常用限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)保護(hù)殘基

1、酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基-PCR引物設(shè)計(jì)用于限制性內(nèi)切酶發(fā)布：2010-05-24 20:19|來源：生物吧|編輯：劉浩|查看：161 次本文給出了分 子克隆中常用限制 性內(nèi)切酶的保護(hù)堿基 序列，如Accl , Afllll , Asci , Aval ，BamHI ，Bglll ，BssHll ，BstEll ，BstXl ，Clal，EcoRl，Haelll ，Hindlll ，Kpnl ，Mlul，Ncol，Ndel，Nhel，Notl，Nsil，Pacl，Pmel ，Pstl，Pvul ， Sacl ， Sacll ， Sall ， Scal ， Smal ， Spel ， Sphl ， St

2、ul ， Xbal ，Xhol ，Xmal ，為什么要添加保護(hù)堿基？在分子克隆實(shí) 驗(yàn)中，有時(shí)我們會(huì)在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位點(diǎn)不容易直接 被限制性核酸內(nèi)切酶切開，因此在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，人為的在酶切位點(diǎn)序 列的5端外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護(hù)堿基，用來提高將來酶切時(shí)的 活性。其次，在分子克隆實(shí)驗(yàn)中選擇載體的酶切位點(diǎn)時(shí)，相臨的兩個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí) 使用，因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切害嘰該如何添加保護(hù)堿基？添加保護(hù)堿基時(shí)，最關(guān)心的應(yīng)該是保護(hù)堿基的數(shù) 目，而不是種類。什么 樣的酶切位點(diǎn)，添加幾

3、個(gè)保護(hù)堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護(hù) 堿基，如果嚴(yán)格點(diǎn)，是根據(jù)兩條引物 的Tm值和各引物的 堿基分布 及GC含量。如果某條引物 Tm值偏小，GC%較低，添加時(shí)多加 G或C，反之亦反。為了解不同內(nèi) 切酶對識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)?huì)有幫助（比如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí)），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近DNA末端時(shí)也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識(shí)別位點(diǎn)兩端至少加上 6個(gè)保護(hù)堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用y- 32 PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A 260單位的

4、寡核苷酸。取1 g已標(biāo)記了的寡核苷酸與 20單位的內(nèi)切酶，在 20 C條件下分別反 應(yīng)2小時(shí)和20小時(shí)。反應(yīng)緩沖液 含70mM Tris-HCl （pH 7.6）,10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT 及適量的 NaCI 或 KCl （視酶的具體要求而定）。20%的PAGE （ 7M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自 連接的寡核苷酸作為對照 。若底物有較長的回文結(jié) 構(gòu)，切 割效率則可能 因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACCo0CGGTC GACCGo0CCGGTC GACCGGo0Afl IIICACATG

5、TGo0CCACATGTGG9090CCCACATGTGGG9090Asc IGGCGC GCC9090AGGCGC GCCT9090TTGGCGC GCCAA9090Ava ICCCCGGGG5090CCCCCGGGGG9090TCCCCCGGGGGA9090BamH ICGGATCCG1025CGGGATCCCG9090CGCGGATCCGC G9090Bgi IICAGATC TGGAAGATC TTCGGAAGATCTTCC0752509090BssH IIGGCGC GCCAGGCGC GCCTTTGGCGC GCCAA00500090BstE IIGGGT(A/T)ACCC010B

6、stX IAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAAC TGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0252505090Cla ICATC GATGGATC GATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG009050009050EcoR IGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG909090909090Hae IIIGGGGCCCCAGC GGCC GCTTTGCGGCCGCAA909090909090Hi nd IIICAAGC TTG00CCAAGC TTGG00CCCAAGCTTGGG1075Kpn IGG

7、GTACCC00GGGGTACCCC9090CGGGGTACCCCG9090Mlu IGAC GCGTC00CGACGC GTCG2550Neo ICCCATGGG00CATGCCATGGCATG5075Nde ICCATATGG00CCCATATGGG00CGCCATATGGC G00GGGTTTC ATATGAAACCC00GGAATTCCATATGGAATTCC7590GGGAATTCCATATGGAATTCCC7590Nhe IGGCTAGCC00CGGC TAGCCG1025CTAGC TAGC TAG1050Not ITTGCGGCCGCAAATTTGC GGCCGC TTTAAA

8、ATATGC GGCCGC TATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAAC TATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA010102525010109090Nsi ITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT10909090Pac ITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG00002590Pme IGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGC TTTGTTTAAACGGCGC GCCGG000750255090Pst IGC TGCAGCTGCAC TGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGC

9、ATTGGAAAAC TGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0109090001090900Pvu ICCGATCGG00ATC GATC GAT1025TC GCGATC GCGA010Sac ICGAGCTC G1010Sac IIGCCGCGGC00TCCCCGCGGGGA5090Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GCGTC GAC GTC TTGGCCATAGC GGCCGCGG1050ACGCGTC GAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA1075Sca IGAGTAC TC1025A

10、AAAGTACTTTT7575Sma ICCCGGG010CCCCGGGG010CCCCCGGGGG1050TCCCCCGGGGGA9090Spe IGAC TAGTC1090GGAC TAGTCC1090CGGACTAGTCCG050CTAGAC TAGTC TAG050Sph IGGCATGCC00CATGCATGCATGACATGCATGCATGT0102550Stu IAAGGCC TT9090GAAGGCC TTC9090AAAAGGCCTTTT9090Xba ICTCTAGAG00GC TCTAGAGC9090TGC TCTAGAGCA7590CTAGTC TAGAC TAG7590Xho ICCTCGAGG00CCCTCGAGGG1025CCGCTCGAGCGG1075Xma ICCCCGGGG00CCCCCGGGGG2575CCCCCCG