高溶液沸點提高溶液沸點，從而加快有機物分解，從而加快有機物分解 濃硫酸濃硫酸 氧化作用氧化作用：有機物質(zhì)氧化分解為：有機物質(zhì)氧化分解為H2O和和CO2 樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理 固體試樣固體試樣 0.22g 半固體試樣半固體試樣 25g 液體試樣液體試樣 1025g 樣品充分混勻樣品充分混勻 直接消化直接消化 6優(yōu)質(zhì)課 樣品稱

5、量、消化樣品稱量、消化 1.000g1.000g奶粉奶粉 0.2g0.2g硫酸銅硫酸銅 6g6g硫酸鉀硫酸鉀 20mL20mL濃硫酸濃硫酸 玻璃珠玻璃珠 小火加熱炭化小火加熱炭化 至泡沫完全停止至泡沫完全停止 輕搖輕搖 大火加熱大火加熱 保持瓶中液體微沸保持瓶中液體微沸 至藍綠色澄清透明至藍綠色澄清透明 繼續(xù)加熱繼續(xù)加熱0.51h 冷卻冷卻 加加20mL水水 冷卻冷卻 同時做試劑同時做試劑 空白試驗空白試驗 7優(yōu)質(zhì)課 8優(yōu)質(zhì)課 2、蒸餾、吸收、蒸餾、吸收 儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器及試劑的準(zhǔn)備 儀器：儀器： 100mL 3只只 試劑（混合指示劑）：試劑（混合指示劑）： 2 2份份甲基紅乙醇甲基紅乙醇

6、液（液（1g/L1g/L）與）與1 1份份亞甲基藍乙醇亞甲基藍乙醇液（液（1g/L1g/L） 臨用時混合。指示劑在堿性溶液中呈臨用時混合。指示劑在堿性溶液中呈綠色綠色, ,在中性溶液中呈在中性溶液中呈 灰色灰色, ,在酸性溶液中呈在酸性溶液中呈紅色紅色。 9優(yōu)質(zhì)課 凱氏定氮蒸餾裝置凱氏定氮蒸餾裝置 傳統(tǒng)裝置傳統(tǒng)裝置 1：電爐：電爐 2：水蒸氣發(fā)生器：水蒸氣發(fā)生器 3：螺旋夾：螺旋夾 4：小玻杯及棒狀玻塞：小玻杯及棒狀玻塞 5：反應(yīng)室：反應(yīng)室 6：反應(yīng)室外層：反應(yīng)室外層 7：橡皮管及螺旋夾：橡皮管及螺旋夾 8：冷凝管：冷凝管 9：蒸餾液接收瓶：蒸餾液接收瓶 10優(yōu)質(zhì)課 水蒸氣發(fā)生器：水蒸氣發(fā)生器

7、： 裝水至裝水至2/32/3處，加入數(shù)粒處，加入數(shù)粒玻璃珠玻璃珠，加，加甲基紅乙醇甲基紅乙醇 指示劑指示劑數(shù)滴及數(shù)滴及硫酸硫酸數(shù)數(shù)mlml，使水呈微紅色（保持酸性，使水呈微紅色（保持酸性 以防水中氨的逸出）以防水中氨的逸出）按上圖所示搭好裝置按上圖所示搭好裝置 11優(yōu)質(zhì)課 蒸餾及吸收蒸餾及吸收 n10.0mL10.0mL硼酸溶液硼酸溶液100mL100mL三角瓶三角瓶加加1 12 2滴混合指示劑滴混合指示劑 冷凝管下端插入三角瓶液面下冷凝管下端插入三角瓶液面下準(zhǔn)確吸取準(zhǔn)確吸取10mL10mL試樣試樣由由 小玻杯流入反應(yīng)室小玻杯流入反應(yīng)室少量水洗滌小漏斗少量水洗滌小漏斗蓋緊玻璃塞蓋緊玻璃塞 量筒

8、取量筒取10.0mLNaOH10.0mLNaOH溶液溶液倒入小玻杯倒入小玻杯提起玻塞使其緩提起玻塞使其緩 慢流入反應(yīng)室慢流入反應(yīng)室立即塞緊玻璃塞立即塞緊玻璃塞加水于小玻杯防漏氣加水于小玻杯防漏氣 通蒸汽通蒸汽顏色變化時開始計時蒸餾顏色變化時開始計時蒸餾5min 5min 移動接受瓶使移動接受瓶使 液面離開冷凝管下端液面離開冷凝管下端再蒸餾再蒸餾1min1min 用少量水沖洗冷凝用少量水沖洗冷凝 管下端外部管下端外部取下接收瓶取下接收瓶 12優(yōu)質(zhì)課 注意注意 加加NaOH一定要過量一定要過量，此時溶液生成，此時溶液生成深藍色深藍色或黑色或黑色沉淀沉淀 為為防止樣液中氨氣逸出。防止樣液中氨氣逸出。

9、一是要水封，二要夾緊廢液蝴蝶一是要水封，二要夾緊廢液蝴蝶 夾后再通蒸汽，三要注意接頭處有無松漏現(xiàn)象夾后再通蒸汽，三要注意接頭處有無松漏現(xiàn)象 硼酸吸收液的顏色硼酸吸收液的顏色 反應(yīng)室中溶液的顏色反應(yīng)室中溶液的顏色 13優(yōu)質(zhì)課 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。 吸收液溫度不應(yīng)超過吸收液溫度不應(yīng)超過4040，避免氨氣逸出，避免氨氣逸出，若超過若超過 時可置于冷水浴中使用。時可置于冷水浴中使用。 在蒸餾時，在蒸餾時，蒸汽發(fā)生要均勻充足蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得，蒸餾過程中不得 ?；饠嗥；饠嗥? ,否則會發(fā)生否則會發(fā)生倒吸倒吸。 蒸餾完畢

10、后，先將冷凝管下端離開液面，再蒸蒸餾完畢后，先將冷凝管下端離開液面，再蒸1 1分鐘，分鐘， 將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸 收瓶移開，收瓶移開，最后關(guān)閉電源最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否，絕不能先關(guān)閉電源，否 則吸收液將發(fā)生則吸收液將發(fā)生倒吸倒吸。 所用的試劑溶液所用的試劑溶液 必須用必須用無氨蒸餾水無氨蒸餾水配制。配制。 14優(yōu)質(zhì)課 3、鹽酸滴定、鹽酸滴定 接收瓶接收瓶 以以HCL標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定 灰色終點灰色終點 記錄記錄VHcl （1 1）硼酸吸收液的）硼酸吸收液的 顏色顏色 （2 2）吸收氨氣后的）吸收氨氣后的

11、硼酸吸收液的顏色硼酸吸收液的顏色 （3 3）鹽酸滴定終點）鹽酸滴定終點 的顏色的顏色 15優(yōu)質(zhì)課 項目名稱項目名稱檢測日期檢測日期 樣品名稱樣品名稱檢驗依據(jù)檢驗依據(jù) 內(nèi)容內(nèi)容1 12 23 3 空白空白 樣品質(zhì)量樣品質(zhì)量m/gm/g V V初 初 /mL /mL V V終 終 / / mL mL 消耗的體積消耗的體積V V1 1 /mL /mL 吸取消化液體積吸取消化液體積V V3 3 /mL /mL 蛋白質(zhì)含量（蛋白質(zhì)含量（g/100gg/100g） 平均值（平均值（g/100gg/100g） （g/100gg/100g） F F：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)

12、6.386.38 【四、數(shù)據(jù)記錄與計算四、數(shù)據(jù)記錄與計算】 16優(yōu)質(zhì)課 n有效數(shù)字：有效數(shù)字： n蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量1 g/100 g時，結(jié)果保留時，結(jié)果保留三位三位有效數(shù)字有效數(shù)字 n蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量1 g/100 g時，結(jié)果保留時，結(jié)果保留兩位兩位有效數(shù)字。有效數(shù)字。 n精密度：精密度： n在重復(fù)性條件下的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超在重復(fù)性條件下的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超 過算術(shù)平均值的過算術(shù)平均值的10% （g/100g） 17優(yōu)質(zhì)課 小結(jié)小結(jié) 步驟步驟反應(yīng)前后顏色變化反應(yīng)前后顏色變化 濕法消化濕法消化凱氏燒瓶：樣品無色（加硫酸前）凱氏燒瓶：樣品無色（加硫酸前）加硫加

13、硫 酸炭化黑色酸炭化黑色消化后紅棕色消化后紅棕色 棕褐色棕褐色消消 化終點藍綠色化終點藍綠色/ /墨綠色墨綠色淡藍色（冷卻后溶淡藍色（冷卻后溶 液）液） 堿化蒸餾堿化蒸餾反應(yīng)室：深藍色或黑色沉淀反應(yīng)室：深藍色或黑色沉淀 硼酸吸收硼酸吸收紫紅色紫紅色綠色綠色 鹽酸滴定鹽酸滴定 甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色灰色灰色 甲基紅和亞甲基藍混合液：綠色甲基紅和亞甲基藍混合液：綠色藍紫色藍紫色 18優(yōu)質(zhì)課 n凱氏定氮法用于所有動物、植物類食品的蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法用于所有動物、植物類食品的蛋白質(zhì)含量的 測定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉測定，但因樣品中含有

14、核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉 以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測定結(jié)果為以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測定結(jié)果為 粗蛋白質(zhì)含量。粗蛋白質(zhì)含量。 n若要測定樣品的蛋白氮若要測定樣品的蛋白氮, ,則需要向樣品中加入則需要向樣品中加入三氯乙酸三氯乙酸溶溶 液液, ,使其最終濃度為使其最終濃度為5%,5%,然后測定未加入三氯乙酸的樣品然后測定未加入三氯乙酸的樣品 及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量, ,進一步計算出蛋進一步計算出蛋 白質(zhì)含量白質(zhì)含量: : 蛋白氮蛋白氮= =總氮總氮- -非蛋白氮非蛋白氮 19優(yōu)質(zhì)課 l準(zhǔn)確稱取某乳粉樣品準(zhǔn)確稱取某乳粉樣品

15、0.8000.800克，經(jīng)凱氏法消化定容至克，經(jīng)凱氏法消化定容至100ml100ml， 移 取移 取 5 m l5 m l消 化 液 進行蒸餾 ， 用消 化 液 進行蒸餾 ， 用 2 0 m l2 0 m l 硼 酸 吸 收 ， 再 用硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl0.05000mol/lHCl滴定，結(jié)果消耗滴定，結(jié)果消耗5.00ml5.00ml，試計算該乳粉的，試計算該乳粉的 蛋白質(zhì)含量？蛋白質(zhì)含量？ l試述蛋白質(zhì)測定中，樣品消化過程所必須注意的事項，消試述蛋白質(zhì)測定中，樣品消化過程所必須注意的事項，消 化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)

16、生什么變化？為什么？ l樣品經(jīng)消化進行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時溶樣品經(jīng)消化進行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時溶 液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說明什么問題？液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說明什么問題？ 須采用什么措施？須采用什么措施？ 20優(yōu)質(zhì)課 知識拓展：三聚氰胺假蛋白知識拓展：三聚氰胺假蛋白“原理原理” 三聚氰胺的三聚氰胺的“優(yōu)點優(yōu)點” 1、普通蛋白質(zhì)含氮量平均為、普通蛋白質(zhì)含氮量平均為16%，一般不超，一般不超 過過30%，而三聚氰胺含氮量為，而三聚氰胺含氮量為66.7。 2、三聚氰胺為白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，、三聚氰胺為白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道， 摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，但是尿素等卻有氣味，摻入后容易摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，但是尿素等卻有氣味，摻入后容易 被檢測出來被檢測出來 若以合格奶粉蛋白質(zhì)含量為若以合格奶粉蛋白質(zhì)含量為18%計算，則含氮量為計算，則含氮量為 2.88%。 三聚氰胺含氮量是牛奶的三聚