分子診斷在乙肝診療中應(yīng)用

1、乙肝檢測指標(biāo) 在臨床診療中的應(yīng)用 乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā) Reverse Trancriptio n 乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā) Reverse Trancriptio n 病毒顆粒 上裝配 乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā) Reverse Trancriptio n HBsAg “空殼” 乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā) Reverse Trancription 人基因組 持續(xù)分泌 Reverse Trancription HBeAg的形成僅 在一個途徑上與 HBsAg相同 乙肝病毒復(fù)制周期給我們的啟發(fā) 乙肝病毒復(fù)制周期給我們的3點啟發(fā) HBV cccDNA是真正的“核心” HBsAg的形成

2、有三個獨立的 “路徑” p與病毒顆粒不完全相關(guān) p與rcDNA水平不呈比例關(guān)系 HBeAg與rcDNA并非一條 “通路”，與HBsAg合成路徑 亦非同道，其水平不與HBsAg 呈比例關(guān)系 Reverse Trancription 停藥與停藥后復(fù)發(fā) 是個令人困惑的問題 治療終點 = 停藥標(biāo)準(zhǔn) ？ 治療終點 = 治愈標(biāo)準(zhǔn) ？ 所以我們不斷地和回顧性尋找“預(yù)測、評估” 療效和“預(yù)測、評估”治愈（不復(fù)發(fā)）的各種指 標(biāo)和現(xiàn)象 目 錄 乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義 乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義 各國指南對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述 目 錄 乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義 乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義 各國指南

3、對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述 2012 EASL指南對治療目標(biāo)的描述 治療目標(biāo) 防止疾病進(jìn)展為肝硬化、失代償肝硬化、終末期肝病、 HCC和死亡，從而改善生活質(zhì)量和提高生存率 實現(xiàn)目標(biāo) 持續(xù)抑制HBV復(fù)制 但是，因cccDNA 持續(xù)存在于感染的肝細(xì)胞核，HBV不可能 完全清除，必須長期抑制病毒復(fù)制 另外，HBV基因整合至宿主基因組，HCC很難完全避免 2012 EASL指南關(guān)于治療終點的描述 慢乙肝患者的治療終點： 理想的治療終點：HBeAg陽性和陰性患者在停藥后持久HBsAg消失，伴 有或不伴有抗-HBs血清學(xué)轉(zhuǎn)換 (A1) 滿意的治療終點：基線HBeAg陽性患者獲得持久抗-HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換或

4、基線HBeAg陰性在停藥后持久的病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答，且HBeAg持續(xù) 陰性 (A1) 次滿意的治療終點：未獲得抗-HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換的HBeAg陽性患者以及 HBeAg陰性患者，經(jīng)過長期抗病毒治療，達(dá)到持續(xù)的病毒學(xué)抑制 (A1) 最希望達(dá)到的治療終點：達(dá)到持續(xù)的病毒學(xué)抑制（用最靈敏方法檢測不 到HBV-DNA ）（A1）。 當(dāng)前的實際情況是，理想的終點只是一個“理想”，大多數(shù)患者能達(dá)到 “次滿意”終點，“滿意”者也很困難 2012 APASL指南對治療目標(biāo)的描述 主要治療目標(biāo)(Primary aim) ：持久抑制HBV復(fù)制 達(dá)到“初始應(yīng)答”，即HBeAg血 清學(xué)轉(zhuǎn)換和/或HBV DNA抑制， A

5、LT復(fù)常，并預(yù)防肝功失代償， 保證“維持/持久應(yīng)答”，降低 治療期間或治療后肝臟壞死性炎 癥和肝纖維化的發(fā)生 預(yù)防肝臟失代償、減少或預(yù)防疾 病進(jìn)展到肝硬化和/或HCC，并 延長生存期 2012 APASL指南關(guān)于治療終點的描述 對應(yīng)用核苷酸類藥物治療的HBeAg陽性者，當(dāng) HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，且HBV-DNA至少12個月低 于檢測水平(10-15 IU/ml)時，可以考慮停藥。 對HBeAg陰性者，若HBsAg持續(xù)陽性，若患者已 治療2年，且3次HBV-DNA不可測不可測(間隔6個月)， 可考慮終止治療。 2010中國指南對治療終點的描述 HBeAg陽性患者 HBV DNA低于檢測下限、AL

6、T復(fù)常、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換鞏固至 少1年（經(jīng)過至少2次復(fù)查，每次間隔6個月）仍保持不變且總療 程至少已達(dá)2年者，可考慮停藥，但延長療程可減少復(fù)發(fā) HBeAg陰性患者 HBV DNA低于檢測下限、ALT復(fù)常至少再鞏固1年半（經(jīng)過至少 3次復(fù)查，每次間隔6個月）仍保持不變、且總療程至少已達(dá)到2 年半者，可考慮停藥。 當(dāng)前的實際情況是，即使達(dá)到“終點”，停藥后復(fù)發(fā)的比 例很大，少有人能在2年或年停藥 目 錄 乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義 乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義 各國指南對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述 乙肝檢測指標(biāo)在診療中的應(yīng)用 高靈敏度HBV DNA定量 （內(nèi)標(biāo)法） 感染早期判斷 病情監(jiān)測 藥物

7、療效判斷 用藥方案指導(dǎo) 停藥判斷 HBV基因分型 病情預(yù)后發(fā)展評估 抗病毒藥物療效判斷 cccDNA檢測 確定病毒清除 判斷停藥時間 判斷肝外組織感染 乙肝耐藥全基因測序 （測序法） 抗藥監(jiān)測 治療藥物選擇 HBsAg定量檢測 （全定量） 乙肝兩對半定量檢測 療效預(yù)測 療效監(jiān)測 乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義 HBeAg消失與血清轉(zhuǎn)換 HBeAg“陰轉(zhuǎn)”與乙肝病毒的基因型有關(guān)，與治療有相關(guān) 性 A型（北美、歐洲）：HBeAg陰性乙肝比例高 D型（地中海和中東）：HBeAg陽性和陰性乙肝比例近似 B型和C型（遠(yuǎn)東）：HBeAg陽性乙肝比例較高 亞洲兒童HBeAg自發(fā)血清轉(zhuǎn)換率： 3歲：2%/年 3

8、歲：4-5%/年 近90%的HBsAg攜帶者中，在其15-20歲期間保持HBeAg 陽性；隨著年齡增長，HBeAg陽性率逐漸下降，在40歲 的人群中，HBeAg陽性率10% LiawYF. HBeAg seroconversion as an important end point in the treatment of chronic hepatitis B. Hepatol Int (2009) 3:425433 在“計算”抗病毒藥物HBeAg消失和 血清轉(zhuǎn)換率時，必須納入這些因素 采用HBeAg定量預(yù)測PegIFN治療者 HBeAg血清轉(zhuǎn)換 患者來自一項隨機、多中心、III期注冊研究的數(shù)

9、據(jù)分析 對其中271例HBeAg陽性且用Peg-IFN-2a+口服安慰劑 治療48周的患者回顧性地進(jìn)行HBeAg定量檢測 HBeAg定量檢測用微粒子酶免疫分析，并以來自Paul Ehrlich Institute (PEIU/mL)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn) 基線、治療12周和24周HBeAg水平 與HBeAg血清轉(zhuǎn)換的相關(guān)性 基線HBeAg定量低的患者 獲得HBeAg血清轉(zhuǎn)換率高 治療12周時，HBeAg 10PEIU/ml的患者中 53%在停藥24周時獲得 HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換 治療24周時，HBeAg水 平越低，停藥后獲得血清 學(xué)轉(zhuǎn)換率越高 HBsAg自發(fā)清除率：亞洲0.12-2.38% Chia-Min

10、g Chu，Yun-Fan Liaw Antiviral therapy,2010;15:133-143 HBsAg定量：Why and how to use? qHBsAg預(yù)測干擾素的療效 (HBeAg陽性) n干擾素治療12周，HBsAg無明顯下降的患者預(yù)示可能出現(xiàn)不應(yīng)答 n干擾素治療24周，HBsAg下降明顯的患者預(yù)示干擾素療效良好 (12/92) (9/92) (31/114) (117/510)(173/510) (46/114) (112/510)(66/510) (21/114)(16/114) (63/202)(51/209) (97/399) qHBsAg預(yù)測干擾素的療效 (

11、HBeAg陰性) n患 者 在 1 2 W 時 qHBsAg下降10%的患 者，病毒學(xué)應(yīng)答率低 ( 1 6 % v s 4 7 % , P0.01) qHBsAg預(yù)測干擾素的療效 (HBeAg陰性) n患 者 在 1 2 W 時 qHBsAg下降10%的患 者，5年HBsAg消失率 低 ( 5 % v s 2 3 % , P0.01) qHBsAg預(yù)測NUCs療效 NA治療，qHBsAg下降緩慢且與HBV DNA下降的水平無 相關(guān)性 但在NA治療期間，尤其是在獲得VR后，HBsAg 快速下 降，預(yù)示著患者長期治療后可獲得HBsAg清除 每6-12月HBsAg定量可以作為NA治療中的監(jiān)測指標(biāo) 亞

12、洲人群中（B、C型），qHBsAg100IU/ml者，停藥 后復(fù)發(fā)的可能性小，可據(jù)此作為停藥依據(jù)，但需要更多的 多中心研究來證實 本研究是文獻(xiàn)回顧，數(shù)據(jù)也是來自回顧 從HBV復(fù)制周期與看NUC 對HBsAg的清除 pNUC治療阻斷逆 轉(zhuǎn)錄，選擇性地抑 制HBV病毒顆粒的 合 成 ； 但 由 于 cccDNA 的長期存 在 ， 不 能 降 低 HBsAg水平 目 錄 乙肝檢測指標(biāo)作療效預(yù)測的意義 乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義 各國指南對乙肝治療終點和目標(biāo)的描述 乙肝檢測指標(biāo)在診療中的應(yīng)用 高靈敏度HBV DNA定量 （內(nèi)標(biāo)法） 感染早期判斷 病情監(jiān)測 藥物療效判斷 用藥方案指導(dǎo) 停藥判斷 HBV

13、基因分型 病情預(yù)后發(fā)展評估 抗病毒藥物療效判斷 cccDNA檢測 確定病毒清除 判斷停藥時間 判斷肝外組織感染 乙肝耐藥全基因測序 （測序法） 抗藥監(jiān)測 治療藥物選擇 HBsAg定量檢測 （全定量） 乙肝兩對半定量檢測 療效預(yù)測 療效檢測 乙肝檢測指標(biāo)作治療終點的意義 高靈敏HBV-DNA定量在臨床中的應(yīng)用 開始治療 治療12周 治療24周 基于HBV DNA、ALT水平和疾病發(fā)展階段 是否存在原發(fā)性無應(yīng)答 （HBV DNA較基線降低不到1 log10） 完全病毒學(xué)應(yīng)答 2000 IU/ml 改用或加用更強藥物 每3個月監(jiān)測HBV DNA 治療終點 達(dá)到持續(xù)的病毒學(xué)抑制 （用最靈敏方法檢測不到

14、HBV-DNA ） 常規(guī)定量PCR檢測下限偏高，無法準(zhǔn)確評價治療應(yīng)答 情況及判斷治療終點，使得治療后臨床復(fù)發(fā)率高 HBV DNA （0-20 IU/ml） HBV DNA （500 IU/ml） 更準(zhǔn)確檢測低濃度病毒 判斷治療終點，避免假陰性 HBV DNA （20-1.7108 IU/ml） HBV DNA （103-107 IU/ml） 線性范圍更寬，可以更準(zhǔn)確 地檢測低濃度與高濃度的 HBV DNA 高靈敏度定量常規(guī)定量PCR優(yōu)勢 檢出限 線性范圍 目前監(jiān)測HBV-DNA中存在的問題 “HBV DNA定量檢測需要高靈敏度方法 （最低值為20 IU/ml以下）” “一個能夠偵測10-15

15、IU/ml 的real-time PCR方法是 最好的疾病監(jiān)測的工具” 2011 EASL指南 要進(jìn)行高敏感度HBV DNA定量檢測 COBAS HBV 430例血漿 Real time PCR HBV20 IU/mL 208/430(48.4%) 1000 copies/mL Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV病毒載量系統(tǒng)對慢性乙型肝炎抗病毒治療監(jiān)測的意義 李敏偉 沃健兒 倪淑君 王 靜 李蘭娟 浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點實驗室Data on file 普通乙肝病毒定量檢測假陰性率高達(dá)36.7% 64/222 （28.38%） E+02 copies

16、/mL 107/222 （48.20%） E+03 copies/mL 35/222 （15.77%） E+04 copies/mL 7/222 （3.15%） E+05 copies/mL 2/222 （0.9%） E+07 copies/mL 7/222 （3.15%） E+06 copies/mL 華西醫(yī)院采用COBAS TaqMan HBV檢測20例治療48周 普通PCR報告HBV DNA1000 copies/ml樣本的結(jié)果分析 20例患者組成特點 -9例服用ETV、11例服用ADV（48周） -10例eAg陽性、8例eAg陰性患者、 2例1,5陽患者 檢測試劑病例數(shù)HBV DNA分

17、布范圍 國產(chǎn)HBV20例1000 copies/ml CAP/CTM HBV 11例 8例* 1例 Target Not Detected 103104 copies/ml 104105 copies/ml *包括1例服用ETV患者 普通PCR法 “假陰性”率高 達(dá)45% (9/20) 高靈敏度HBV-DNA定量 幫助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確監(jiān)測療效及判斷治療終點 高靈敏度HBV-DNA定量檢測是國內(nèi)唯一滿足治療指南和專家共識 的HBV-DNA檢測項目 高靈敏度HBV-DNA定量 檢測下限：020 IU/ml COBASAmpliPrep/ COBASTaqMan 分析儀 2007年美國新修訂的慢性乙型肝炎病毒感染處理治療規(guī)范, 推薦優(yōu)先選用