人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞

1、人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞 摘要 目的：探討人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為應(yīng)用人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行骨科細(xì)胞治療提供依據(jù)。方法：抽取人骨髓組織，梯度離心后置于含100 ml/l小牛血清的dmem培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h換液，待細(xì)胞完全貼壁融合長(zhǎng)滿瓶底后，胰酶消化，傳代，換誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)合細(xì)胞化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定，以及采用細(xì)胞增殖法(mtt比色試驗(yàn))分別于1、2、4、6、8 d測(cè)細(xì)胞od值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果：傳代細(xì)胞45 d即可傳代，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2 周形成多層結(jié)構(gòu)，并聚集成黑色結(jié)節(jié)。培養(yǎng)細(xì)胞alp染

2、色強(qiáng)陽性，型膠原免疫組化染色呈黃褐色，細(xì)胞在接種后36 d增殖最快。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)所培養(yǎng)的細(xì)胞符合成骨細(xì)胞的形態(tài)特征和生物學(xué)特性。 關(guān)鍵詞 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；成骨細(xì)胞 中圖分類號(hào) r-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼b 文章編號(hào)1673-7210（2008）01（b）-041-02 近年來，干細(xì)胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)分化取得了較大進(jìn)展，越來越多的研究證明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可定向地向成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化1，2，是骨組織工程中種子細(xì)胞的重要來源，同時(shí)在臨床治療骨不連、骨缺損等方面具有巨大的應(yīng)用潛能。 1材料和方法 1.1材料 淋巴細(xì)胞分離液、dmem高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（gibc

3、o公司）、小牛血清、維生素c、地塞米松及兔抗人型膠原抗體（sigma公司，美國(guó)）、兔抗人型膠原抗體（博士德公司）、abc免疫組化檢測(cè)試劑盒、噻唑藍(lán)、二甲基亞砜（amersco公司）。 1.2 方法 1.2.1人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞參照文獻(xiàn)35，無菌條件下，以含5 ml肝素鈉生理鹽水(100 u/ml)的20 ml注射器，于骨不連患者（術(shù)前檢查肝腎功能正常，無代謝性骨病，經(jīng)患者同意）髂后上棘穿刺抽取骨髓組織5 ml，移入含5 ml肝素鈉鹽水的螺口試管內(nèi)，混勻，加入含10 ml ficoll梯度液的離心管中，進(jìn)行梯度離心(3 000 r/min20 min)，吸管吸取單核細(xì)胞部

4、分(云霧狀層)，以dmem洗滌兩遍(1 000 r/min5 min)，按1105 cells/ml細(xì)胞數(shù)接種于25 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入5 ml含100 ml/l小牛血清的dmem，在37、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液，清除懸浮細(xì)胞，而后隔日換液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底80%后，去培養(yǎng)液，加0.25%胰蛋白酶1 ml，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使胰蛋白酶覆蓋整個(gè)皿底，37 消化3 5 min，鏡下見細(xì)胞皺縮，間距加大，分離為單個(gè)小圓細(xì)胞時(shí)，滴加dmem 培養(yǎng)液中止消化，然后吹打呈細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液移入15 ml 離心管，離心10 min，1000 r/min，棄上清，沉淀細(xì)胞加含血

5、清dmem培養(yǎng)液5 ml吹打呈細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶在37、5% co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)。傳代改用含地塞米松和維生素c的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增，誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成：含100 ml/l胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基加入地塞米松和維生素c，終末濃度分別為10 mol/l和50 ng/l。 1.2.2 人骨髓成骨細(xì)胞的鑒定 1.2.2.1 倒置顯微鏡觀察觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)速度。 1.2.2.2 細(xì)胞堿性磷酸酶(alp)化學(xué)染色第3代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，胰酶消化制成濃度為1105 cells/ml的細(xì)胞懸液，接種于事先放入蓋玻片的24孔板內(nèi)，加入定量含100 ml/l小牛血清的dmem培養(yǎng)液，培

6、養(yǎng)3 d后取出，4生理鹽水沖洗，置于冷丙酮中固定15 min，而后用鈣鈷法染色測(cè)定細(xì)胞alp活性，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。 1.2.2.3 型及型膠原抗體免疫組化染色將1105 cells/ml的成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞懸液接種于24孔板內(nèi)的蓋玻片上，培養(yǎng)3 d后取出，40 g/l多聚甲醛4下固定15 min，乙醇脫水后吹干，以兔抗人型及型膠原抗體為一抗，按標(biāo)準(zhǔn)abc檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。陽性為黃褐色。 1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)（mtt比色試驗(yàn)）以0.25胰蛋白酶消化培養(yǎng)瓶中的第三代貼壁細(xì)胞23 min，去胰蛋白酶，加含血清dmem終止消化，把所得細(xì)胞懸液配成濃度為1104 cells/

7、ml。取5塊96孔板，每塊板5孔各加入細(xì)胞懸液200 l，在37、5co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h?？瞻讓?duì)照孔以200 l dmem代替細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種后24 h為零點(diǎn)，接種后1、2、4、6、8 d用mtt比色試驗(yàn)6測(cè)細(xì)胞在支架上的增殖：每次各孔加5 mg/l的mtt 20 l，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，去孔內(nèi)液，加0.25胰蛋白酶消化23 min，加dmem 200 l終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄孔內(nèi)液，每孔加150 l dmso，振蕩10 min，在model 550酶標(biāo)儀上讀取od值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 2 結(jié)果 2.1倒置顯微鏡觀察 細(xì)胞接種后

8、24 h大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈梭形，并有積聚，呈團(tuán)簇生長(zhǎng)傾向。45 d細(xì)胞體積增大，帶有粗大突起，并向多角形轉(zhuǎn)化，1周細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的梭形。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，68 h基本貼壁，呈長(zhǎng)梭形或大多角形，45 d即可傳代。改用條件培養(yǎng)液后細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯變慢，1周左右細(xì)胞長(zhǎng)滿，呈現(xiàn)成骨細(xì)胞形態(tài)（見圖1），三角形、多角形，多有偽角，細(xì)胞核偏于一側(cè)。2 周后細(xì)胞聚集，細(xì)胞變長(zhǎng)趨向于梭形，可見重疊生長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞增殖加快，有黑色結(jié)節(jié)形成。 2.2細(xì)胞堿性磷酸酶染色 alp陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈灰黑色，染色后大部分細(xì)胞均呈陽性反應(yīng)，強(qiáng)陽性細(xì)胞多為大多角形，而梭形細(xì)胞染色略弱（采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，計(jì)算平均陽性細(xì)

9、胞百分率為86.5%），見圖2。 2.3,型膠原免疫組化染色 經(jīng)abc法染色，型膠原抗體染色細(xì)胞胞核周圍呈黃褐色，而型膠原抗體染色為陰性，見圖3。 2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 取第三代人骨髓成骨細(xì)胞接種后1、2、4、6、8 d細(xì)胞的od值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖4）。發(fā)現(xiàn)人骨髓成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)在第36日生長(zhǎng)活躍，增殖迅速，培養(yǎng)第8日后進(jìn)入細(xì)胞增殖穩(wěn)定期。 3 討論 骨折愈合的主角是成骨細(xì)胞，骨不愈合或延遲愈合的主要原因也是缺乏足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞。因此，本實(shí)驗(yàn)的設(shè)想是利用自體骨髓進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，并進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的細(xì)胞回植骨折處，促進(jìn)骨折愈合，縮短骨折愈合時(shí)間。 體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞是研究成骨機(jī)制

10、的重要手段，且用于臨床治療骨不連、骨缺損的修復(fù)具有重要意義。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，且具有組織依賴性分化能力，目前在細(xì)胞治療方面十分引人注目7，8。以往培養(yǎng)的成骨細(xì)胞多取材于人或動(dòng)物的骨和骨膜組織，利用具有成骨潛能的骨髓組織培養(yǎng)成骨細(xì)胞具有取材方便、對(duì)供體損傷小和可經(jīng)皮注射，移植前可以在體外大量穩(wěn)定擴(kuò)增9，術(shù)后無須長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑等優(yōu)點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)以往的成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法加以了改進(jìn)，簡(jiǎn)化了操作，縮短了細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間；并在培養(yǎng)基中添加了維生素c和地塞米松，有研究表明維生素c可以促進(jìn)細(xì)胞的分化，地塞米松不僅可以使骨髓基間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分

11、化10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞貼壁時(shí)間短，增殖速度快。通過培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及成骨細(xì)胞具有特征性的鑒定11：培養(yǎng)細(xì)胞具有較高的堿性磷酸酶活性，能夠合成型膠原，而不能合成型膠原，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞，結(jié)果還表明，骨髓誘導(dǎo)來源的成骨細(xì)胞在體外可以穩(wěn)定傳代，增殖速度較快。因此，我們這種利用骨髓在體外進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法是可行的。 參考文獻(xiàn) 1horwitz em. stem cell plasticity：the growing potential of cellular therapyj. archk med res,2003,34（6）：600-606. 2喻本桐，馬燕琳，劉季春，等

12、.成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能特性j.江蘇醫(yī)藥，2007，33（07）:686-687. 3李春暉，焦寶華，康春生，等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記的初步研究j.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22（5）:601-602. 4kassem m，risteli l，mosekilde l.et al.formation of osteoblast-like cells from human mononuclear bone marrow culturesj.apmis，1991,99（3）：269-274. 5殷曉雪，陳仲?gòu)?qiáng)，郭昭慶，等.人骨髓間充質(zhì)質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及鑒定j.

13、中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2004，18（2）：88-91. 6ci z，hui s. determination of pretransplant viability of leydig cells by mtt colorimetric assayj.transplantation proceedings，2002，34：3419. 7劉長(zhǎng)安，王江泳，張衛(wèi)平，等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔股骨頭缺血性壞死的實(shí)驗(yàn)研究j.中國(guó)矯形外科雜志，2007，15（1）：58-60. 8范紅旗，孫輝生.骨髓間充質(zhì)質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化研究進(jìn)展j.臨床軍醫(yī)雜志，2006，34（3）:349-351. 9柴剛，張艷，劉偉，等.人骨髓基質(zhì)細(xì)胞在骨組織工程臨床應(yīng)用中的探討j.中國(guó)臨床康復(fù)，2002，（22）：3340-3341. 10wexler sa，donaldson c，denning kendall p，et al.adult bone marrow is a rich source of human mesenchymalstemcells but umbilical cord and mobilized adult blood are notj.br j haematol，2003，121（4）：368- 374