多肽合成技術(shù)

1、-作者xxxx-日期xxxx多肽合成技術(shù)【精品文檔】多肽化學(xué)已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先開始關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時在多肽合成方面的知識太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢當(dāng)時合成采用了苯甲酰，乙酰保護(hù)，脫去相當(dāng)困難，而且容易導(dǎo)致肽鏈斷裂。直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基（Z）來保護(hù)-氨基，該保護(hù)基可以在催化氫化或氫溴酸的條件下定量脫除，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代，隨著越來越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動了有機(jī)化學(xué)家們對多肽合成方法以及保護(hù)基的研究，因此這一階段的研究成果也非常豐富，人們合成了大量的生物活性多肽，包括

2、催產(chǎn)素（oxytocin），胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現(xiàn)也提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。也就是這個階段，F(xiàn)red Sanger發(fā)明了氨基酸序列測定方法，并為此獲得了1958年的Nobel化學(xué)獎。還是他后來發(fā)明了DNA序列檢測方法，并于1980年再次獲得了Nobel化學(xué)獎，成為到目前為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎的科學(xué)家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），這個在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出來，就由于其合成方便，迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選方法，隨后的發(fā)展也證明了該方法不僅僅是一種合成方法

3、，而且也帶來了有機(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科，固相有機(jī)合成（SPOS）。當(dāng)然，Merrifield也因此榮獲了1984年的Nobel化學(xué)獎。也正是Merrifield，他經(jīng)過了反復(fù)的篩選，最終屏棄了芐氧羰基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（BOC）用于保護(hù)-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應(yīng)也非常迅速，在30min就可以反應(yīng)完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)大多基于芐基（Bzl），因此也稱為BOC-Bzl策略。同時，Merrifield在20世紀(jì)60年代末發(fā)明了第一臺全自動多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（12

4、4個氨基酸）。隨后的多肽化學(xué)研究主要集中在固相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護(hù)基的研究。1972，Lou Carpino 首先將9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保護(hù)-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，到了20世紀(jì)80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基（But），因此，也稱為FMOC-But策略。同時，在多肽合成樹脂，縮合試劑以及氨基酸保護(hù)，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，對于多肽化學(xué)的要求不僅僅是合成方

5、法，而更多的集中在多肽標(biāo)記與修飾方法，以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以及長肽或蛋白合成。 多肽化學(xué)合成的基本介紹多肽化學(xué)合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采用BOC和Z兩種保護(hù)方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn)素等，其相對與固相合成，具有保護(hù)基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點(diǎn)。與固相合成比較，液相合成主要缺點(diǎn)是，合成范圍小，一般都集中在10個氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中需要對中間體進(jìn)行提純，時間長，工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采用FMOC和BOC兩種方法，它具有合成方便，迅速，容易實(shí)現(xiàn)自動化，而且可以比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽

6、。氨基酸保護(hù)基20種常見氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因?yàn)槌Ｒ姷?0中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù)，一般要求，這些保護(hù)基在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng)，合成結(jié)束后可以完全定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，Hi

7、s，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護(hù)，因?yàn)檫胚嵝再|(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護(hù)，象，Asn，Gln ，Thr，Tyr。表1 常見3種氨基脫除條件TFAHBr/TFAH2/Pd-CPiperidine/DMFBocyynnZnyynFmocnyny圖1 常見3種氨基保護(hù)基結(jié)構(gòu)氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多，同一個側(cè)鏈有多種不同的保護(hù)基，可以在不同的條件下選擇性的脫除，這點(diǎn)在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側(cè)鏈保護(hù)基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系，液

8、相和固相不一樣，固相中BOC和FMOC策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運(yùn)用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基的使用，請參考王德心的固相有機(jī)合成原理及應(yīng)用指南第四章，我們這里主要介紹Cys，Lys，Asp的幾種保護(hù)基及其脫除方法。Cys最常見的保護(hù)基有三種，Trt，Acm，Mob，這三個保護(hù)基可以完成多對二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的保護(hù)基有：Boc，F(xiàn)moc，Trt，Dde，Allyl，這對于固相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護(hù)策略。Asp最常見的保護(hù)基有：Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同樣也提供了多種正交的保護(hù)策略。表2 巰基常見保護(hù)基簡稱結(jié)構(gòu)脫除條件TrtTF

9、A，HCl/HOAc，I2/MeOHAcmI2/MeOH，Hg2+MobHF，TFMSA，Hg2+表3 氨基常見保護(hù)基簡稱結(jié)構(gòu)脫除條件TrtTFA，HOAc，HCOOHBocHCl/HOAc，TFA/DCMFmocPip/DMF，NaOH/MeOHDdeH2NNH2/DMFAllylPd（Ph3P）4，嗎啉/THF表3 羧基常見保護(hù)基簡稱結(jié)構(gòu)脫除條件OtbuTFA，HOAc，HCOOHOBzlH2/Pd，HF，TFMSAOMeNaOH/MeOHOAllPd（Ph3P）4，嗎啉/THFOFmPip/DMF，DBU/DMF多肽縮合試劑目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應(yīng)，最早使用的是

10、將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來的縮合試劑取代，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。碳二亞胺型主要包括：DCC，DIC，等。采用DCC進(jìn)行反應(yīng)，由于反應(yīng)中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價(jià)格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去，應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛。因?yàn)槠渌芙庑缘奶攸c(diǎn)，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當(dāng)成功。但是該類型的縮合試劑的一個最大的缺點(diǎn)，就是如果單獨(dú)使用，會有比較多的副反應(yīng)，但是研究表

11、明如果在活化過程中添加HOBt，HOAt等試劑，可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍。其反應(yīng)機(jī)理如下：圖2 DIC活化反應(yīng)機(jī)理鎓鹽型鎓鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高，速度快，現(xiàn)在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機(jī)堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。其反應(yīng)機(jī)理如下：圖3 TBTU活化反應(yīng)機(jī)理多肽合成方法比較液相多肽合成（solution phase synthesis）液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇的

12、反應(yīng)條件更加豐富，象一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因，無法應(yīng)用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。圖4液相合成Glu-Trp固相多肽合成圖5 FMOC固相合成Glu-Trp固相多肽合成現(xiàn)在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過程中，需要反復(fù)使用TFA脫BOC，而且在最后從樹脂上切割下來需要使用HF，由于HF必須使用專門的儀器進(jìn)行操作，而且切割過程中容易產(chǎn)生副反應(yīng)，因此現(xiàn)在使用受到實(shí)驗(yàn)條件限制，使用也逐漸減少。FMOC方法反應(yīng)條件溫和，在一般的實(shí)驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成，因此，也得到了非常廣泛的應(yīng)用。固相

13、合成中常用樹脂固相合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150m，交聯(lián)度在1-2%之間，現(xiàn)在使用的大多是1%，因?yàn)檫@種交聯(lián)度下，樹脂在DMF，DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反應(yīng)物分子可以在樹脂內(nèi)部自由移動。樹脂中最關(guān)鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上，一端作為反應(yīng)位點(diǎn)。目前廣泛使用的樹脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因?yàn)槠鋵λ岱浅７€(wěn)定，需要在HF，TFMSA等強(qiáng)酸條件下才能夠切割下來。圖6 固相合成常用樹脂茚三酮檢測固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離

14、氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結(jié)果，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液B，80% 苯酚的乙醇溶液C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。還有其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。圖7 茚三酮檢測原理固相合成切割方法固相合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切

15、割下來，然后經(jīng)過冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后產(chǎn)品。由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時候，選擇的切割方法也不完全相同，一般都是選擇酸性條件下切割的條件，對于PAM，MBHA樹脂，一般采用HF切割，切割過程中需要添加對甲苯酚，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對于Wang，Rink-Amide，Trt樹脂，一般采用TFA切割，切割過程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子，減少這些碳正離子對部分氨基酸側(cè)鏈的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp，T

16、yr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（），反應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h。多肽合成中主要問題消旋及其反應(yīng)機(jī)理多肽合成過程中，部分氨基酸在活化的過程中會導(dǎo)致不同程度的消旋，特別容易消旋的氨基酸有：Cys，His，Phe，當(dāng)然這些消旋化還和溶劑，溫度以及合成中的有機(jī)堿等因素有關(guān)。對于這些氨基酸，可以通過采用高效縮合試劑，減少反應(yīng)時間，可以減少消旋的比例，一般條件選擇適當(dāng)，消旋化都可以控制在5%以內(nèi)。消旋反應(yīng)機(jī)理如下：圖8 消旋反應(yīng)機(jī)理二酮哌嗪（DKP）反應(yīng)DKP副反應(yīng)出現(xiàn)在F

17、MOC-Wang樹脂合成過程中，主要出現(xiàn)在第一個氨基酸為Pro的時候，當(dāng)?shù)诙€氨基酸脫FMOC的時候，-氨基被游離出來之后，立即對Wang樹脂的芐酯鍵進(jìn)行分子內(nèi)胺解，生成六元環(huán)二酮哌嗪衍生物，同時從Wang樹脂上釋放出來，導(dǎo)致反應(yīng)終止。該反應(yīng)非常迅速，文獻(xiàn)報(bào)道采用50%Pip/DMF，脫1min，4min的條件，但是我們實(shí)驗(yàn)證明在多數(shù)情況下，即使是1min左右反應(yīng)就超過了20%。因此一般在末端第一個氨基酸為Pro的時候，建議采用2-Cl-Trt樹脂合成，由于該樹脂巨大的空間阻力，可以完全消除該副反應(yīng)。這個副反應(yīng)在BOC策略合成過程中，卻可以完全避免，因?yàn)锽OC在使用TFA脫除后，使氨基以TFA

18、鹽的形式存在，從而失去了親核性，不能進(jìn)攻芐酯鍵。圖9 DKP反應(yīng)機(jī)理困難序列多肽合成固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因?yàn)橛行┒嚯男蛄性跇渲闲纬?折疊，改變了樹脂的溶脹性能，還有可能將反應(yīng)的活性位點(diǎn)埋藏在樹脂里面，這樣使得反應(yīng)很難進(jìn)行，目前報(bào)道使用的主要方法有： 使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液 提高反應(yīng)溫度，或采用微波方法 使用高離液鹽，LiCl，NaClO4等。 使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時減少樹脂擔(dān)載量（）合成多肽分析鑒定方法多肽的分析鑒定方法有多肽一級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級結(jié)構(gòu)包括：

19、質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD），NMR，X-衍射等方法。純度分析多肽的純度分析，一般都采用HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18，粒徑5m，孔徑300A，4.6150mm，流動相：A，0.1% TFA/H2O；B，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度，5%B-65%B，時間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強(qiáng)，在C18上保留很弱，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個改變分析梯度，可以將起始梯度改為2%，等度或小梯度洗脫；另外一個方法是在流動相中加入強(qiáng)離子對試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。一級結(jié)構(gòu)分析質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量，當(dāng)

20、然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是這個需要比較全的數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ)，分析才能比較準(zhǔn)確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定，需要采用軟電離技術(shù)，目前多肽分析主要使用了電噴霧（ESI-MS），基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI-MS）。其中ESI-MS通常會給出多電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的數(shù)目有關(guān)，因此，經(jīng)常給出了雙電荷，三電荷等離子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情況下很少帶多電荷，因此數(shù)據(jù)直接對應(yīng)了分子離子峰，容易分析。此外，通常在分析長肽或蛋白過程中，需要添加NH4，Na，K等離子，提高靈敏度，所以一般在MS中出現(xiàn)一組峰，分別對應(yīng)：（M+H）+，（M+NH4）+

21、，（M+Na）+，（M+K）+。氨基酸組成分析氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類，數(shù)目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110，用6M鹽酸水解16至72小時。酸水解雖然很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，因?yàn)樘於０泛凸劝滨０返膫?cè)鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計(jì)的，也可以通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水

22、解中也不能精確測定，要精確測量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。氨基酸序列分析氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，主要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉(zhuǎn)換等4個過程。首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在的堿性條件下對蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng)，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機(jī)溶劑（例如氯丁烷）從反應(yīng)液中萃取出來，而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物

23、不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用，再進(jìn)一步環(huán)化，形成一個穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程，整個測序過程現(xiàn)在都是通過測序儀自動進(jìn)行。二級結(jié)構(gòu)分析圓二色譜（CD）圓二色譜是一種特殊的吸收譜，它通過測量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色光譜，從而得到生物大分子的二級結(jié)構(gòu)，簡單、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，酶動力學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段（190-240nm），主要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。-螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm、208nm處呈負(fù)峰，在190nm附近有一正峰。-折疊構(gòu)象的CD譜，在2

24、17-218nm處有一負(fù)峰，在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜在198nm附近有一負(fù)峰，在220nm附近有一小而寬的正峰。核磁共振(NMR)隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展，使NMR逐漸成為大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、分布以及構(gòu)象。目前，NMR在分析分子中含少于30個氨基酸的小肽時是非常有用的，分析結(jié)果快速準(zhǔn)確。X-衍射X-衍射可獲得有關(guān)化合物晶型的直接信息，而且可以判斷相對與絕對構(gòu)型。 多肽標(biāo)記及修飾目前多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多，廣泛應(yīng)用在多肽藥物，多肽生物學(xué)，多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應(yīng)

25、用廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記（C13，H2），熒光標(biāo)記（FAM，F(xiàn)ITC），生物素標(biāo)記，磷酸化修飾等。非放射性核素標(biāo)記目前在非放射性核素標(biāo)記中，使用廣泛的仍然是C13，H2，因?yàn)槠涫褂冒踩派湫孕　，F(xiàn)在有比較完全的非放射性標(biāo)記的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法將標(biāo)記好的氨基酸直接連接到多肽上。熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡單。因此，目前在生物學(xué)研究中熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對于FITC標(biāo)記，需要在連接FITC前，增加一個氨基己酸，避免在切割的過程中被TFA

26、切割掉。生物素標(biāo)記生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。主要有用于標(biāo)記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用，當(dāng)然，也可以直接使用生物素也可以標(biāo)記，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上有個游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。磷

27、酸肽合成磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點(diǎn)，特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時候，連接效率低，最后產(chǎn)品純度很低，對于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM條

28、件下可以定量的脫除。后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷?；?，完成反應(yīng)。 蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功能的時候，總是先折疊出某些特殊的結(jié)構(gòu)，多肽類似物合成主要是為了模擬這些結(jié)構(gòu)，保持或提高生物活性，同時也為了改變多肽的穩(wěn)定性，提高其抗酶解能力。-螺旋多肽-螺旋是蛋白結(jié)構(gòu)中最為普通的一種，但是一般多肽在溶液中大多是無規(guī)卷曲的，目前使用最多的方法是多肽保持-螺旋結(jié)構(gòu)就是在多肽表面通過共價(jià)鍵將處在-螺旋結(jié)構(gòu)的兩個氨基酸連接起來，選擇的位點(diǎn)（i，i+4或i，i+7），選擇的化學(xué)鍵包括：二硫鍵，硫醚鍵，酰胺鍵，烯烴鍵（RCM）等方法。二硫鍵二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中，對穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程，可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測。硫醚鍵硫醚鍵的形成可以通過序列中的Lys，將溴乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上，利用其和巰基的特異性反應(yīng)，反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行，迅速高效。酰胺鍵多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成一般是利用Lys，Asp（Glu）的選擇性保護(hù)，在固相上直接環(huán)化。BOC策略中可以采用BOC-Lys（Fmoc），BOC-Asp（OFm