蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1 蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾 改變蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)改變蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué) 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及活性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及活性 改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象 第1頁/共16頁 影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素有：影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素有： 1 蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性（親核性）蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性（親核性） 1.1 基團(tuán)之間的氫鍵及靜電作用基團(tuán)之間的氫鍵及靜電作用 1.2 基團(tuán)之間的空間位阻基團(tuán)之間的空間位阻 2 修飾劑的反應(yīng)性修飾劑的反應(yīng)性 2.1 選擇吸附選擇吸附 2.2 靜電相互作用靜電相互作用 2.3 位阻因素位阻因素 第2頁/共16頁 1 試劑的選擇

2、試劑的選擇 水解穩(wěn)定性；水解穩(wěn)定性； 蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)，反應(yīng)類型以及專一性；蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)，反應(yīng)類型以及專一性； 修飾劑的大??；修飾劑的大??； 連接鍵的穩(wěn)定性、毒性和抗原性；連接鍵的穩(wěn)定性、毒性和抗原性； 修飾后是否需要進(jìn)一步的分離；修飾后是否需要進(jìn)一步的分離； 是否適于建立快速、方便的分析方法；是否適于建立快速、方便的分析方法； 是否能夠簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的合成或購(gòu)買是否能夠簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的合成或購(gòu)買 第3頁/共16頁 2反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)條件的選擇 考慮因素包括考慮因素包括pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)介質(zhì)以、反應(yīng)溫度、反應(yīng)介質(zhì)以 及緩沖液組成及緩沖液組成 允許反應(yīng)順利進(jìn)行允許反應(yīng)順利進(jìn)行 不能造成蛋白質(zhì)的不可逆

3、變性不能造成蛋白質(zhì)的不可逆變性 有利于專一性修飾蛋白質(zhì)有利于專一性修飾蛋白質(zhì) 第4頁/共16頁 ?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng) 烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng) 氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng) 芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng) 第5頁/共16頁 聚乙二醇聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)修飾又修飾又 稱分子的稱分子的PEG化化(PEGalation),是目前蛋白質(zhì)化是目前蛋白質(zhì)化 學(xué)修飾最重要的技術(shù)之一學(xué)修飾最重要的技術(shù)之一,是用來解決或緩解蛋是用來解決或緩解蛋 白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題的有效白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題的有效 途徑。途徑。 第6頁/共16頁 PEG是由乙二

4、醇單體聚合而成的線性高分子材料,分子組成 為HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH; PEG鏈還可 以與馬來酸酐進(jìn)一步共聚形成梳狀的PEG衍生物,簡(jiǎn)稱PM。 PEG分子中存在的大量乙氧基能夠與水形成氫鍵,使PEG具有 良好的水溶性;分子末端剩余的羥基通過適當(dāng)方式活化后可 與各類蛋白分子相偶聯(lián)。 第7頁/共16頁 由于由于PEG無毒無毒,具有良好生物相容性和血液相容性具有良好生物相容性和血液相容性, 使它成為一種被廣泛使用的生物修飾材料。對(duì)于各種使它成為一種被廣泛使用的生物修飾材料。對(duì)于各種 具有藥用潛能的蛋白來說具有藥用潛能的蛋白來說,采用采用PEG修飾的目的

5、主要有修飾的目的主要有 以下三個(gè)方面以下三個(gè)方面:(1)增加穩(wěn)定性增加穩(wěn)定性,延長(zhǎng)血漿半衰期延長(zhǎng)血漿半衰期;(2)降低降低 免疫原性和抗原性免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。降低毒副作用。 第8頁/共16頁 1 增加穩(wěn)定性和延長(zhǎng)血漿半衰期增加穩(wěn)定性和延長(zhǎng)血漿半衰期 一些以注射方式使用的藥用蛋白一些以注射方式使用的藥用蛋白,由于在血液中存留的由于在血液中存留的 時(shí)間過短時(shí)間過短,在很大程度上限制了其正常藥效的發(fā)揮。通過在很大程度上限制了其正常藥效的發(fā)揮。通過 PEG修飾修飾,一方面增加了分子量一方面增加了分子量,降低了腎臟的排泄速率降低了腎臟的排泄速率;另另 一方面一方面,偶聯(lián)的偶聯(lián)的PEG

6、鏈在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)鏈在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng),減減 弱了血液中各種水解酶對(duì)蛋白的水解作用弱了血液中各種水解酶對(duì)蛋白的水解作用,從而有效地延長(zhǎng)從而有效地延長(zhǎng) 了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的保留時(shí)間。了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的保留時(shí)間。 第9頁/共16頁 2降低抗原性和免疫原性降低抗原性和免疫原性 通過通過PEG修飾來消除免疫反應(yīng)活性修飾來消除免疫反應(yīng)活性,將異源性蛋白轉(zhuǎn)化將異源性蛋白轉(zhuǎn)化 為非免疫原性的藥用蛋白為非免疫原性的藥用蛋白,主要是利用無免疫原性的主要是利用無免疫原性的PEG分分 子鏈與蛋白表面的基團(tuán)相偶聯(lián)子鏈與蛋白表面的基團(tuán)相偶聯(lián),進(jìn)而在蛋白表面形成一道屏進(jìn)而在蛋白表面形成一道屏

7、障障,將暴露的抗原結(jié)合位點(diǎn)屏蔽起來。分子構(gòu)型獨(dú)特的梳狀將暴露的抗原結(jié)合位點(diǎn)屏蔽起來。分子構(gòu)型獨(dú)特的梳狀 PEG具有更強(qiáng)的屏蔽功能具有更強(qiáng)的屏蔽功能,因而在這方面的應(yīng)用更為普遍。因而在這方面的應(yīng)用更為普遍。 第10頁/共16頁 3降低毒副作用降低毒副作用 通過基因重組技術(shù)獲得的大規(guī)模生產(chǎn)的通過基因重組技術(shù)獲得的大規(guī)模生產(chǎn)的TNF-a a,IL-2 和和 IFN-g g等是一類很有前途的抗腫瘤新藥。但由于它們的血漿半等是一類很有前途的抗腫瘤新藥。但由于它們的血漿半 衰期短衰期短,為達(dá)到顯著的臨床治療效果不得不加大使用劑量為達(dá)到顯著的臨床治療效果不得不加大使用劑量,這就這就 常常引起嚴(yán)重的毒副作用。

8、近年來發(fā)現(xiàn)常常引起嚴(yán)重的毒副作用。近年來發(fā)現(xiàn),利用利用PEG修飾技術(shù)對(duì)修飾技術(shù)對(duì) 這些蛋白進(jìn)行處理后這些蛋白進(jìn)行處理后,能夠大大增加其血漿穩(wěn)定性能夠大大增加其血漿穩(wěn)定性,降低使用劑降低使用劑 量量;或在大的使用劑量下降低毒副作用。近年來或在大的使用劑量下降低毒副作用。近年來,PEG修飾已成修飾已成 為提高其抗腫瘤效能、降低毒副作用的有效手段。為提高其抗腫瘤效能、降低毒副作用的有效手段。 第11頁/共16頁 蛋白藥物的蛋白藥物的PEG修飾已卓有成效，國(guó)際知名的制藥公修飾已卓有成效，國(guó)際知名的制藥公 司已經(jīng)或正在積極推進(jìn)蛋白藥物的司已經(jīng)或正在積極推進(jìn)蛋白藥物的PEG修飾，修飾，1991年第一年第一

9、 種用種用PEG修飾的蛋白藥物修飾的蛋白藥物PEG-ADA被被FDA批準(zhǔn)上市，近批準(zhǔn)上市，近 幾年上市的有幾年上市的有PEG-IFN、PEG-G-CSF、PEG-生長(zhǎng)抑素。生長(zhǎng)抑素。 目前處于臨床前研究的目前處于臨床前研究的PEG修飾的蛋白藥物有幾十種，處修飾的蛋白藥物有幾十種，處 于臨床實(shí)驗(yàn)的有：超氧化物歧化酶（即將上市，于臨床實(shí)驗(yàn)的有：超氧化物歧化酶（即將上市，Enzon公公 司）、白介素司）、白介素-2（期，期，Chiron公司）、水蛭素（公司）、水蛭素（期，期， BASF AG公司）、抗公司）、抗-TNF-a a抗體片段（抗體片段（期，期，Pharmacia 公司）、牛血紅蛋白（公司）

10、、牛血紅蛋白（期，期，Enzon公司）、抗公司）、抗-PDGF抗抗 體片段（體片段（期，期，Celltech公司）。公司）。 第12頁/共16頁 TNF-a是一種頗有價(jià)值的腫瘤治療藥物,它具有協(xié)同的 抗腫瘤效能:一方面直接表現(xiàn)為對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用; 另一方面可激活宿主的抗腫瘤應(yīng)答并選擇性地引起腫瘤組 織內(nèi)部的微循環(huán)障礙。但是, TNF-a在體內(nèi)的清除速率很快 ,要產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果需要非常大的使用劑量,由此常 引發(fā)一系列嚴(yán)重的毒副作用,包括發(fā)熱、組織炎癥和組織損 傷,甚至是致命的內(nèi)毒素性休克樣綜合征。要將其轉(zhuǎn)化為一 種有效的抗腫瘤藥物必須有效地降低毒副作用,PEG修飾正 是為達(dá)到這一目的

11、。研究表明,利用mPEG 5000對(duì)TNF-a進(jìn) 行化學(xué)修飾,通過對(duì)修飾條件的優(yōu)化處理,不僅能夠有效減 少毒副作用,還可提高其抗腫瘤活性。當(dāng)賴氨酸殘基被修飾 的程度分別為29%和56%時(shí),其抗腫瘤活性分別增加了4倍和 100倍。與天然TNF-a相比,修飾產(chǎn)物的分子量明顯增大,延 長(zhǎng)了藥物的有效作用時(shí)間,降低了毒副作用,促進(jìn)了它作為 抗腫瘤藥物的應(yīng)用。 第13頁/共16頁 PEG修飾蛋白及其應(yīng)用修飾蛋白及其應(yīng)用 被修飾蛋白種類被修飾蛋白種類修飾目的修飾目的用途用途 無基質(zhì)牛血紅蛋白無基質(zhì)牛血紅蛋白延長(zhǎng)血漿半衰期延長(zhǎng)血漿半衰期,降低腎毒性降低腎毒性血液代用品血液代用品 SOD延長(zhǎng)血漿半衰期延長(zhǎng)血漿半衰期 降低免疫原性降低免疫原性 清除氧自由基清除氧自由基 治療關(guān)節(jié)炎治療關(guān)節(jié)炎 L-ASNase降低免疫原性降低免疫原性治療白血病治療白血病 Bovine降低免疫原性降低免疫原性血漿擴(kuò)容劑血漿擴(kuò)容劑 IL-2增加水力動(dòng)力學(xué)半徑增加水力動(dòng)力學(xué)半徑治療腫瘤治療腫瘤 TNF-a增加抗腫瘤效能增加抗腫瘤效能,降低毒副作用降低毒副作用治療腫瘤治療腫瘤 抗腫瘤抗體抗腫瘤抗體腫瘤定位腫瘤定位治療腫瘤治療腫瘤 -葡糖苷酸酶抗體葡糖苷酸酶抗體增加穩(wěn)定性增加穩(wěn)定性,改善藥代動(dòng)力學(xué)特性改善藥代動(dòng)力學(xué)特性治療實(shí)體腫瘤治療實(shí)體腫瘤 第14頁/共16頁 目前，存在的問題是修飾劑反應(yīng)性及選擇性目前，存在的