依達(dá)拉奉對(duì)心肺復(fù)蘇小鼠腦的保護(hù)作用

1、依達(dá)拉奉對(duì)心肺復(fù)蘇小鼠腦的保護(hù)作用 doi：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.08.015 基金項(xiàng)目：深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201103250）；龍崗區(qū)科技創(chuàng)新局基金（ys2011041） 作者單位：518172深圳，深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院急診科（王合金），重癥醫(yī)學(xué)科（陽(yáng)書坤、劉渠），心內(nèi)科（黃戰(zhàn)軍）；深圳市人民醫(yī)院（高占良）；深圳市疾病與預(yù)防控制中心毒理室（何建凡）心肺復(fù)蘇（cpr）后的存活率和神經(jīng)功能的恢復(fù)率依然很低1，主要的并發(fā)癥為神經(jīng)功能損害和多器官功能衰竭2。依達(dá)拉奉對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用，能改善缺血性腦損傷患者神經(jīng)功能的預(yù)后。本研究擬通過(guò)檢測(cè)復(fù)蘇后小

2、鼠血清和腦組織勻漿超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛 （mda）和s-100蛋白濃度變化，從而探討早期使用依達(dá)拉奉對(duì)心肺復(fù)蘇后小鼠腦組織的保護(hù)作用。 1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇36只雄性、體質(zhì)量在2030 g之間的清潔級(jí)昆明小鼠（深圳市疾病預(yù)防與控制中心提供），在室溫條件，白晝各12 h交替、標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)1周后再進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為3組：實(shí)驗(yàn)組（依達(dá)拉奉組）、對(duì)照組和假手術(shù)組（健康組）。 1.2方法 1.2.1模型制備心肺復(fù)蘇模型的制作參照文獻(xiàn)3-4進(jìn)行。小鼠經(jīng)腹腔注射烏拉坦（1 mg/g）麻醉，經(jīng)口腔插22 g管，機(jī)械通氣。維持體液平衡，在手術(shù)之前給予等滲鹽水

3、15 l/g。左側(cè)頸動(dòng)脈插管測(cè)量血壓（通過(guò)壓力換能器與bl- 420e生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接以監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓）和心率。左側(cè)頸靜脈置管用于給藥。 心臟驟停模型制備：經(jīng)食管心室起搏誘發(fā)室顫，4極5f起搏電極經(jīng)口插入食管約4 cm，電極近端與bl-420e生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的電生理刺激輸出端相連。先測(cè)定心室起搏閾值（通常起搏電壓為1518 v，脈寬58 ms），誘發(fā)室顫電壓應(yīng)高于起搏閾值35 v。采用連續(xù)快速起博誘發(fā)室顫，所需參數(shù)為：電壓20 v、脈寬10 ms、頻率20 hz。當(dāng)起搏90 s后暫停起搏并觀察12 s，如心電圖顯示起搏誘發(fā)出來(lái)的室顫自動(dòng)轉(zhuǎn)律時(shí)，應(yīng)立即再起搏30 s，直至誘發(fā)出的室顫持續(xù)存在、

4、或出現(xiàn)無(wú)脈性電活動(dòng)或一條直線（無(wú)心電活動(dòng)）為止，通常需要起搏90180 s不等。心臟驟停成功誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)為動(dòng)脈血壓消失和心電圖證實(shí)出現(xiàn)心搏停止。在心搏停止期間，機(jī)械通氣停止3 min。心搏停止3 min后，予以胸心外按壓。人工手法進(jìn)行胸外心臟按壓，頻率200次/min，按壓深度為小鼠胸廓前后徑1/3。同時(shí)給予腎上腺素（0.4 g/g），必要時(shí)給予2 j雙相波電除顫。同時(shí)恢復(fù)機(jī)械通氣。 機(jī)械通氣潮氣量為12 l/g，呼吸頻率為150次/min，fio2為1.0。當(dāng)自主循環(huán)恢復(fù)后，呼吸頻率減少為130次/min，同時(shí)fio2調(diào)整為0.4。cpr不成功的標(biāo)準(zhǔn)心肺復(fù)蘇10 min后仍無(wú)生命體征。腎上腺素在

5、cpr過(guò)程中最大劑量為重復(fù)使用3次。 1.2.2給藥方法心肺復(fù)蘇成功后實(shí)驗(yàn)組立即給予靜脈注射依達(dá)拉奉注射液3 g/g，對(duì)照組給予注射等量的生理鹽水。假手術(shù)組只進(jìn)行相關(guān)手術(shù)操作，不制備心肺復(fù)蘇模型。繼續(xù)其他相關(guān)治療。 1.2.3小鼠血清和腦組織勻漿sod、mda和s-100蛋白含量的測(cè)定復(fù)蘇后12 h后全部處死所有小鼠，并采取斷頭法采取小鼠血液3 ml，3000 r/min離心15 min，取上清液，-70 冰箱保存批量檢測(cè)。 取血后迅速打開大腦，取一側(cè)腦組織，以腦組織（mg）：生理鹽水（ml）=101的比例在盛有冰塊的器皿中用勻漿機(jī)研磨成腦勻漿，4 下3000 r/min離心15 min，取上

6、清液進(jìn)行上述指標(biāo)檢測(cè)。用化學(xué)比色法檢測(cè)sod、mda濃度（試劑購(gòu)置美國(guó)beckman公司）。 使用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行血清學(xué)s-100蛋白含量測(cè)定（試劑購(gòu)置南京建成生物有限公司）。上述操作嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明操作。 1.2.4腦細(xì)胞組織病理學(xué)觀察取一側(cè)大腦半球置10%福爾馬林溶液固定 24 h。系列酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，常規(guī)制作石蠟切片，蘇木素-伊紅（he）染色，顯微鏡下觀察大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞學(xué)病理變化。 1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件spss 10.0進(jìn)行分析，包括單因素方差分析、多組均數(shù)兩兩比較的bonferroni法或tamhane法檢驗(yàn)和pea

7、rson相關(guān)分析。以p 2結(jié)果 2.1復(fù)蘇后小鼠心電圖 復(fù)蘇后小鼠心電圖，見圖1。 圖1復(fù)蘇后小鼠心電圖2.2腦組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞核大，形態(tài)規(guī)則，核仁明顯，尼氏小體可見，形態(tài)完整。對(duì)照組大腦皮層細(xì)胞核濃縮，核形態(tài)多樣，核仁不清，尼氏小體未見，可見胞體變小，水腫明顯。實(shí)驗(yàn)組腦細(xì)胞可見少許核濃縮，形態(tài)稍不規(guī)則，尼氏小體可見，細(xì)胞周圍間隙稍增大，水腫不明顯。見圖1。 a：假手術(shù)組；b：對(duì)照組；c：實(shí)驗(yàn)組 圖2各組小鼠大腦皮層的病理學(xué)改變（he400）2.3各組小鼠血清sod、mda和s-100蛋白 依達(dá)拉奉組小鼠血清sod質(zhì)量濃度在心肺復(fù)蘇12 h后較對(duì)照組明顯升高，但低于假手

8、術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)結(jié)果表明，依達(dá)拉奉組小鼠血清mda質(zhì)量濃度較對(duì)照組明顯降低，高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清s-100蛋白質(zhì)量濃度檢測(cè)顯示，拉奉組小鼠血清s-100蛋白質(zhì)量濃度較對(duì)照組明顯降低，高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。表1各組小鼠血清sod、mda和s-100蛋白（xs） 結(jié)果表明，依達(dá)拉奉組小鼠腦組織勻漿sod濃度較對(duì)照組升高，低于假手術(shù)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）；依達(dá)拉奉組小鼠腦組織勻漿mda濃度較對(duì)照組明顯降低，高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）；見表2。表2各組小鼠腦組織sod、mda和s-100蛋白濃度比較（xs） 小鼠血清

9、sod與mda質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，與s-100蛋白質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，r分別為-0.621，-0.463，p 3討論 心肺復(fù)蘇是危重疾病的搶救和治療過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題， 復(fù)蘇成功后由于長(zhǎng)時(shí)間的缺血缺氧，腦組織可能造成不同程度的損傷。目前認(rèn)為缺血-再灌注后氧自由基增多是導(dǎo)致腦損傷加重的主要原因5。在再灌注期間，由于線粒體功能障礙，導(dǎo)致大量的氧自由基生成。氧自由基能引起脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白氧化和dna斷裂等損傷，從而進(jìn)一步加速腦細(xì)胞死亡。這些復(fù)雜的級(jí)聯(lián)損害可持續(xù)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)日6。丙二醛（mda）是脂質(zhì)過(guò)氧化的終末產(chǎn)物之一，可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，超氧化物歧化酶（sod）是機(jī)體內(nèi)源性氧自由基清除劑，反映機(jī)

10、體氧自由基清除能力。s-100蛋白具有高度神經(jīng)元特異性，且穩(wěn)定性好，不受肝素、魚精蛋白、溶血、低溫等因素影響。當(dāng)腦組織缺氧受損時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞和血-腦屏障通透性均增加，神經(jīng)元胞漿內(nèi)大量 s- 100蛋白釋放入外周血。s-100蛋白被認(rèn)為是檢測(cè)早期腦損傷和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)7-8。腦細(xì)胞對(duì)缺血缺氧十分敏感，特別是大腦皮層結(jié)構(gòu)，對(duì)缺氧更為敏感，在其缺氧早期就有腦細(xì)胞的變性或壞死。腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變也被認(rèn)為是腦組織損傷的最直接的證據(jù)9。 cpr后的腦保護(hù)除了恢復(fù)有效的腦血供外，減少氧自由基的形成和清除氧自由基及抑制氧自由基的作用顯得十分重要。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有明確有效作用于心肺復(fù)蘇后早期腦保護(hù)的藥物。無(wú)

11、論是鈣通道阻滯劑、糖皮質(zhì)激素、鎂制劑還是聯(lián)合使用安定和鎂制劑，其均能在改善患者的癥狀上起到一定的作用，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)其能明顯改善患者的預(yù)后6。因此，對(duì)cpr復(fù)蘇后早期腦保護(hù)的藥物的選擇和使用是目前國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，在成功進(jìn)行心肺復(fù)蘇后，使用依達(dá)拉奉組小鼠血清sod濃度明顯高于對(duì)照組，但低于假手術(shù)組；同時(shí)研究還顯示，實(shí)驗(yàn)組mda血清濃度明顯低于對(duì)照組，但高于假手術(shù)組。血清s-100蛋白質(zhì)量濃度結(jié)果類似于mda。腦組織勻漿上述腦組織損害與保護(hù)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與血清學(xué)結(jié)果類似。相關(guān)分析顯示血清sod與mda質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，與s-100蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)；mda濃度與s-100

12、蛋白質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。病理學(xué)組織學(xué)形態(tài)結(jié)果表明，使用依達(dá)拉奉后能明顯減輕腦細(xì)胞水腫，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞。本研究結(jié)果表明依達(dá)拉奉對(duì)心肺復(fù)蘇小鼠具有明顯的腦保護(hù)作用。 參考文獻(xiàn) 1廖曉星.心搏驟停后的腦保護(hù)策略j.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2010，19（1）：7-10. 2 geocadin rg， koenig ma， jia x， et al. management of brain injury after resuscitation from cardiac arrest j. neurol clin ，2008，26（2）：487-506. 3 李肖亮，單愛軍，杜波，等. 急危重癥患者繼發(fā)性腦損傷

13、救治中腦保護(hù)的研究進(jìn)展j/ cd.中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志：電子版，2011，4（1）：47-52. 4 朱軍，方向韶，符岳，等. 窒息法與室顫法心肺復(fù)蘇動(dòng)物模型的比較研究j. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（1）：14-19. 5 陳壽權(quán)，何愛文. 心搏驟停后心腦損傷：線粒體相關(guān)途徑j(luò). 中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2013，22（1）：8-10. 6 geocadin rg， koenig ma， stevens rd， et al. intensive care for brain injury after cardiac arrest ： therapeutic hypothermia and re

14、lated neuro protective strategies j.crit care clin， 2006， 22 （4） ： 619 -636. 7 黃效模，湯旭，周厚榮，等.亞低溫對(duì)窒息大鼠心肺復(fù)蘇后s100b蛋白及膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響j.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（5）：715-718. 8 dassan p， keir g， brown mm. criteria for a clinically informative serum biomarker in acute ischaemic stroke： a review of s100b j. cerebrovasc dis ，2009 ，27 （3）：