分子診斷學重點內(nèi)容

1、分子診斷學重點內(nèi)容( Navy )1、分子診斷學( molecular diagnostics )是利用分子生物學技術(shù)來研究機體外源性 和內(nèi)源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達調(diào)控的改變，從而為疾病的預 測、預防、診治和轉(zhuǎn)歸提供分子水平信息。2、 基因：是一段攜帶功能產(chǎn)物(多肽，蛋白質(zhì)，tRNA和rRNA和某些小分子RNA信 息的DNA片段，是控制某種性狀的的遺傳單位。3、密碼子偏愛( codon bias )指在不同物種的基因中經(jīng)常為某種氨基酸編碼的只是其中的一個密碼子。當鑒別到一個ORF時，密碼子偏愛常常用來確定這個ORF是否是一個基因。4、基因組( genome)： 指一個細胞或

2、生物體的一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)。5、 C值矛盾：生物體的進化程度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象稱為C值矛盾 也稱 C值佯謬(C value paradox )6、 N值矛盾：基因組中基因數(shù)目與生物進化程度或復雜程度的不對稱性，稱為N值矛 盾或 N 值佯謬( N value paradox )。7、基因組計劃 是指以獲得某物種基因組全序列為主要目標的科學計劃。8、厘摩爾根(cM)即重組頻率為1%勺兩個基因間的遺傳距離9、基因組學(Ge no mics)指對所有基因進行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、 轉(zhuǎn)錄圖譜)核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學。10、鑒別蛋白質(zhì)編碼基因的

3、五項標準是什么？ 開放閱讀框、密碼子偏愛、序列保守性、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、基因失活11、原核生物 是細菌等原始生物的總稱，是最簡單的細胞生物體12、質(zhì)粒： 獨立于細菌細胞染色體以外，能自主復制并穩(wěn)定遺傳的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)分子，稱為質(zhì)粒(plasmid)13、瓊脂糖凝膠電泳泳動速度：超螺旋DNA分子 線性DNA分子 半開環(huán)DNA分子14、 接合作用(conjugation)當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞(細菌)轉(zhuǎn)移至另一細胞(細菌)的DNA專移稱為接合作(conjugation)。15、 轉(zhuǎn)化作用(transformation)通過自動獲取或人為地供給外源D

4、NA使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 。16、轉(zhuǎn)導 : 以噬菌體為媒介把細菌的基因從一個細菌細胞轉(zhuǎn)移到另一個細菌細胞的過程. 一般是針對溫和噬菌體 , 溶血性噬菌體則不會發(fā)生轉(zhuǎn)導 .17、轉(zhuǎn)染 : 病毒侵入宿主細胞過程 . 對原核生物說 , 轉(zhuǎn)染是噬菌體侵入細菌細胞的過 程18、轉(zhuǎn)座： 由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座 (transposition)19、 轉(zhuǎn)座因子可移動的基因成分，即能在一個DNA分子內(nèi)部或兩個DNA分子之間移動的DNA片段，稱為轉(zhuǎn)座因子(transposable element )在細菌中，指可在質(zhì)粒和染色

5、體之間或質(zhì)粒和質(zhì)粒之間可移動的DNA片段20、轉(zhuǎn)座因子的分類： 插入序列、轉(zhuǎn)座子、可轉(zhuǎn)座的噬菌體21、 基因轉(zhuǎn)移的方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)染22、真核生物基因組的一般特征(一)基因組龐大(二)線狀雙鏈 DNA和二倍體(三)非編碼區(qū)遠多于編碼區(qū)(四)斷裂基因( split gene )(五)大量重復序列存在23、衛(wèi)星DNA由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開，因而稱為衛(wèi)星 DNA (或隨體DNA24、 中度重復序列片段較長(100-幾千bp)具有種屬特異性，可作為 DNA標記25、基因家族 (gene family) 一組功能相似且核苷酸序列具有同源性

6、的基因，在進化過 程中從一個祖先基因經(jīng)重復和突變演變而來的。26、假基因( pseudogene) 與具正常功能的基因序列相似，但無轉(zhuǎn)錄功能或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 無功能的基因。27、所有組蛋白基因都不含內(nèi)含子，而且組蛋白基因序列都很相似，從而編碼的組蛋 白在結(jié)構(gòu)上和功能上也極為相似28、質(zhì)粒與核DNA區(qū)別：1.非孟德爾的母系遺傳 2. 高突變率 3. 異質(zhì)性和復制分離4. 閾值效應 5. 半自主復制與協(xié)同作用29、線粒體?。?由于線粒體呼吸鏈功能不良所導致的臨床表現(xiàn)多樣化的一組疾病。30、 CpG島：大約有一半的人類基因富含 CpG的順序，稱為CpG島31、 單核苷酸的多態(tài)性 ( single nucl

7、eotide polymorphism, SNP)主要用途： 疾病的連鎖分析與基因的定位 指導用藥和藥物設計 用于進化和種群多樣性的研究32、短串聯(lián)重復序列 ( short tandem repeat , STR)STR 在人類基因組內(nèi)平均 15-20kb 就有一個 STR 點位，占基因組的 10%， 多存在于非編碼區(qū)及內(nèi)含子中。主要用途：人類基因遺傳圖譜的制作。目的基因篩選和基因診斷。法醫(yī)學個體識別和親權(quán)鑒定。33、病毒( virus ) 是一類比較原始的、有生命特征的、能夠自我復制的、嚴格細胞內(nèi) 寄生的非細胞生物，是結(jié)構(gòu)最簡單、最微小的生命形式。34、 末端正向重復序列 又稱末端冗余(te

8、rminal redundancy )是指雙鏈DNA分子兩 端有一段相同的核苷酸序列35、 末端反向重復序列( inverted terminal repeat，ITR) 指病毒基因組兩端的反向 互補重復序列。 ITR 可能與病毒的復制、轉(zhuǎn)錄及整合有關36、重疊基因：許多病毒基因組的一段 DNA序列有兩個或兩個以上的開放讀碼框架，可以編碼兩種或兩種以上的多肽鏈，稱為重疊基因37、 分段基因組：指病毒基因組由數(shù)條不同的核酸分子組成，多見于RNA病毒38、 乙肝病毒(hepatitis B virus ，HBV是目前已知感染人類的最小的雙鏈DNA病毒39、 RNA病毒基因組為線狀單鏈或雙鏈，正鏈R

9、NA病毒基因組均為線狀 RNA分子僅HDV勺負鏈RNA病毒基因組為環(huán)狀，其余的負鏈RNA病毒均為線狀40、 正鏈RNA病毒：基因組序列與 mRNA!同，可直接作蛋白質(zhì)合成的模板，此類RNA 病毒具有侵染能力41、負鏈RNA(-RNA)病毒：基因組序列與 mRNAi補，基因組只有在其核衣殼蛋白轉(zhuǎn) 錄酶存在下，才具有侵染能力42、 蛋白質(zhì)組 是指特定細胞、組織乃至機體作為一個生命單元中所擁有蛋白質(zhì)的集合, 即生命體中攜帶的基因信息在某一時段所表達的全部蛋白質(zhì)。43、蛋白質(zhì)組學 是指對在特定的時間和環(huán)境下所表達的群體蛋白質(zhì)研究的一門學問。主要在蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)的表達模式、作用模式、功能機制、調(diào)

10、節(jié)控制以及蛋 白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用。是在生物體或其細胞的整體蛋白質(zhì)水平上進行的,并從一個機體或一個細胞的蛋白質(zhì)整體活動來揭示生命的規(guī)律。44、二維凝膠電泳 是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分離技術(shù)。它由兩向電泳組成 ,第一 向以蛋白質(zhì)電荷差異為基礎進行分離的等電聚焦凝膠電泳 , 第二向是以蛋白質(zhì)分子量差 異為基礎的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。45、 質(zhì)譜技術(shù) 是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量、電荷比值(質(zhì)荷比,m/z)差 異來確定分子量的技術(shù)。46、凝膠滯后實驗 是近年來發(fā)展起來的用聚丙烯酰胺凝膠電泳直接分析核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的簡單、快速、敏感方法。通過蛋白質(zhì)與末端標記的核酸探針特異性結(jié)合,

11、電泳時這種復合物較無蛋白結(jié)合的探針在凝膠中的泳動速度要慢 ,即表現(xiàn)為相對滯后。47、細胞的破碎方法機械法 ：液體剪切法與固體剪切法本法不適合于染色體DNA的分離與純化非機械法 ：干燥法與溶胞法溶胞法溫和，能保證較高的得率與較好地保持核酸的完整性而得到廣泛的應用48、核酸的分離與純化應去除的污染物主要包括非核酸的大分子污染物非需要的核酸分子在核酸的分離純化過程中加入的對后繼實驗與應用有影響的溶液與試劑49、核酸濃縮最常用的方法 - 沉淀。其優(yōu)點很容易地調(diào)整核酸溶液至所需濃度，能去 除部分雜質(zhì)與某些鹽離子。50、核酸沉淀的洗滌：用 70%- 75%勺乙醇51、 核酸濃度測定 紫外分光光度法：適用于

12、0.25 口 g/ml的核酸溶液52、熒光光度法：用溴化乙錠（EB）。靈敏度可達1ng5ng,適合低濃度核酸溶液的 定量分析。SYBR Gold作為一種新的超靈敏熒光染料，可檢出 20pg的雙鏈DNA53、核酸純度鑒定（1） 紫外分光光度法： A260/A280純DNA比值為1.8，純RNA:匕值為2.0。比值升高與降低均表示不純。比值為1.8的DNA溶液不一定為純的 DNA溶液一般28S RNA的熒光強度約為18S RNA的2倍，否則提示有 RNA的降解。如果在加樣槽附近有著色條帶，則說明有DNA的污染。54、核酸的保存DNA的保存 DNA溶于TE緩沖液中在-70 C可以儲存數(shù)年。RNA的保

13、存 RNA可溶于0.3mol/L NaAc溶液或雙蒸水中，在-70 C至-80 C保存。以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA可延長保存時間。RNA沉淀溶于70%乙醇或去離子甲酰胺 液中，可在-20 C中長期保存。55、基因組DNA分離與純化的方法酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒纏繞法、其他 DNA快速提取法56、裂解緩沖液中各成分的作用：EDTA二價金屬離子螯合劑，可抑制 DNA酶活性，并降低細胞膜的穩(wěn)定性。SDS陰離子去污劑，可降解細胞膜、乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使它們沉淀，同時降解DNA酶。無DNA酶的RNA酶：可有效水解 RNA而避免DNA的消化蛋白酶K:水解蛋白質(zhì)，可消化 DNA酶和細胞中的

14、蛋白質(zhì)。酚：可使蛋白變性沉淀、抑制 DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液：能保證抽提后DNA進入水相，而避免滯留于蛋白質(zhì)層。57、甲酰胺是一種離子化溶劑 , 其作用：裂解蛋白質(zhì)與DNA的復合物、使釋放的蛋白質(zhì)變性、對蛋白酶K的活性無顯著影響58、 玻璃纏繞法得到的 DNA用途：構(gòu)建基因組 DNA文庫、Southern印跡、PCR擴增59、從瓊脂糖凝膠中回收 DNA片段DEAE千維素膜插片電泳法操作簡單、對小于5kb片段回收率好、回收 DNA屯度高、 但不能回收單鏈 DNA不適于大于15kb的DNA片段回收。電泳洗脫法 液氮冷凍擠壓法 低熔點瓊脂糖凝膠塊回收法 商品試劑盒 （柱層析）60、 從

15、聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段標準方法：壓碎與浸泡法本法能很好地回收v 1kb的單鏈或雙鏈DNA61、 堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA基本原理：pH12.6高堿性條件下，染色體 DNA和質(zhì)粒DNA 都變性，但質(zhì)粒DNA超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補鏈不會完全分離。當以pH4.8的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒 DNA又恢復到原來構(gòu)型，保存在溶 液中。 染色體DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。62、質(zhì)粒純化： CsCl-EB 等密度梯度超速離心法 （標準方法 ）63、聚乙二醇（PEG）沉淀法優(yōu)點

16、:簡單、經(jīng)濟、適用廣泛，尤其對堿裂解法提取質(zhì)粒的純化效果好.適用 : 分子克隆中所有常規(guī)的酶學反應、高效的哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染。缺點：不能有效分離帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA與閉環(huán)質(zhì)粒DNA64、總RNA的分離與純化：（異）硫氰酸胍-酚氯仿法總RNA提取法中最常使用的是一步法。（異）硫氰酸胍-酚氯仿法是經(jīng)典的一步法65、 同時制備RNA DNA與蛋白質(zhì)的一步法： 是（異）硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進方 法。 （異） 硫氰酸胍 -酚的單相裂解試劑裂解細胞，再加入氯仿后形成兩相。變性的 DNA 與蛋白質(zhì)位于兩相的界面。上層水相-RNA :通過異丙醇沉淀與 75沱醇洗滌而獲得。可用于mRNA勺純化、Nort

17、hern雜交、逆轉(zhuǎn)錄和 RT-PCF反應等。處于界面的 DNA與蛋 白質(zhì)可通過乙醇和異丙醇分級沉淀出來。制備的DNA:作PCR反應模板，蛋白質(zhì)樣品：主要用于免疫印跡。66、DNA重組（DNA recomb in atio n ）不同來源的DNA分子，通過磷酸二酯鍵連接而重 新組合的過程67、重組DNA在體外用限制性內(nèi)切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA分子。68、克隆( clone )由一個細胞經(jīng)過無性繁殖以后形成的子代群體。69、DNA分子克隆：構(gòu)建DNAt組體并導入宿主細胞建立無性繁殖體系70、基因克?。?重組的DNA

18、分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段的過程。71、 限制性內(nèi)切酶：一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序 列, 識別序列一般具雙重對稱性 ( 回文結(jié)構(gòu) ) .72、 限制性內(nèi)切酶的主要用途：改造和組建質(zhì)粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析73、DNA連接酶(DNA ligase) 基因工程的縫紉針催化雙鏈DNA一端的3 -OH與另一雙鏈DNA5端的磷酸根形成 3, 5磷酸二酯 鍵，使具有相同粘末端或平端的 DNA末端連接起來。T4噬菌體DNA連接酶-常用大 腸

19、桿菌DNA連接酶-少用74、 堿性磷酸酶：催化DNA RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的5 磷酸基團水 解。75、載體(Vector)攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。76 、載體具備的條件 宿主細胞中有自主復制能力或能整合到宿主染色體上與基因組一同復制的能力； 有合適的限制性酶切位點供外源DNA片段插入 分子量不宜過大，便于容納較大的外源DNA片段并獲得較高的拷貝數(shù)，也利于體外重組操作； 具有合適的篩選標記，如抗藥性、酶基因、營養(yǎng)缺陷型或形成噬菌斑的能力等； 配備與宿主相適應的調(diào)控元件，如啟動子、增強子和前導序列等。77 、用作克隆載體的理想質(zhì)粒一般具備的特點：具有松馳型

20、復制子；復制子外存在多克隆位點；具有插入失活的篩選標記，如Ampr和Tetr ;分子量相對較小但有較高的拷貝數(shù)。78、噬菌體(Bacteriophage , phage)是一類細菌病毒的總稱，即感染細菌的病毒。 噬菌體嚴格依賴于細菌宿主細胞生長與繁殖,一旦脫離宿主細胞,盡管可以生存但不 能生長與復制。79、噬菌粒（phagemid）是一類由質(zhì)粒與單鏈噬菌體結(jié)合而成的載體。常用的噬菌粒 有 pUC118 /pUC119 和 pTZ19U 80、黏粒（cosmid ）又稱柯斯質(zhì)粒，是一種以入噬菌體為基礎，專門為克隆大片段而 設計、并和質(zhì)粒共同構(gòu)建的雜合載體。黏粒載體具有質(zhì)粒和噬菌體載體的雙重特性；

21、 具有高容量的克隆能力（3145kb）;具有與同源序列質(zhì)粒進行重組的能力。黏粒主 要同于真核細胞基因組文庫的構(gòu)建。81、構(gòu)建基因組文庫多用入噬菌體和黏性質(zhì)粒作為載體；構(gòu)建cDNA文庫和克隆較小DNA片段常用pUC系列質(zhì)粒；M13噬菌體則用于克隆一些待測的 DNA序列。82、轉(zhuǎn)化作用（transformation）將重組的DNA分子引入細菌（原核細胞）,使其在細菌體內(nèi)擴增及表達的過程83、轉(zhuǎn)染作用（transfection）將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA重組體導入真核細胞的過程 84、在生長過程中只有某一階段的細菌才能成為轉(zhuǎn)化的接受體，這稱為 感受態(tài) （competent） 細菌。細菌

22、的感受態(tài)可誘導產(chǎn)生，如氯化鈣法就可誘導細菌成為感受態(tài)。 感受態(tài)細菌表面其正電荷增加，細胞壁和膜通透性增加，有利于 DNA分子吸附與吸收85、PCR技術(shù)的基本原理： 在合適的緩沖體系中,通過加熱使模板 DNA雙鏈中的氫鍵斷 裂形成單鏈，這個過程稱為變性。在合適的溫度條件下，特異性引物與模板DNA根據(jù)堿基互補的原則形成雙鏈，這個過程稱為退火。在DNA聚合酶的作用下，引物延伸，形成新的DNA鏈。如此循環(huán)往復，經(jīng)過多個循環(huán)后，模板DNA在 2個特異性引物之間的序列就會大量擴增。86、PCR技術(shù)的特點：高度的靈敏性、特異性、操作簡便易行、用途廣泛87、 PCR反應體系的影響因素：DNA模板、弓I物、Ta

23、q DNA聚合酶、dNTR緩沖液、熱 循環(huán)參數(shù)88、PCR 擴增產(chǎn)物的檢測和分析：Gel electrophoresis 、 Restriction endonuclease 、 Single strand conformation polymorphism（ SSCP）、 Nucleic acid sequence 、 Molecular hybridization 89、熒光定量PCR:通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針 ,對PCR產(chǎn)物進行標記 跟蹤,實時在線監(jiān)控反應過程 ,結(jié)合相應的軟件可以對結(jié)果進行分析 ,計算待測樣品的初 始模板量 90 、基線： 是擴張曲線的水平部分91、CT值：

24、從基線到指數(shù)增長期的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)92、絕對定量： 用于確定未知樣品中某個核酸序列的絕對量值，即通常說的拷貝數(shù)。93 、相對定量： 用于測定一個測試樣本中目標核酸序列與校正樣本中同一序列表達的 相對變化94、熒光定量實時PCR與普通PCR的比較 實時在線監(jiān)控 ：對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控 , 能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加 , 直觀地看到反應的對數(shù)期降低反應的非特異性：使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高了 PCR反應的特異性增加定量的精確性： 全程監(jiān)控 , 準確的算法進行定量結(jié)果分析更加快捷方便 , 無需跑膠95、PCR-AS*測基因點突變：是利用PCR技術(shù)擴增靶基因的適當片

25、段,然后用人工合成的含突變位點的標記寡核苷酸探針雜交96 、臨床基因擴增檢驗實驗室衛(wèi)生部批準項目 ：二級醫(yī)院以上 HBV、 HCV、 TB、 CT、 HIV、 HLA97 、 標準臨床基因擴增檢驗實驗室必須包括四個工作區(qū)域 （working zones） ： 試劑貯存和準備區(qū) 標本制備區(qū) 擴增反應區(qū) 產(chǎn)物分析區(qū) 四區(qū)須互相獨立，并嚴格按照上述順序設置，并遵循單一走向的工作區(qū)域。98、環(huán)境污染處理 （Contamination around circumstances） ： 稀酸或消毒液處理法、紫外線照射法99、 反應液污染的處理： 在PCR反應液（不含Taq DNA聚合酶和模板）中加入0.5u

26、DNase I或核酸內(nèi)切酶（如 10u的Msp I ），室溫下 30-60分鐘。加熱滅活 DNaseI或核酸內(nèi)切酶，再加入 Taq DNA聚合酶和模板做PCR100 、 變性（ denaturation ）在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開， 形成無規(guī)則線團，雙鏈解鏈成為單鏈。101、變性核酸的特點： 粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加102、融解溫度（Tm在DNA熱變性時，其A260的升高達最大值一半時的溫度103、 影響Tm的因素：DNA堿基的組成、溶液的離子強度、pH值、變性劑104、復性：變性DNA經(jīng)過一定處理重新形成雙螺旋的過程。105、 影響復性速度的因素：

27、DNA濃度、DNA片段的大小、DNA片段復雜性、合適的復性溫度、適當?shù)碾x子強度106 、 雜交： 兩條來源不同，但具有互補序列的核酸，按堿基配對原則復性形成一個 雜交體，這個過程即雜交，或稱分子雜交。107 、 探針（ probe ） 指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測 的分子。108 、基因探針： 指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補雜交，雜交后又能被特殊方法 檢測的已知被標記(同位素或非同位素標記)的核苷酸鏈。109 、 各類探針特點：基因組DNA探針：無性繁殖、制備方法簡單；不易降解(與RNA比較)；標記方法成熟。cDNA探針(complementary DNA):不含

28、內(nèi)含子及高度重復序列但不易獲得RNA探針：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性，雜交較少,未雜交探針可用RNase降解，減少本底的干擾。易降解，標記方法復雜寡核苷酸探針：可根據(jù)需要合成相應序列；探針短，序列復雜性低，分子量小，因此雜交時間短；長 度只有10 50bp，該識別序列內(nèi)1個堿基的變化可明顯降低雜 交Tm值。可大量合成，價格低，能夠用酶學或化學方法進行非放射性標記。110 、 理想的探針標記物應具備：高度的敏感性標記物與探針結(jié)合后，不影響雜交時堿基配對及探針分子的主要理化性質(zhì)；檢測方法除有高靈敏性、高特異性、假陽性綠低外，尚需考慮環(huán)境污染 少，價格低；若用酶促方法標記，應對酶的Km值影響不大

29、，以保證標記反應的效率和標記產(chǎn)物的比活性。111 、 放射性核素標志物優(yōu)點：可準確定量，靈敏度高可檢測固相介質(zhì)上 10fg(10-15g)的DNA本底低，易除 去舊探針重新雜交新探針；特異性高, 對雜交無影響缺點：短半衰期的探針要求臨時制備 , 隨用隨標、放射性遞減使探針降解、放射性對 人體有害 , 需防護、費用貴112 、 非放射性標記優(yōu)點：無放射性，對人體的危害小；探針性質(zhì)穩(wěn)定，可供長時間內(nèi)持續(xù)使用；檢測過 程快，可同時進行不同標記探針的雜交；本底較低缺點：靈敏度和特異性不如放射性探針，雜交條件受到報告基團的限制，重新雜交新 探針較困難113 、 直接放射自顯影： 在暗室中將含放射性的濾膜

30、與 X 線膠片緊密的貼在一起，放 入不透光的盒子 .114、間接放射自顯影為增加32P檢測敏感性，X線膠片被夾在增感屏和濾膜之間，增感屏是一種有彈性的塑料片，由閃爍物如鎢酸鈣覆蓋，這種物質(zhì)在受到激發(fā)時可發(fā) 光 .115 、 化學發(fā)光 是指化學反應中釋放的能量以光的形式發(fā)射出來116 、 液相雜交： 一種研究最早且操作簡便的雜交類型，應用較少117、Southern印跡雜交：是一種使凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到載體膜上的方法。118、Northern印跡雜交：將RNA羊品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移到NC膜等固相載體上，用標記的DNA或 RNA特異探針對固定在膜上的 RNA!行雜交。119

31、、 Southern 印跡雜交與 Northern 印跡雜交的異同：同：基本原理異：變性方法(N:聚乙二醛、二甲亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞；S :堿變性)120、點雜交(dot blot)/ 狹縫雜交(slot blot) :將少量RNA羊品點在 Dot和Slot雜 交濾器中的NC膜上，濾膜干燥后用 32P標記的RNA或 DNA探針進行雜交和用 X線片進 行放射性自顯影。較 Northern blot 省去了電泳和毛細轉(zhuǎn)膜過程121 、 點/ 狹縫雜交方法學評價： 僅需少量羊品、不需電泳與轉(zhuǎn)膜過程，方法快捷、適 用于同時分析多個羊品，方便雜交條件的摸索。不能檢出基因的大小或重復的程度。 本法是快

32、速確定目標基因是否存在的檢測方法。122 、 原位雜交( in situ hybridization) 應用核酸探針與組織或細胞中的核酸按堿基配對原則進行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應用組織化學或免疫組織化學方法在 顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位或基因表達的檢測技術(shù)。123、 生物芯片：將大量生物分子探針(DNA蛋白質(zhì))固定于支持物上后與帶熒光標 記的DNA羊品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分 子的數(shù)量和序列信息。124、1992對原位合成制備的 DNA芯片作了首次報道，這是世界上第一塊基因芯片。1996 年創(chuàng)造了世界上第一塊商業(yè)化的生物芯片。125 、 生物芯片的特點：

33、高通量、集成化、并行化、微型化126 、 生物芯片可以分為哪些？微陣列芯片 microarray ：基于生物分子間的親和作用基因芯片(cDNA或寡核苷酸)；蛋白質(zhì)芯片；細胞芯片；組織芯片；微流體芯片 microfluid ： 基于各種微結(jié)構(gòu)毛細管電泳芯片；PCR反應芯片；介電電泳芯片微縮芯片實驗室 lab-on-a-chip127、基因芯片(gene chip) 又稱 DNA芯片(DNA chip)或 DNA微陣列(DNA microarray) 。將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱之 為基因芯片。128、基因芯片技術(shù)步驟： 芯片制備、羊品制備、雜交反應、信號檢測

34、、結(jié)果分析。129、探針在載體表面的固定方法： 原位合成(即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針)，適用于寡核苷酸；合成后點樣，多用于大片段DNA有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA130 、雜交反應 是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行的反應產(chǎn)生一系列信息的過 程。131 、蛋白質(zhì)芯片( protein chip ) ，又稱蛋白質(zhì)微陣列 (protein microarray) ，是 用于蛋白質(zhì)功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機械點樣或共價結(jié) 合的等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼 龍膜等固相介質(zhì)上形成的生物分子點陣。132 、蛋白芯片的原理： 在待

35、分析樣品中的生物分子與蛋白質(zhì)芯片的探針分子發(fā)生雜 交或相互作用后，利用激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行高通量檢測和分析，從 而實現(xiàn)對多肽、蛋白質(zhì)及其他生物成份進行高通量檢測。133 、芯片實驗室 是將樣品制備、生化反應和檢測分析的全過程集約化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成的所謂微型全分析系統(tǒng)(micro total analysis systen,口 -TAS), 或稱“縮微芯片實驗室”( lab-on-a-chip )。134、縮微芯片實驗室特點： 分析全過程自動化、生產(chǎn)成本低、防污染、分析速度 快、所需樣品少、極高的樣品并行處理能力、體積小、重量輕、便于攜帶。135 、復雜性疾病：

36、發(fā)病原因不完全明了，由多個基因和環(huán)境因素共同參與，不符合 孟德爾遺傳規(guī)律，不僅在特定家系發(fā)病率高，而且對群體影響大，經(jīng)過多個階段才出 現(xiàn)，當出現(xiàn)典型臨床表現(xiàn)時往往已處于病程中后期，多數(shù)已失去最佳治療時期，此類 疾病成為 。136、分子診斷：以DNA和RNA為主要診斷材料，通過檢測基因的結(jié)構(gòu)或表達功能的 異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。137 、 復雜性疾病分子診斷的特點直接檢測疾病相關基因，屬病因診斷，針對性強特異性強、靈敏度高：分子雜交、PCR生物芯片、質(zhì)譜等技術(shù)適用范圍廣：遺傳疾病、腫瘤、感染、心血管等疾病138、 血漿 DNA (plasma DNA ) 又稱循環(huán) DNA (

37、 circulating DNA )，是一種無細胞狀態(tài)的細胞外 DNA (extra cellular DNA)，由長度不等的單鏈或雙鏈 DNA及其混合物組成，主要以DNA蛋白質(zhì)混合物形式存在，但也存在部分游離DNA139、斑點雜交：將待測的DNA變性后點加在硝酸纖維素膜(或尼龍膜)上，用已標記 的探針進行雜交，洗膜 (除去未接合的探針 )，放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交 強度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。140、 ASQ一種以雜交為基礎對已知突變的檢測技術(shù)。設計一段19bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，經(jīng)標記后作為探針，與固定在膜上的樣品DNA雜交。同時以野生型探

38、針(無突變)為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，則表明樣品中存在與該ASQ探針相應的點突變。用于已知突變類型的遺傳病，如地中海貧血、苯丙酮尿 癥、某些癌基因、抑癌基因點突變。141、PCR-SSCP利用PCF從提取出的DNA中擴增目標基因，用外切核酸酶消化掉一 條鏈，相同長度的單鏈 DNA因序列，甚至單個堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，在非變 性凝膠中的遷移率不同，標記后可顯影觀察。用于點突變的遺傳疾病，苯丙酮尿癥、 某些癌基因、抑癌基因點突變。142、 RFLP檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變(新產(chǎn)生和去除酶切位點)和一段DNA的重新組織(如

39、插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化)等均可導致RFLP的產(chǎn)生。143 、 簡述腫瘤的發(fā)病機制？階梯式遺傳性疾病、基因變異 、表觀遺傳學改變 、DNA損傷及其分子改變 腫瘤基因組的不穩(wěn)定性 、腫瘤中染色體的異常 、腫瘤中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性144、 癌基因分類：生長因子類；酪氨酸激酶類；GTP結(jié)合蛋白類；核蛋白類；端粒酶。145、癌基因的活化機制： 轉(zhuǎn)導；點突變；插入突變；易位；基因擴增；基因甲基化改 變。146、常見的抑癌基因：Rb基因；p53基因；APC基因147、 腫瘤分子診斷需考慮的因素： 特殊類型腫瘤的靶基因 不同腫瘤特定靶基 因的突變譜 供檢測使用的合適臨床樣本 分子診斷技術(shù)的敏感性

40、148、 肺癌相關基因改變： 基因點突變檢測： K-ras 基因和 p53 基因抑癌基因啟動子甲基化檢測：APC基因149、目前最常用的甲基化檢測技術(shù)： 甲基化特異性引物基因擴增( MSP)甲基化特異性序列分析( MSS)150、 結(jié)腸直腸癌早期分子診斷：癌基因K-ras和抑癌基因APC的突變發(fā)生在早期。糞便中K-ras突變檢測，但糞便中 K-ras突變并非全是腸源性。 CD44與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有 關。151、乳腺癌早期分子診斷：90%家族性乳腺癌涉及 BRCA1和BRCA2基因突變。152、 原發(fā)胰腺癌早期分子診斷：p53 和 CD44153、胰腺癌早期分子診斷 ： 72 % -100%的原發(fā)性

41、胰腺腺癌發(fā)生 K-ras 基因突變154、腫瘤微小殘留?。?腫瘤患者原發(fā)病灶去除后，體內(nèi)仍存在來自原發(fā)病灶的腫瘤細 胞，以單個腫瘤細胞或肉眼不可見細胞集落的形式存于腫瘤患者血液或組織中。微小 殘留病是腫瘤復發(fā)的根本原因，其分子診斷對病人的治療和預后具有重要意義。155、原發(fā)性高血壓的定義： 又稱高血壓病，是指收縮壓或舒張壓升高臨床綜合征。(1)確診高血壓指收縮壓160mmH和/或舒張壓95mmHg兩者有一項經(jīng)核實即可確診。(2)臨界高血壓指收縮壓140mmHg旦v 160mmH(或)舒張壓 90mmH但v95mmH。156、原發(fā)性高血壓的分子遺傳： 腎素基因、血管緊張素原基因、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶

42、(ACE基因、心鈉素基因157、 HLA class Iantigens (A, B & C)將內(nèi)源性多肽遞呈給 CD8陽性毒性T細胞。158、 HLA class II antigens將外源性抗原肽遞呈給 CD4陽性T細胞159、HLA的遺傳特點：單倍型遺傳、共顯性遺傳、連鎖不平衡160、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是最早應用于HLA基因分型的方法。161、序列特異性寡核苷酸探針技術(shù) (SSOP)根據(jù)固定在雜交膜上的是 PCR產(chǎn)物或特異性 探針而將其區(qū)分為正向 SSOP和反向SSOP反向雜交技術(shù)是將一套設計合理的探針固定 于雜交膜上，再與擴增產(chǎn)物雜交，因其一次雜交即可檢測所有等位基因，大大簡化了 實驗操作，從而被多數(shù)實驗室接受。162、PCR序列特異性引物(SSP)用作臨床常規(guī)分型方法163、FCM技術(shù)可定性也可定量，而且特異、敏感、快速，同其它檢測技術(shù)比較，其最 獨特的優(yōu)勢是可幾秒鐘內(nèi)同時檢測上千個細胞，因而該技術(shù)更多地應用于批量測量。 而且流式細胞術(shù) 無假陰性和假陽性 出現(xiàn)，因此該技術(shù)具有廣闊的應用前景。164、 以堿基序列為基礎的 HLA分型(SBT)直接對HLA的DNA序列進行分析比檢測其表 型更加直觀、可靠、準確。是鑒定 HLA等位基因的最理想方法。但由于測序所需設備 昂貴，故目前 尚不能作為常