高效液相色譜基礎(chǔ)課件

1、高效液相色譜基礎(chǔ)課件 高效液相色譜儀基礎(chǔ) 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 常見的分離方式 化學(xué)物質(zhì)成分的定性和定量分析離不開分離，我們常見 的分離方式有以下幾種：蒸餾、離心、電泳、過濾、色譜等 ，其中色譜分離是最重要和有效的手段。 色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的 各組分經(jīng)過固定相(stationary phase)時(shí)，由于與固定相發(fā) 生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng) 弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流 出。又稱為色層法、層析法。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 本世紀(jì)初，俄國科學(xué)家茨維特（M.S.Tswett）提出

2、經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法后，色譜分析法取得了迅速的發(fā)展， 3040年代發(fā)展了柱分配色譜、紙色譜， 50年代發(fā)展了氣相色譜法、薄層色譜法， 60年代發(fā)展了凝膠色譜法、高效液相色 譜法70年代發(fā)展了高效毛細(xì)柱氣相色譜 法，80年代發(fā)展了毛細(xì)管電泳、電色譜， 90年代出現(xiàn)了光色譜。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 綠色 兩種葉綠素 黃色 三種葉綠素 脫脂棉 填料 純 石油醚 液相色譜基礎(chǔ) 茨維特實(shí)驗(yàn)的原形 1906年茨維特用右邊圖示的實(shí)驗(yàn)裝置使用液 體淋洗的辦法實(shí)現(xiàn)了多種物質(zhì)的分離從而確立 了色譜分析法。從此這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法就成為： 經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法 時(shí)至今日這種方法還被廣泛地應(yīng)用著。 隨著科學(xué)技

3、術(shù)的發(fā)展，科學(xué)工作者改進(jìn)了液 相色譜柱的填料，從而就出現(xiàn)了高效液相色譜 分析。 幾種英文縮寫的解釋： HPLCHigh Performance Liquid Chromatograghy HPLCHigh Pressure Luquid Chromatograghy HSLCHigh Speed Liquid Chromatograghy HRLCHigh Resolution Liquid Chromatograghy 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn) HPLC有以下特點(diǎn)： 高壓-壓力可達(dá)1530Mpa。 高速-流速為0.110.0 ml/min。 高效-可達(dá)每米50

4、00塔板以上。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。 高靈敏度-紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。 HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)： 速度快-通常分析一個(gè)樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi) 即可完成。 分辨率高-可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。 靈敏度高-紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。 柱子可反復(fù)使用-用一根色譜柱可分離不同的化合物。 樣品量少，容易回收-樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組 分或做制備。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較 高效液相色譜法 經(jīng)典液相色譜法 柱

5、長： 1025cm 10200cm 口 徑： 210mm 1050mm 粒 度： 550um（2500目300目） 75600um（200目30目） 柱 壓 力： 220MPa 0.0010.1MPa 柱 效： 2103 5104 /m 250/m 進(jìn) 樣 量： 10-610-2g 110g 分析時(shí)間： 3分鐘1小時(shí) 120小時(shí) 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 基本概念和術(shù)語 1色譜圖和峰參數(shù) 色譜圖(chromatogram)-樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí) 間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。 基線(base line)-經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平

6、衡后，檢測(cè)器測(cè)出 一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。 噪音(noise)-基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測(cè) 器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。 漂移(drift)-基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、 流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也 會(huì)產(chǎn)生漂移。 色譜峰(peak)-組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線 上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線） 不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。 前者少見。 高效液相色譜基礎(chǔ)課

7、件 液相色譜基礎(chǔ) 基本概念和術(shù)語 色譜圖 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱 因子(symmetry factor)或不對(duì)稱因子(asymmetry factor)。中國藥典 規(guī)定T應(yīng)為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。 峰底-基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。 峰高(peak height，h)-峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。 峰寬（peak width，W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間 的距離。W4 半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處

8、的峰寬。 Wh/22.355 標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，)-正態(tài)分布曲線x1時(shí)（拐點(diǎn)）的 峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分 在流出色譜柱過程中的分散程度。小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形 瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。 峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。 基本概念和術(shù)語 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 基本概念和術(shù)語 2定性參數(shù)（保留值） 死時(shí)間(dead time，t0)-不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑） 通過色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測(cè)定死時(shí)間。 死體積(dead volum

9、e，V0)-由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定 相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定 相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池 體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為 防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0Ft0（F為流速） 保留時(shí)間(retention time，tR)-從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn) 濃度極大值的時(shí)間。 保留體積(retention volume，VR)-從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn) 濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VRFtR 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 3柱效參數(shù) 理論塔板數(shù)(

10、theoretical plate number，N)-用于定量表示色譜柱的 分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布 等）、填充狀況、柱長、流動(dòng)相的種類和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì) 。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的 峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更 為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。 N與 柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長，如果未注明， 則表示柱長為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用 調(diào)整保留時(shí)間(tR)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為

11、有效理論塔板數(shù)(N有效)。 理論塔板高度(theoretical plate height，H)-每單位柱長的方差。 實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長L和理論塔板數(shù)計(jì)算。 基本概念和術(shù)語 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 基本概念和術(shù)語 4相平衡參數(shù) 分配系數(shù)(distribution coefficient，K)-在一定溫度下，化合物在兩相間 達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。 分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。 在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換 色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))， 凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可

12、 用分配系數(shù)來表示。 在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(shí)，K只取決于 組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得 到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為 拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只 有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。 在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長，后流出色譜 柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相 差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。 在HP

13、LC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng) 相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分 離的目的。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 基本概念和術(shù)語 容量因子(capacity factor，k)-化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)， 在固定相與流動(dòng)相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。 容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（tR）是 不保留組分保留時(shí)間（t0）的幾倍。k0時(shí)， 化合物全部存在于流動(dòng)相 中，在固定相中不保留，tR0；k越大，說明固定相對(duì)此組分的容量越 大，出柱慢，保留時(shí)間越長。 容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)

14、是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性 質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、 Vm有關(guān)。由于tR、t0較Vs、Vm易于測(cè)定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用 更廣泛。 選擇性因子(selectivity factor，)-相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量 因子之比。又稱為相對(duì)保留時(shí)間（美國藥典）。 要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動(dòng)相中 的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說 ，的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間 相互作用力的差異。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜基礎(chǔ) 基本概念和術(shù)語 5分離參數(shù) 分離度(

15、resolution，R)-相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。 也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。當(dāng)W1W2時(shí)，R1。當(dāng)R1時(shí)， 稱為4分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。 R1.5時(shí)，稱為6分離，裸露峰面積為99.7%。R1.5稱為完全分離。 中國藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5。 提高分離度有三種途徑： 增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會(huì)延長保留時(shí)間、增加柱壓。 更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。 增加選擇性。當(dāng)1時(shí)，R0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。 一般可以采取以下措施來改變選擇性： a. 改變流動(dòng)相的組成及pH值； b. 改變柱溫； c. 改變

16、固定相。 改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng) 相的組成來實(shí)現(xiàn)。k趨于0時(shí)，R也趨于0；k增大，R也增大。但k不能太大， 否則不但分離時(shí)間延長，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一 般k在110范圍內(nèi)，最好為25，窄徑柱可更小些。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜的分類 液相色譜的常用分離方法鍵合相色譜法 何為鍵合相色譜法： 將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥 基上，而生成化學(xué)鍵合相，并進(jìn)而發(fā)展成鍵合相色譜法。 鍵合相色譜法的起因： 化學(xué)鍵合相色譜法是由液液分配色譜法發(fā)展起來的，分配色譜法雖然由較好的 分離效果，但是在實(shí)際使用時(shí)，

17、由于機(jī)械涂覆在載體表面的固定液的流失，使分離 能力及分離選擇性降低，而且流失的固定液也會(huì)給檢測(cè)器帶來噪聲，也不適合進(jìn)行 梯度洗脫操作。鑒于此種情況，人們就發(fā)展了鍵合相色譜。 鍵合相色譜法的優(yōu)點(diǎn)： 化學(xué)鍵合固定相對(duì)各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性何熱穩(wěn)定性。由它制備 的色譜柱柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，幾乎對(duì)各種類型的有機(jī)化合物都呈現(xiàn)良 好的選擇性，特別適用于具有寬范圍k值的樣品的分離，并可用于梯度洗脫操作。 鍵合相色譜法已經(jīng)逐漸取代了液液分配色譜法，獲得日益廣泛的應(yīng)用，在當(dāng)今 的高效液相色譜法中占有及其重要的地位。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜的分類 液相色譜的常用分離方法鍵合相色譜法 鍵

18、合相色譜法的分類： 根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜法分為正相鍵合相色譜 法和反相鍵合相色譜法。 正相鍵合相色譜法： 鍵合固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性 化合物。 反相鍵合相色譜法： 鍵合固定相的極性小于流動(dòng)相極性，適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其 應(yīng)用范圍比正相鍵合相色譜法更廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)在高效液相色譜法中，約7080 的分析任務(wù)皆由反相鍵合相色譜法來完成。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜的分類 類 型性 質(zhì) 色譜分離方式 應(yīng) 用 范 圍 烷基非極性 反相、離子對(duì) 中等極性化合物，溶于水的高極性化合物，如：小肽、蛋白質(zhì)、甾族化

19、合物（類固醇）、核堿、核苷酸、極性合成藥物等 苯基非極性 反相、離子對(duì) 非極性至中等極性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烴、酯類（鄰苯二甲 酸酯）、脂溶性維生素、甾族化合物（類固醇）、PTH衍生花氨基酸 酚基弱極性 反相 中等極性化合物，保留極性相似于C8固定相，但對(duì)多環(huán)芳烴、極性芳香 族化合物、脂肪酸等具有不同的選擇性 醚基弱極性 反相或正相 醚基具有斥電子基團(tuán)，適用于分離酚類、芳硝基化合物，其保留行為比 C18更強(qiáng)（k增大） 二醇基 弱極性正相或反相 二醇基團(tuán)比未改性的硅膠具有更弱的極性，易用水潤濕，適于分離有機(jī) 酸及其齊聚物，還可作為分離肽、蛋白質(zhì)的凝膠過濾色譜固定相 芳硝基 弱極性正

20、相或反相 分離具有雙鍵的化合物，如芳香族化合物多環(huán)芳烴 腈基 極性 正相（反相） 正相相似于硅膠吸附劑，為氫鍵接受體，適于分析極性化合物，溶質(zhì)保 留值比硅膠柱低，反相可提供與C8、C18，苯基柱不同的選擇性 胺基 極性 正相（反相、 陰離子交換 正相可分離極性化合物，如芳胺取代物，脂類，甾類化合物，氯代農(nóng)藥；反相 分離單糖、雙糖等碳水化合物；陰離子交換可分離酚、有機(jī)羧酸和核苷酸 二甲胺 基 極性 正相、陰離子 交換 正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離弱有機(jī)酸 二胺基 極性 正相、陰離子 交換 正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離有機(jī)酸 鍵合相色譜的類型及其應(yīng)用范圍 高效液相色

21、譜基礎(chǔ)課件 液相色譜的分類 使用鍵合固定相應(yīng)注意的問題 （1）硅膠鍵合相的穩(wěn)定性 鍵合相的使用壽命取決于鍵合的有機(jī)官能團(tuán)在硅膠表面的覆蓋程度，覆蓋量大或呈多分子 覆蓋層時(shí)會(huì)增加其穩(wěn)定性。通常正相鍵合相的穩(wěn)定性要低于反相鍵合相反相烷基鍵合相的 穩(wěn)定性與使用流動(dòng)相的pH值有關(guān)，通常水溶液的pH應(yīng)保持在28之間，pH8.5會(huì)引起基 體硅膠的溶解。 （2）鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性 使用鍵合相時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到，同一類型的鍵合相，因生產(chǎn)廠家不同，或生產(chǎn)批號(hào)不同，而表 現(xiàn)出不同的色譜分離特性，為此應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室中準(zhǔn)備一定數(shù)量相同批號(hào)的鍵合固定相（或色 譜柱），以保證分析結(jié)果有良好的重現(xiàn)性。 （3）鍵合相色譜分離的選擇

22、性 在反相色譜分析中，使用同一種ODS固定相，并用兩種極性參數(shù)P值相近，但由不同溶劑 組成的流動(dòng)相時(shí)，會(huì)由于“溶劑誘導(dǎo)選擇性的變化”而獲得不同的結(jié)果。 （4）鍵合相的再生 使用鍵合相色譜柱時(shí)，由于大量極性或非極性樣品的連續(xù)注入，會(huì)引起固定相對(duì)樣品的吸 附、締合等不良效應(yīng)，而使柱分離性能變差，引起峰形變寬或拖尾等現(xiàn)像此時(shí)應(yīng)及時(shí)對(duì)色 譜柱進(jìn)行再生處理。對(duì)正相鍵合相柱可用1 1甲醇氯仿流動(dòng)相來進(jìn)行再生；對(duì)反相鍵合 相柱可用甲醇流動(dòng)相再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基酰胺或約0.01mol/L無機(jī)酸水 溶液進(jìn)行再生。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜的分類 鍵合相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求 在高效液相色譜分析

23、中，除了固定相對(duì)樣品的分離起主要作用外，流動(dòng)相的恰當(dāng) 選擇對(duì)改善分離效果也產(chǎn)生重要的輔助效應(yīng)。 對(duì)流動(dòng)相的要求如下： （1）用作流動(dòng)相的溶劑應(yīng)與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性；所用溶劑應(yīng) 有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積累，引起柱性能的改變。 （2）選用的溶劑性能應(yīng)與所使用的檢測(cè)器相匹配。如紫外吸收檢測(cè)器，就不能選用 在檢測(cè)波長有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測(cè)器，就不能使用梯度洗脫 （3）選用的溶劑應(yīng)對(duì)樣品有足夠的溶解能力，以提高測(cè)定的靈敏度 （4）選用的溶劑應(yīng)具有低的粘度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)。使用低粘度溶劑，可減小溶質(zhì)的 傳質(zhì)阻力，利于提高柱效。另外從制備、純化樣品考慮，低沸點(diǎn)的溶劑易

24、用蒸 餾方法從柱后收集液中除去，利于樣品的純化。 （5）應(yīng)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證操作人員的安全。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的組成 淋洗液色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的組成 HPLC常規(guī)系統(tǒng) HPLC低壓梯度系統(tǒng)（外梯度） HPLC高壓梯度系統(tǒng)（內(nèi)梯度） 溶劑瓶高壓輸液泵六通進(jìn)樣閥液相色譜柱檢測(cè)器色譜工作站 高壓輸液泵六通進(jìn)樣閥液相色譜柱檢測(cè)器色譜工作站 溶劑瓶真空脫氣機(jī)比例電磁閥混合器 混合器六通進(jìn)樣閥液相色譜柱檢測(cè)器色譜工作站 高壓輸液泵 高壓輸液泵 溶劑瓶 溶劑瓶 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的輸液泵 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)

25、，因此對(duì)流動(dòng)相阻 力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它 是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵 、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部 件。對(duì)于一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定 ，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求 。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一 定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無 關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng) 阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前 恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注 射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，

26、應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。 輸 液 泵 的 概 述 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的輸液泵 高壓輸液泵的吸液沖程 吸液： 柱塞由泵腔向外運(yùn)動(dòng) 從單向閥進(jìn)口向上形 成較低壓力，進(jìn)口單 向閥被打開，流動(dòng)相 進(jìn)入泵腔。由于系統(tǒng) 壓力大于泵腔壓力， 出口單向閥被關(guān)閉。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的輸液泵 高壓輸液泵的排液沖程 排液： 柱塞向泵腔內(nèi)運(yùn)動(dòng)，進(jìn) 口單向閥關(guān)閉。出口單 向閥打開，流動(dòng)相進(jìn)入 色譜系統(tǒng)。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的輸液泵 單 向 閥 介 紹 進(jìn)口 單向閥 出口 單向閥 進(jìn)口單向閥安裝在泵頭的下部 出口單向閥安裝在泵頭的上部 這樣有利于氣泡的排出，閥體 是不銹鋼的，里

27、面裝寶石小球 ，安裝在閥體進(jìn)口端的是寶石 球座，在出口處裝有篩網(wǎng)。液 體向反方向流時(shí)（從上往下） 球落入寶石球座內(nèi)，阻止液體 回流。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的輸液泵 雙柱塞并聯(lián)輸出泵 原理： 雙柱塞并聯(lián)輸出泵是由二個(gè)相 同結(jié)構(gòu)的泵頭按照并聯(lián)接法而 構(gòu)成，由于凸輪的凸點(diǎn)差180 度，所以兩根柱塞桿的運(yùn)動(dòng)永 遠(yuǎn)相反，使色譜系統(tǒng)內(nèi)的流動(dòng) 相的脈動(dòng)減小，流量平穩(wěn)。 優(yōu)點(diǎn)： 兩個(gè)泵頭結(jié)構(gòu)對(duì)稱，輸出流量 脈動(dòng)小。 缺點(diǎn)： 結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，維護(hù)麻煩，成本 較高。 液體 出口 液體 進(jìn)口 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的輸液泵 雙柱塞串聯(lián)輸出泵 原理： 同樣采用凸輪、雙柱塞結(jié)構(gòu)，但是兩個(gè)泵頭 的腔體體

28、積差一倍，有單向法的泵頭稱為主 泵頭，無單向閥的泵頭稱為副泵頭，副泵頭 的體積比主泵頭小一倍。整個(gè)泵運(yùn)行時(shí)，主 泵頭泵出的液體有一半進(jìn)入了色譜系統(tǒng)另一 半儲(chǔ)存在副泵頭內(nèi)，主泵頭在吸液時(shí)，副泵 頭將儲(chǔ)存的液體泵出進(jìn)入色譜系統(tǒng)，這樣周 而復(fù)始，使色譜系統(tǒng)內(nèi)的流動(dòng)相脈動(dòng)減小， 流量平穩(wěn)。 優(yōu)點(diǎn)： 結(jié)構(gòu)較并聯(lián)泵簡(jiǎn)單，維護(hù)容易，裝配簡(jiǎn)單， 成本低。 缺點(diǎn)：脈動(dòng)比并聯(lián)泵略大。 液體 出口 液體 進(jìn)口 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的輸液泵 FL2200高壓輸液泵系統(tǒng) 步 進(jìn) 馬 達(dá) 凸輪 緩沖器 排放閥 旋鈕 壓力傳感器信號(hào) 往進(jìn)樣閥 排放 流動(dòng)相進(jìn)口 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢

29、測(cè) 器 紫 外 檢 測(cè) 器 UV-DETECTOR 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 原理：基于被分析組分對(duì)特定波長紫外光的選擇 性吸收 定量基礎(chǔ)：朗伯比耳定律，AKCL 優(yōu)點(diǎn)：1）對(duì)溫度和流速不敏感 2）可用于梯度洗提 缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì) 紫紫 外外 檢檢 測(cè)測(cè) 器器 的的 原原 理理 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 液 相 紫 外 檢 測(cè) 器 介 紹 流過池光源單色器光電轉(zhuǎn)換 信號(hào)處理 控制電路 光 源：氘燈（190nm600nm) 光電轉(zhuǎn)換：光電池 單色器：濾光片 信號(hào)處理：對(duì)數(shù)放大器 光柵分光 用微機(jī)進(jìn)行AlogIo/I

30、t計(jì)算 流過池：分析型 控制電路：對(duì)整機(jī)進(jìn)行控制 制備型 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 紫外光源的獲得 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 液 相 紫 外 檢 測(cè) 器 單 色 器 介 紹 氘燈 鎢燈 球面反射鏡 濾光片 步進(jìn)電機(jī) 狹縫 準(zhǔn)直鏡 平面光柵 半透半反鏡 流過池 參比光電池 檢測(cè)光電池 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 紫 外 檢 測(cè) 器 電 路 框 圖 CPU+ROM 檢測(cè)光路 放大器 參比光路 放大器 A/D轉(zhuǎn)換 A/D轉(zhuǎn)換 鍵盤 顯示 D/A轉(zhuǎn)換 RAM 記錄儀 積分儀 檢測(cè)光電池 參比光電池 接各用電點(diǎn)

31、 D 光柵步進(jìn) 電機(jī)驅(qū)動(dòng) 光電耦合 光電耦合 光電耦合 總電源 與 氘燈電源 氘燈 PC機(jī) RS232 通訊接口 數(shù)據(jù)保護(hù) 鎳鎘電池 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 紫外檢測(cè)器的分析結(jié)果之一：色譜數(shù)據(jù)圖 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 紫外檢測(cè)器的分析結(jié)果之二：光譜數(shù)據(jù)圖 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 對(duì)對(duì) 檢檢 測(cè)測(cè) 器器 的的 要要 求求 高靈敏度 可重現(xiàn)的設(shè)置 合適的帶寬 快速或可變的時(shí)間常數(shù) 寬的線性響應(yīng)范圍 容易使用及保養(yǎng) 具自我診斷功能 符合GLP規(guī)范 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢

32、測(cè) 器 衡衡 量量 檢檢 測(cè)測(cè) 器器 的的 指指 標(biāo)標(biāo) H噪音：沒有樣品時(shí)檢測(cè)器的最大輸出信號(hào) H漂移：檢測(cè)器在一段時(shí)間內(nèi)響應(yīng)值的變化 H重現(xiàn)性：檢測(cè)器有關(guān)分析的參數(shù)的穩(wěn)定性 H線性動(dòng)態(tài)范圍：最大線性響應(yīng)與最小檢出限之比 H最小檢測(cè)限：樣品產(chǎn)生兩倍或三倍于噪音信號(hào)的濃度 H信噪比 注意：最小檢測(cè)限不是一個(gè)單純的檢測(cè)器指標(biāo)，它實(shí)際上是評(píng)比 整個(gè)色譜系統(tǒng)的指標(biāo)，包括了色譜系統(tǒng)、分離機(jī)理、色譜柱在內(nèi) 的綜合性指標(biāo)，信噪比亦是如此 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 紫外檢測(cè)器的流過池紫外檢測(cè)器的流過池 檢測(cè)原理： 基于流過 池中的樣品溶 液對(duì)光產(chǎn)生吸 收有信號(hào)差。 流動(dòng)相和樣品

33、 排放 氘燈 光電池 石英玻璃 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 朗伯比耳定律朗伯比耳定律 氘燈 光電池 氘燈 光電池 光能量： Io=透過溶液的光能量 It=透過樣品的光能量 光通量（透過率）： T=It/Io 吸光度：A=-log(T)=log(Io/It) 吸光度：A=KcL 透過率 濃度 低高 吸光度A U 濃度低高 T-濃度曲線A-濃度曲線 低濃度樣品高濃度樣品 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因素同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因素 1AU 10%噪音 信噪比 S/N=1AU/0.1=10 1%噪音 0.25AU 信

34、噪比 S/N=0.25AU/0.01=25 信號(hào)強(qiáng)度（S） 從朗伯比耳定律可看出： 樣品的種類 樣品的濃度和進(jìn)樣的體積 檢測(cè)池的長度 所使用的波長，檢測(cè)器的時(shí)間 常數(shù) 噪音（N） 流動(dòng)相 所使用的波長，燈的能量 檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù) 非檢測(cè)器的因素：電噪音、泵 脈動(dòng) 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 200 220 240 260 乙腈的紫外吸收 200 220 240 260 甲醇的紫外吸收 AU nm AU nm 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 紫外檢測(cè)器的流動(dòng)相影響 不同種類的溶劑有其不同的截止 波長 溶劑質(zhì)量的好壞對(duì)其截止波長有 影響 為何溶劑質(zhì)量影響截止波長？ 1.含紫外吸收的雜質(zhì) 2.溶解在其

35、中的氧氣 3.緩沖液溶劑的紫外吸收 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液 相 色 譜 紫 外 檢 測(cè) 器 紫外檢測(cè)器的流動(dòng)相影響 0 0 1 12 背 景 吸 收 理想狀態(tài) 實(shí)際情況 吸收率 濃度 AU AU 流動(dòng)相的背景吸收減少線性范圍 流動(dòng)相的背景吸收會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)器 的最低檢測(cè)限變壞 很多用作流動(dòng)相的溶劑會(huì)產(chǎn)生背 景吸收 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 另一種液相色譜紫外檢測(cè)器 二 極 管 陣 列 檢 測(cè) 器 DIODE ARRAY DETECTOR 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的檢測(cè)器 二 極 管 陣 列 檢 測(cè) 器 檢測(cè)原理和紫外檢測(cè)器一樣 色譜定性依據(jù)比紫外檢測(cè)器更強(qiáng)有力 常規(guī)紫外檢測(cè)器的定性分析：僅能

36、依靠峰保留時(shí)間 二極管陣列檢測(cè)器的定性分析： 1）采集三維譜圖 2）峰純度檢驗(yàn) 3）光譜庫檢索 4）可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測(cè)時(shí)未測(cè)到的峰 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的檢測(cè)器 吸收值（AU） 波長(nm) 時(shí)間(min) 二極管陣列檢測(cè)器的三維色譜圖 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的檢測(cè)器 透鏡 光電池 池棱鏡 樣 品 出 入 口 參 比 出 入 口 光投射器部分 光源 光檢測(cè)部分 反射式示差折光檢測(cè)器 示 差 折 光 器 Refractive Index Detector 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的檢測(cè)器 示差折光檢測(cè)器的原理: 任意一束光由一種介質(zhì)射入另一種介質(zhì)時(shí)由于兩種介質(zhì)的折射

37、率不同而發(fā)生折射 現(xiàn)象.折光率是一個(gè)無量綱的常數(shù)，光在真空中的速度和光在某種介質(zhì)中的速度 之比定義為該介質(zhì)的折射率，其大小表明了介質(zhì)光密度的高低。示差折光檢測(cè)器 是通過連續(xù)測(cè)定色譜柱流出液折射率的變化而對(duì)樣品濃度進(jìn)行檢測(cè)的。 示差折光檢測(cè)器的特點(diǎn)： 1.通用型檢測(cè)器 2.靈敏度不高，檢測(cè)限在10-6g/ml 10-7g/ml 3.對(duì)壓力和溫度很敏感 4.對(duì)流動(dòng)相的要求低 5.不能用于梯度淋洗 示 差 折 光 器 Refractive Index Detector 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的手動(dòng)進(jìn)樣器 六通閥進(jìn)樣器是高效液相色譜系統(tǒng)中最理想的進(jìn)樣 器，它是由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。 美國Rheodyne公司的六通閥進(jìn)樣器最為通用，各大HPLC 儀器制造商大都以此產(chǎn)品作為儀器的進(jìn)樣器。 高效液相色譜基礎(chǔ)課件 液相色譜儀的手動(dòng)進(jìn)樣器 樣品裝填狀態(tài) (LOAD) 手動(dòng)進(jìn)樣器原理圖 1 4 2 35 6 注射口 接輸液泵 接色譜柱 多余樣品排放 1 4 2 35 6 接輸液泵 接色譜柱 注射狀態(tài) (INJECT) 工作原理： 1、手柄位進(jìn)樣(Load)位置時(shí)， 樣品經(jīng)微量進(jìn)樣針從進(jìn)樣孔注射 進(jìn)定量環(huán)，定量環(huán)充滿后，多余 樣品從放空孔排出； 2、將手柄轉(zhuǎn)動(dòng)至進(jìn)樣(Injec