大鼠肝癌細(xì)胞表面特標(biāo)記與成瘤能力有關(guān)

1、大鼠肝癌細(xì)胞表面特標(biāo)記與成瘤能力有關(guān) 【關(guān)鍵詞】 ,肝腫瘤 relationship between surface markers characteristic and tumorigenic ability in rat hepatocarcinoma cells 【abstract】 aim: to study the relationship between surface markers characteristic and tumorigenic ability in rat hepatocarcinoma cells. methods: the primary liver car

2、cinoma in rats were induced by diethylnitrosamine. tumor cells from 8 rats with primary liver carcinoma were separated according to rat oval cell (ovc) surface markers such as cd34, ckit, thy1, afp, ck7, ck8,ck14,ck18,ck19 and ggt.the tumor in nude rats which had been injected with hepatocarcinoma c

3、ells (10 ovc marker negative or positive cells ) for 1 month were weighted respectively. the subpopulations of hepatocarcinoma cells, which had a stronger ability to cause tumor after injected to nude rats, were diluted to 1/100 or 1/10 of original density. then we analyzed the tumorigenic ability o

4、f these subpopulations in a low cell density. results: the weight of the tumors in nude rats which had been injected with the cd34, thy1, afp, ck7, ck8 and ggt positive subpopulations was different from that of ones with the negative subpopulations (p0.05 or 0.01). the cell subpopulation of afp(+) o

5、r ck7(-) had a stronger ability to cause tumor when diluted to 1/100-1/10 of original density. conclusion: different subpopulations of the hepatocarcinoma cells had a different ability to cause tumor in rats. afp(+) and ck7 (-) may be the markers characteristic of hepatocarcinoma stem cells. 【keywor

6、ds】 liver neoplasms; stem cells; surface markers 【摘要】 目的：研究大鼠肝癌細(xì)胞表面標(biāo)記特征與成瘤能力關(guān)系. 方法：二乙基亞硝胺為誘癌劑制造大鼠肝癌模型，分離培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，按照卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記（cd34,ckit,thy1,afp，ck7，ck8,ck14,ck18,ck19和ggt）分選腫瘤細(xì)胞，比較各個表面標(biāo)記陽性腫瘤細(xì)胞亞群與陰性腫瘤細(xì)胞亞群移植裸鼠后成瘤能力差異，并且對數(shù)稀釋成瘤能力強(qiáng)的細(xì)胞亞群，分析低密度下強(qiáng)成瘤能力細(xì)胞亞群與相應(yīng)陰性細(xì)胞亞群成瘤差異. 結(jié)果： cd34,thy1,ck7,ck8,afp和ggt等6個標(biāo)記的陽性與陰性腫

7、瘤細(xì)胞移植裸鼠后，成瘤能力差異顯著(p0.05或0.01)；1/1001/10細(xì)胞密度的ck7陰性與afp陽性細(xì)胞亞群成瘤能力仍然比其對應(yīng)細(xì)胞亞群為高. 結(jié)論：大鼠原發(fā)性肝癌腫瘤細(xì)胞中存在成瘤能力差異巨大的腫瘤細(xì)胞亞群. ck7(-)和afp(+)，可能是大鼠肝癌干細(xì)胞的部分表面標(biāo)記特征. 【關(guān)鍵詞】 肝腫瘤；干細(xì)胞；表面標(biāo)記 0引言 腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells, tsc)是近年腫瘤科學(xué)研究的熱點. tsc來源于相應(yīng)的成體干細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生、擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)1-3. 目前肝癌干細(xì)胞的研究報道很少. 我們知道，卵圓細(xì)胞（oval cells, ovc）不僅具備基本的肝干細(xì)胞性質(zhì)

8、，而且與肝癌發(fā)生關(guān)系密切，是最接近肝癌干細(xì)胞的成體干細(xì)胞. 我們通過ovc表面標(biāo)記分選肝癌腫瘤細(xì)胞，了解不同肝癌細(xì)胞亞群的裸鼠成瘤能力，探索肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記特征. 1材料和方法 1.1材料雄性清潔級sd大鼠8只， 8 wk大，體質(zhì)量（233.824.5）g，雄性裸小鼠(balb/cnu/nu)，46 wk，體質(zhì)量1520 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供. 飼養(yǎng)溫度2225，濕度（505）%，在正常光照及自由攝食條件下飼養(yǎng)于普通飼養(yǎng)室，裸小鼠飼養(yǎng)于spf級飼養(yǎng)室. rpmi 1640與胎牛血清為美國gibco公司產(chǎn)品; 二乙基亞硝胺及胰蛋白酶為sigma公司產(chǎn)品;一抗cd34, ckit

9、,thy1,afp,ck7,ck8,ck14,ck18,ck19和ggt購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司. 1.2方法以二乙基亞硝胺為誘癌劑，70 mg/kg加入飼料中，每周1次，室溫2528. 誘癌至12 wk時改喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，共18 wk. 大鼠出現(xiàn)明顯肝癌癥狀，瀕臨死亡時提前取標(biāo)本. 大鼠誘癌成功后，無菌下取腫瘤組織約1 mm3，置于含青霉素的無菌rpmi 1640培養(yǎng)液中，用生理鹽水漂洗2次，剪碎，放入2.5 g/l胰蛋白酶消化液. 細(xì)胞消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液常規(guī)培養(yǎng). 采用ovc 10個表面標(biāo)記物（cd34，ckit，thy1，afp，ck7，ck8，c

10、k14，ck18，ck19和ggt）作為分選腫瘤細(xì)胞的特征標(biāo)記. 親和板結(jié)合分離法分選腫瘤細(xì)胞. 將100 l純化的羊抗鼠igg加入到無菌塑料平皿中，再加緩沖液3 ml混勻，4過夜，次日吸棄上清液， pbs洗去多余的抗體，含10 ml/l小牛血清pbs室溫下孵育，pbs洗3次，4保存?zhèn)溆? 取腫瘤細(xì)胞，每1106個細(xì)胞加入各ovc表面標(biāo)記工作液100 l,4作用1 h,培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，(1.52)107個加入到上面準(zhǔn)備好的塑料平皿中， hanks液稀釋為3 ml,輕輕搖勻，4 1 h（20 min搖1次）. 取懸液中細(xì)胞標(biāo)記為陰性細(xì)胞，洗脫黏附在塑料平皿的腫瘤細(xì)胞，標(biāo)記為陽性細(xì)胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)

11、. 調(diào)整腫瘤細(xì)胞（陽性細(xì)胞或陰性細(xì)胞）密度為51010l，取0.2 ml細(xì)胞懸液注射到裸鼠腋背部皮下，觀察裸鼠移植腫瘤生長情況，1 mo裸鼠移植腫瘤測質(zhì)量. 對致瘤能力強(qiáng)的腫瘤亞群進(jìn)行對數(shù)稀釋（1/100或1/10）后，取0.2 ml細(xì)胞懸液注射到裸鼠腋背部皮下，1 mo測量移植腫瘤質(zhì)量，了解強(qiáng)致瘤腫瘤細(xì)胞亞群低細(xì)胞密度下致瘤能力. 統(tǒng)計學(xué)處理：各組肝癌細(xì)胞亞群成瘤能力以腫瘤細(xì)胞移植裸鼠后形成腫瘤質(zhì)量表示，均通過spss 10.0軟件進(jìn)行配對t檢驗. p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 2結(jié)果 cd34，thy1，ck7，ck8，afp和ggt等6個標(biāo)記的陽性與陰性腫瘤細(xì)胞移植裸鼠1 mo后，成瘤

12、能力差異顯著(p0.05)，而按照ck7， thy1與afp這2個表面標(biāo)記分選的腫瘤細(xì)胞亞群成瘤能力差異尤其明顯（p0.01,表1）. 將成瘤能力差異顯著的陽性與陰性腫瘤細(xì)胞（cd34,thy1,ck7,ck8,afp和ggt）進(jìn)行對數(shù)稀釋，1 mo后觀察發(fā)現(xiàn)，高致瘤亞群ck7（-）和afp(+)在1/10密度接種條件下，成瘤比例保持在100%，仍然大大高于原密度接種的對應(yīng)低致瘤亞群細(xì)胞ck7（+）和afp(-)；甚至在1/100密度接種條件下，這2個細(xì)胞亞群仍然有一定的成瘤比例. 高致瘤亞群thy1(+)也有較高的成瘤比例，但是較ck7（-）和afp(+)稍弱. cd34 (+)，ck8 (

13、+)與ggt (+)亞群對數(shù)稀釋后成瘤比例大幅度下降，比對應(yīng)低致瘤亞群細(xì)胞原密度接種條件下的成瘤比例低（表2）. 表1表面標(biāo)記物分選的陽性與陰性細(xì)胞亞群的成瘤質(zhì)量(略) ap0.05, bp0.01 vs陽性細(xì)胞. 表2低接種密度下強(qiáng)致瘤亞群裸鼠成瘤比率(略) 3討論 tsc表現(xiàn)為一種特殊類型的干細(xì)胞，具備高度增殖能力與自我更新能力，也具備多向分化的潛能. tsc增殖過程中，通過不均一分裂，一個tsc分裂形成一個新的tsc，和另一個可最終分化為包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的子細(xì)胞，其結(jié)果是維持tsc數(shù)目穩(wěn)定并產(chǎn)生腫瘤. 大量的證據(jù)表明，tsc起源于相對應(yīng)的成體干細(xì)胞4. ovc不僅是肝臟干細(xì)胞的

14、子代細(xì)胞，也是肝癌發(fā)生的前體細(xì)胞. ovc經(jīng)致癌劑或癌基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后可形成肝細(xì)胞癌、膽管上皮癌和未分化癌. ovc是肝細(xì)胞癌、膽管上皮癌的祖細(xì)胞，與肝腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系. 所有癌組織內(nèi)顯示charas基因表達(dá)陰性，而癌旁組織內(nèi)則可見ras基因的大量表達(dá)，證實了ovc是宿主受化學(xué)致癌劑作用后發(fā)生肝癌的始動細(xì)胞5. 大鼠肝臟出現(xiàn)大量的ovc將不可避免地發(fā)展成肝細(xì)胞癌. ovc是肝癌前體細(xì)胞. ovc存在于人類慢性肝病的肝臟組織中，也存在于人類肝細(xì)胞癌和癌旁組織中6. 我們采用ovc的表面標(biāo)記分選肝癌細(xì)胞，研究不同肝癌細(xì)胞亞群的裸鼠成瘤能力，發(fā)現(xiàn)存在一定的差別. 其中cd34，thy1，ck7，

15、ck8，afp和ggt等6個標(biāo)記的陽性與陰性腫瘤細(xì)胞移植裸鼠后，成瘤能力差異顯著，而按照afp，ck7與thy1這3個表面標(biāo)記分選的腫瘤細(xì)胞亞群成瘤能力差異尤其明顯. 在1/100細(xì)胞密度下， afp（+）與ck7（-）腫瘤細(xì)胞亞群成瘤能力仍強(qiáng)于對應(yīng)陰性或陽性腫瘤細(xì)胞亞群，說明afp（+）與ck7（-）腫瘤細(xì)胞亞群具備非常大的成瘤能力，具備一定的tsc特征，表明afp（+）與ck7（-），甚至thy1（+），是大鼠肝癌tsc的部分可能表面標(biāo)記，對肝癌tsc的最終分離與鑒定具有重要的意義. 【參考文獻(xiàn)】 1 pardal r, clarke mf, morrison sj. applying t

16、he principles of stemcell biology to cancerj. nat rev cancer,2003,3(12):895-902. 2 behbod f, rosen jm. will cancer stem cells provide new therapeutic targets j? carcinogenesis, 2005，26(4):703-711. 3 nakano i, hemmati hd, kornblum hi.cancer stem cells in pediatric brain tumorsj. no shinkei geka,2004，32(8):827-834. 4 alhajj m, becker mw, wicha m,et al. therapeutic implications of cancer stem cellsj. curr opin genet dev,2004，14(1):43-47. 5 beckerr,luthgens b,oesch f,et al.ha