PCR技術(shù)[沐風(fēng)書苑]

1、生物化學(xué)實驗技術(shù) 1業(yè)內(nèi)優(yōu)講 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR是由美國科學(xué)家是由美國科學(xué)家 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 體內(nèi)體內(nèi)DNADNA的復(fù)制體系的復(fù)制體系 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 引物引物 引物引物 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 耐熱耐熱DNADNA聚合酶聚合酶 Saiki（1988）將耐熱）將耐熱DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。模板可行。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)循環(huán) 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2+ 模板：模板：DNA 引物：引物：P1 P2 DNA

2、聚合酶：聚合酶：Taq 原料：原料：dNTP 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 輔助因子：輔助因子：Mg2+ 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 單、雙鏈單、雙鏈DNADNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制劑、聚合酶抑制劑、DNADNA 結(jié)合蛋白類。結(jié)合蛋白類。 DNADNA模板一般模板一般100ng /100100ng /100 L L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配, ,反應(yīng)特異性下降。反應(yīng)特異性下降。 0.

3、5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降酶量增加使反應(yīng)特異性下降; ;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度濃度取決于擴增片段的長度 四種四種dNTPdNTP濃度應(yīng)相等濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入, ,濃度過低則降濃度過低則降 低反應(yīng)產(chǎn)量低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTPdNTP可與可與Mg2+Mg2+結(jié)合結(jié)合, ,使游離的使游離的Mg2+Mg2+濃度下降濃度下降, ,影響影響 DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶的激

4、活劑。適宜濃度為聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-0.5- 2.5mmol/L2.5mmol/L反應(yīng)體系。反應(yīng)體系。 Mg2+Mg2+濃度過低會使?jié)舛冗^低會使TaqTaq酶活性喪失、酶活性喪失、PCRPCR產(chǎn)量下降；產(chǎn)量下降； Mg2+Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+Mg2+可與負離子結(jié)合可與負離子結(jié)合, ,所以反應(yīng)體系中所以反應(yīng)體系中dNTPdNTP、EDTAEDTA 等的濃度影響反應(yīng)中游離的等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+Mg2+濃度。濃度。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA解鏈為單鏈解鏈為單鏈 9494， 20-3020-30秒秒 溫度由引物長度和溫度由引物長

5、度和GCGC含量決定。含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合; ;降降 低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 70-75,70-75,一般為一般為7272 延伸時間由擴增片段長度決定延伸時間由擴增片段長度決定 主要取決于模版主要取決于模版DNADNA的濃度的濃度 一般為一般為25-3525-35次次 次數(shù)過多：擴增效率降低次數(shù)過多：擴增效率降低 錯誤摻入率增加錯誤摻入率增加 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 擴增量達擴增量達230230個拷貝（個拷貝（109109拷貝）拷貝） PCRPCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 引

6、物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCRPCR反反 應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和 特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 利用利用PCRPCR擴增擴增, ,只需要數(shù)小時只需要數(shù)小時, ,就可以擴增出就可以擴增出 可用可用 電泳法檢出的電泳法檢出的DNADNA，可用于檢測基因組中僅含數(shù)個拷，可用于檢測基因組中僅含數(shù)個拷 貝的模板序列。貝的模板序列。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 PCR示例示例 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)PCR

7、PCR分析的原理與技術(shù)。分析的原理與技術(shù)。 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 1 1、材料：含、材料：含1Kb1Kb插入片段的克隆載體插入片段的克隆載體Pmd18-Pmd18- T T 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA 2 2、儀器：微量移液器及吸頭、儀器：微量移液器及吸頭、PCRPCR儀及儀及PCRPCR 管管 瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備 3 3、試劑：、試劑：1010X XPCRPCR 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP 10mmol/L dNTP 10 10mol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2 二、實驗材料、儀器和二、實

8、驗材料、儀器和試劑試劑 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 1.1.按照如下體積向按照如下體積向PCRPCR管中按順序加入各試管中按順序加入各試 劑劑 并混勻：并混勻： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 質(zhì)粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水補充至 25.0 L 三、操作步驟三、操作步驟 業(yè)內(nèi)優(yōu)講 2.2.按照如下體積向按照如下體積向PCRPCR管中按順序加入各試管中按順序加入各試 劑劑 并混勻：并混勻： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 質(zhì)粒DNA 1.0 L Taq 0.1