凝膠成像及Quantity One中文操作說明

1、-作者xxxx-日期xxxx凝膠成像及Quantity One中文操作說明【精品文檔】第一章 簡介凝膠電泳是每個(gè)做分子生物學(xué)的研究者天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，要向大家介紹的是Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件Quantity One（Bio-Rad還有一個(gè)做2D凝膠分析的軟件PDQuest）。Quantity One軟件是常用1D凝膠分析軟件中功能最強(qiáng)大，自動(dòng)化程度最高的軟件。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網(wǎng)（）免費(fèi)下載，以供試用或用戶升級之用。Quantity One軟件的主要功能包括定量分析(Volume

2、s Quick Guide)，電泳條帶分析(Band Analysis)，差顯分析(Differential Display Analysis)，克隆計(jì)數(shù)(Colony Counting Analysis)等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和ExQuest自動(dòng)切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。Quantity One軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應(yīng)用軟件相同的友好界面。插入密碼狗，打開Quantity One軟件，可以看到最上緣藍(lán)色橫條幅是標(biāo)題欄，往下依次是菜單欄和工具欄。File圖像打開、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、條帶匹配分析Edit圖

3、像普通編輯操作Volumn定量分析View圖像縮放、三維視圖、看光密度值等操作Analysis濃度估算、克隆計(jì)數(shù)等分析Image圖像旋轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)、裁切等操作Reports分析結(jié)果輸出Lane泳道分析Window窗口分析Band條帶分析Help幫助、快捷菜單、軟件注冊等 每個(gè)菜單的主要功能如下：往下一行是工具欄，上面每個(gè)按鈕的功能見下表：Quantity One軟件HelpQuick Guide快捷指南提示如何實(shí)現(xiàn)一個(gè)功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，電泳條帶分析(Band Analysis)，差顯分析(Differential Display Analysis)，克隆計(jì)

4、數(shù)(Colony Counting Analysis)等?？旖葜改舷掠?，2，3步驟，根據(jù)提示完成。使用Quantity One軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取、圖像預(yù)處理、分析、結(jié)果輸出四部分。圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀（GS-800、PharosFX等）或凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等），圖像預(yù)處理就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進(jìn)行初步處理，以便更好地進(jìn)行后續(xù)分析。接下來是分析過程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計(jì)數(shù)、差異（聚類）分析等等。不管如何分析，最終我們都必須通過軟件的輸出功能，得到我們想要的結(jié)果。Quant

5、ity One軟件提供了多種結(jié)果輸出方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個(gè)思路，一步步引導(dǎo)您使用這一軟件。第二章 圖像獲取Quantity One 4.44.6版本可以控制Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀，如GelDoc XR、ChemiDoc XRS等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴(kuò)展名1sc的原始圖像文件。下面將具體介紹如何通過Quantity One軟件從GelDoc XR獲取圖像。GelDoc XR是Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中最常用，操作最簡便的儀器，它可以用來拍攝EB、SYBR Green等染料染的核酸電泳凝膠；Sypro Ruby、銀染、考馬斯

6、亮藍(lán)等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學(xué)顯色的印記膜等。使用GelDoc XR之前，先接通電源，打開位于儀器背面右下角的電源開關(guān)；然后根據(jù)具體的應(yīng)用選擇合適的照明和濾光片位置。原則如下：表格形式模式1. 如果樣品是通過EB、SYBR Green、Sypro Ruby等染料通過紫外激發(fā)來顯色，就先將樣品置于紫外透射平臺(UV Transilluminator)的中間，關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“Trans UV”按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I”處。模式2. 如果樣品是通過金屬銀、考馬斯亮藍(lán)等染料染色，就先將白光轉(zhuǎn)換屏 (White Light Conversion Screen)取下，打開下部

7、的開關(guān)，放在紫外透射平臺上，樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“Trans White”按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I”處。模式3. 如果是化學(xué)顯色等非透明可見樣品，則用模式2中所示方法，將樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“Epi White按鈕”，并將濾光片選擇桿置于位置“O”處。接下來打開Quantity One軟件，選擇FileGelDoc XR，按以下順序操作： 按下Live/Focus，成像儀進(jìn)入實(shí)時(shí)成像； 選擇照明模式，一般核酸膠用UV,蛋白膠用White模式； 注意，選擇完成后，要按下成像儀面板上相應(yīng)的光源按鈕此功能有三個(gè)上下鍵按鈕：IR

8、IS（光圈），ZOOM（縮放），F(xiàn)OCUS（聚焦），您可在軟件上直接調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)步驟：a 調(diào)大IRIS，以看到圖像 b 點(diǎn)ZOOM,將膠適當(dāng)放大 c 調(diào)節(jié)IRIS至合適大小（一般情況下盡量選擇小光圈，因?yàn)樾」馊吧畲螅瑘D像更清晰) d 調(diào)節(jié)FOCUS，至圖像最清晰按 按“Auto Expose”；如是，單擊Auto Expose,系統(tǒng)將自動(dòng)選擇曝光時(shí)間成像，如不滿意，單擊Manual Expose，并輸入曝光時(shí)間（秒），圖像滿意后保存,在自動(dòng)曝光期間，圖象會(huì)持續(xù)的輸入到CCD中，直到達(dá)到一定比例的飽和象素值， 此比例在Options dialog box 中設(shè)定 (默認(rèn)值 =

9、 0.15)。一旦圖象質(zhì)量達(dá)到要求，點(diǎn)擊Freeze button 來終止曝光。 如是蛋白凝膠，接第6步直接將清晰的圖像保存即可 按下“Analyze”；這將會(huì)打開一個(gè)新的窗口來顯示捕獲的圖象，該圖象具有默認(rèn)名稱，具有日期、時(shí)間及用戶名（如果已知的話）等信息。 按下“Save”鍵，保存圖像。第三章 圖像分析Quantity One的圖像分析功能相當(dāng)強(qiáng)大，根據(jù)不同的需要，可以分為定量分析、條帶分析、相似性分析以及克隆計(jì)數(shù)(用于藍(lán)白斑篩選)等等，而且每種分析法都有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和輸出方式。本章重點(diǎn)介紹常用的定量分析和條帶分析方法，其余更細(xì)更深的功能請參考軟件自帶的用戶手冊。一定量分析（Volumn A

10、nalysis）定量分析是計(jì)算選定區(qū)域內(nèi)信號強(qiáng)度的總和，是Quantity One最方便的定量工具。這種分析方式考慮選定區(qū)域的真實(shí)形狀，可用于電泳條帶、斑點(diǎn)、大型芯片等圖像的定量。這種定量的方法可以扣除背景，可以按照用戶的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出條帶或斑點(diǎn)的濃度，但它不能計(jì)算分子量，也不能進(jìn)行條帶匹配和相似性分析。Quantity One軟件稱這類定量的結(jié)果為Volume。 Volume選定區(qū)域內(nèi)所有像素信號強(qiáng)度的總和像素面積 Volume的單位：intmm2快捷指南Volumes Quick Guide，能夠指導(dǎo)您對任意所選區(qū)域進(jìn)行定量分析,此分析可以報(bào)告多種結(jié)果，常用的結(jié)果是相對濃度和絕對濃度（須提

11、供標(biāo)準(zhǔn)品）。具體的操作方法如下：1選擇成像系統(tǒng)或打開已保存的文件(軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理)2Zoom Box，縮放，對圖象進(jìn)行放大觀察3Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的對比度黑白4選擇待分析區(qū)域：Volumn Contour Tool等高線勾勒區(qū)域，自動(dòng)連接濃度相同的點(diǎn)，如U1 Volume Free hand Tool自由畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無規(guī)則形狀,如U2Volume Rect Tool 矩形區(qū)域選

12、擇，如U3Volumn Circle Tool圓形選擇區(qū)域，如U4按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。5雙擊所選區(qū)域，出現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知樣品Unkonwn(U1,U2即待計(jì)算樣品)，背景Background(B1,B2，軟件在算濃度時(shí)會(huì)將此區(qū)域的濃度自動(dòng)扣除) 或標(biāo)準(zhǔn)樣品Standard（Std1,Std2, 如果該樣品是濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，即定量標(biāo)準(zhǔn)，需在濃度concentration一欄輸入該樣品的濃度）。6Select Tool選擇不同區(qū)域7Print Image打印圖像8Volume Analysis Report 定量報(bào)告結(jié)果，打開出現(xiàn)如下窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，主要有2個(gè)參

13、數(shù)Volume、adj. Vol. (即adjusted volume) 和Concentration。Volume為定量值，adj. Vol. 為扣除背景后的定量值，如有濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品（Std），軟件可報(bào)告Concentration絕對濃度。參數(shù)選好后，按下按鈕“done”。9軟件報(bào)告如下圖所示：按右側(cè)輸出按鈕，可將表格保存成txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報(bào)告打印出來。二條帶分析（Band Analysis）條帶分析是Quantity One最基本的分析工具，它可以自動(dòng)識別電泳泳道和識別條帶，依據(jù)泳道的平均光密度和條帶寬度對每個(gè)條帶進(jìn)行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方便，但這樣

14、可以實(shí)現(xiàn)非常復(fù)雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點(diǎn)在于它可以完全拋棄人為主觀因素而進(jìn)行全自動(dòng)定量。用條帶分析的方法進(jìn)行定量的結(jié)果叫Trace Quantity（Trace Qty），計(jì)算方法是：首先軟件自動(dòng)計(jì)算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個(gè)具體條帶的定量值是平均光密度曲線的線下面積的積分，即：Trace Quantity平均光密度條帶上下邊界的距離Trace Quantity的單位：OD*mm下面介紹用此功能對泳道內(nèi)的所有條帶進(jìn)行分子量確定，相對濃度分析 1打開已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件

15、格式，軟件也可進(jìn)行分析處理)2Zoom Box，縮放，對圖象進(jìn)行放大觀察3Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的對比度黑白4確定泳道(lane),并對泳道進(jìn)行各種調(diào)整（實(shí)際實(shí)驗(yàn)中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形）。按下圖所示在軟件的工具欄中有一Lane Tool圖標(biāo)，包含有更多泳道編輯工具。5選擇Frame Lanes，輸入圖像實(shí)際泳道(lane)數(shù)并確認(rèn)。此時(shí)圖像上泳道的位置上會(huì)出現(xiàn)一條條紅線，每條紅線就代表一根泳道。6選擇Add/Adjust Anchors，此時(shí)泳道紅線上會(huì)出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(diǎn)(anchor)，錨定點(diǎn)規(guī)定了泳道走向。當(dāng)泳道不直時(shí)，點(diǎn)擊出現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以

16、增加錨定點(diǎn)。鼠標(biāo)按住錨定點(diǎn)，可以拖動(dòng)錨定點(diǎn)，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7Lane Background去除泳道背景。點(diǎn)擊該按鈕，選擇一條適當(dāng)?shù)挠镜傈c(diǎn)擊之，然后在彈出的對話框中選“All Lane On”，在“Rolling Disk Size”中填入適當(dāng)?shù)臄?shù)值1。 8Detect Band，檢測泳道內(nèi)的條帶，打開出現(xiàn)如下窗口。通過調(diào)節(jié)sensitivity靈敏度可調(diào)節(jié)檢測出的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)Lane Width使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以用來增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。打開工具欄中Band Tool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具（如上圖）9

17、.Standard輸入分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標(biāo)準(zhǔn)，如你用的是自己的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入New Standard建立新的分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件可以選擇標(biāo)準(zhǔn)單位是MW（蛋白質(zhì)）還是BP（核酸）等（左下圖）。在Protein-Standard對話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標(biāo)（右下圖），回到圖象文件上單擊標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道，軟件自動(dòng)將所輸?shù)姆肿恿繑?shù)值和泳道內(nèi)的條帶一一對應(yīng)。10.Band Attribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動(dòng)計(jì)算出了其他未知條帶的分子量,打開band attribute選擇要報(bào)告的參數(shù)，這里我們選擇Molecular Weight，圖象上可以看到所有

18、條帶的分子量（紅顏色標(biāo)記），標(biāo)準(zhǔn)分子量為藍(lán)色標(biāo)記。11.Print Image打印圖象12.All Lane Report所有泳道條帶結(jié)果報(bào)告。打開窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，如.（分子量，如左下圖），軟件將報(bào)告結(jié)果（右下圖），在報(bào)告的右下腳有一報(bào)告輸出工具，點(diǎn)擊可將報(bào)告結(jié)果輸出成.txt文本格式或輸出至剪貼板，可粘貼到EXCEL，WORD等文件下。常見問題及處理：1問：為什么我新買的Quantity One軟件幾天前還能用，現(xiàn)在只能使用最基本的功能了？答：可能是密碼未正確安裝，而試用期已過。2問：為什么我重新安裝Quantity One軟件后就不能使用了？答：可能是安裝了超過版本限制的高版本Quantity One。3問：我的密碼狗還在，可密碼找不到了，我該如何填寫密碼？答：可以暫時(shí)將電腦連到Internet上，打開Quantity One軟件，選擇HelpRegisterCheck