合生素對肉仔雞腸道微生物區(qū)系的影響效應研究

1、合生素對肉仔雞腸道微生物區(qū)系的影響效應研究楊會玲1，許堯興2，周利勇1，高玉鵬基金項目：浙江省重大科技攻關資助項目（2008c12052）；浙江省農業(yè)科學院創(chuàng)新提升工程（2010r17y01d01）聯(lián)系方式：楊會玲，tele-mail： yhl200704。通信作者高玉鵬，tele-mail：gaoyupeng112（1 西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2浙江省農科院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310021）摘要：【目的】研究合生素對肉仔雞盲腸微生物區(qū)系的影響?！痉椒ā窟x擇1日齡肉仔雞450只，隨機分成5個日糧處理

2、，分別為基礎日糧、基礎日糧+抗生素、基礎日糧+益生素、基礎日糧+益生元、基礎日糧+合生素。每處理3個重復，每個重復30只。在21d、42d每個重復選擇4只屠宰，無菌采集盲腸內容物，提取細菌基因組總dna，pcr擴增16s rdna，用dgge方法分析盲腸細菌群落結構的變化，用實時熒光定量pcr檢測腸道中總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌數(shù)量。【結果】在21、42日齡，日糧添加合生素比單獨應用益生素、益生元或抗生素提高了肉仔雞的平均日增重和飼料轉化率（p0.05），肉仔雞盲腸dgge條帶數(shù)（菌群豐富程度）均高于對照組、抗生素組、益生素組、益生元組；基因測序分析發(fā)現(xiàn)肉仔雞盲腸中特異條帶主要是不可培

3、養(yǎng)細菌。合生素能促進盲腸總菌數(shù)、雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，抑制大腸桿菌數(shù)量。【結論】合生素對肉仔雞促生長的效用與其對盲腸菌群的調控作用有關，且合生素的效果優(yōu)于益生素、益生元或抗生素。關鍵詞：合生素；肉仔雞；腸道菌群；dgge；qpcreffects of dietary synbiotics on intestinal microbial ecology in broiler chickensyang hui-ling1, xu yao-xing2, zhou li-yong1, gao yu-peng1(1college of animal science, northwest a&f un

4、iversity, yangling, shaanxi 712100; 2institute of plant protection and microbiology, zhejiang academy of agricultural science, hangzhou, zhejiang 310021)abstract:【objective】this study was carried out to investigate the effects of dietary supple- mentation of synbiotics on intestinal microbial flora

5、ecology in broilers.【method】four hundred and fifty 1-d-old “cobb 48” broiler chicks were randomly assigned to 1 to 5 dietary treatments , each treatments allocated to 3 replicates of 30 broilers. the dietary treatments were 1) control, 2) basal diets supplemented with antibiotics, 3) basal diets sup

6、plemented with probiotics, 4) basal diets supplemented with prebiotics, 5) basal diets supplemented with synbiotics. on d 21, 42, four birds from each replicate were randomly selected and killed, cecal contents were aseptically collected, extraction the total genomic dna, then analyzing the intestin

7、al bacterial community by denaturing gradient gel electrophoresis(dgge) analysis of universal 16s rdna after amplication with pcr, detecting the populations of tobal bacteria, lactobacillus, bifidobacterium and e.coil by real-time pcr.【result】on d 21 and 42, the supplementation of synbiotics increas

8、ed average daily gain and feed conversion ratio, compared with prebiotics, probiotics or antibiotics alone (p0.05), and the number of pcr-denaturing gradient gel electrophoresis bands of synbiotics-fed group was higher than those in the control, antibiotics, probiotics and prebiotics groups.gene seq

9、uences analysis indicated that the specific bands were mainly uncultured bacteria in cecum of broilers. dietary synbiotics increased the populations of total bacteria, lactobacillus, bifidobacterium and e.coil.【conclusion】the effects of synbiotics on growth performance was consistent with that on in

10、testinal microbial ecology, and the effects of synbiotics is better than probiotics, prebiotics or antibiotics alone.key words: synbiotics, broiler, intestinal microflora,denaturing gradient gel electrophoresis, real-time pcr0 引言【研究意義】菌群對家禽的生長和健康具有重要作用。腸道內有益菌群不僅能有助動物消化功能，而且能合成多種維生素，對病原菌有拮抗作用，還可分泌許多免

11、疫物質，促進動物免疫功能。日糧因素可影響胃腸道不同部位的微生物菌群組成1,2。合生素是由益生素和益生元組合而成，能同時發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，促進動物健康，提高生產性能3?！厩叭搜芯窟M展】腸道微生物是動物消化系統(tǒng)的一個組成部分，其種類和數(shù)量隨著動物年齡和日糧類型的差異而不同4，許多研究表明，家禽盲腸中的微生物種類較其它消化道豐富。但迄今為止，關于合生素對家禽腸道微生物區(qū)系的影響，主要是利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基法對菌群數(shù)量的檢測，鮮有利用分子生物學技術對腸道微生物群落結構及多樣性的研究。更何況動物腸道微生物種類多數(shù)是不可培養(yǎng)的，基于16s rrna的變性梯度凝膠電泳（pcr-dgge）技術則克服了這種缺陷5。

12、pcrdgge的基本原理是長度相同而堿基組成不同的dna序列在不同變性條件下（如尿素和甲酰胺濃度）變性，在變性梯度凝膠電泳上特定位置形成特定泳帶，不同泳帶代表不同的微生物種類，從而反應腸道微生物的結構和多樣性6，關于此類研究近年來較多7,8,9。但是，由于pcrdgge技術只能檢測到占整個菌落細菌數(shù)量約1%或以上的類群10，即細菌數(shù)量要大于108 cfu/g11，因此需要其他方法來檢測微量細菌的數(shù)量。實時熒光定量pcr（real-time fluorescent quantitative pcr，fq-pcr，qpcr），是一種在pcr反應體系中加入熒光染料或熒光集團，利用反應過程中熒光信號的

13、累積實時監(jiān)測整個pcr過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法12。qpcr可以檢測到糞便中低至101102拷貝數(shù)的細菌的16s rrna13，具有操作簡便、高敏感性和特異性而被用于動物腸道菌群定量檢測。關于日糧中添加合生素飼喂肉仔雞的效果已有報道14,15,16，【本研究切入點】但未見對由枯草芽孢桿菌、低聚木糖及低聚甘露糖復合制成的合生素的試驗研究?！緮M解決的關鍵問題】本試驗在肉仔雞基礎日糧中分別加入由枯草芽孢桿菌、低聚木糖和低聚甘露糖復合制成的合生素，并將其與日糧中單獨使用抗生素、益生素、益生元進行比較，利用pcrdgge和qpcr技術探討其對肉仔雞腸道微生物區(qū)系結構的影響。1

14、材料和方法選擇450只1日齡健康的“科寶48”肉仔雞，隨機分成5個處理組，每組3個重復，每個重復30只。試雞在密閉控溫雞舍的小群體肉雞專用籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，育雛期13d舍溫33，以后每周降3至室溫保持在22左右。試雞免疫程序：3、10日齡分別進行新城疫疫苗點眼免疫，28日齡飲水免疫；14、22日齡分別進行法氏囊飲水免疫。常規(guī)飼養(yǎng)管理。試驗基礎日糧與營養(yǎng)水平見表1。表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平table1 composition (%)of the basal experimental diet and nutrient level成分compositon 021日齡starter die

15、t2242日齡growth diets玉米 corn (%)6165豆粕 soybean meal (%) 31.628.6魚粉 fish meal (%)43磷酸氫鈣calcium monophosphate (%)1.11.1石粉 stone power (%)0.90.9食鹽 salt (%)0.30.3氯化膽堿 chline chloride (%)0.10.1預混料 premix (%)11營養(yǎng)水平 nutrient level代謝能 me (mjkg-1)11.8011.92粗蛋白 cp (%)20.8219.25鈣 ca (%)0.860.77有效磷 available phos

16、phorus0.470.44蛋氨酸 methionine (%)0.470.39賴氨酸 lysine (%)1.131.01半胱氨酸 cysteine (%)0.340.32蘇氨酸 threonine (%)0.880.81注：1）、日糧營養(yǎng)成分：me為計算值，其他為測定值。2）、預混料為每kg飼料提供：錳70 mg，鋅50 mg，鐵90 mg，銅8 mg，碘0.45 mg，硒0.20 mg，維生素a14 000 iu，維生素d3 2800 iu，維生素e 23.80 iu，維生素k 1.96mg，維生素b1 2.24mg，維生素b2 8.40mg，維生素b6 4.75 mg，泛酸10.10m

17、g，煙酸1.12 mg，生物素0.046 mg，維生素b120.056 mg，膽堿1100 mg。notes: 1) diets nutrient composition: me value was calculated, the others values were measured. 2) premix contained the following per kg diets: manganese,70 mg; zinc, 50 mg; iron, 90 mg; copper, 8 mg; selenium, 0.20 mg; vitamin a, 14,000 iu; vitamin d

18、3, 2,800 iu; vitamin k, 1.96 mg; vitamin b1, 2.24 mg; vitamin b2, 8.40 mg; vitamin b6, 4.75 mg; vitamin b12, 0.056 mg; pantothenic acid, 10.10 mg; nicotinic acid, 1.12 mg; biotin, 0.046 mg; choline, 1,100 mg.1.2 試驗設計益生素：成分為枯草芽孢桿菌（活性4.0108cfu/g） ；益生元為低聚木糖和低聚甘露糖；合生素：主要成分為枯草芽孢桿菌（活性4.0108cfu/g）、低聚木糖和低聚甘

19、露糖。均為浙江省農科院微生物所提供。試驗設計方案見表2。表2試驗設計方案table2 design of experimental protocol處理treament試驗設計experimental design日糧組成diets composition對照組control基礎日糧basal diets抗生素組antibiotics基礎日糧+抗生素（黃霉素4mg/kg）basal diets+ antibiotics(xanthomycin 4mg/kg)益生素組probiotics基礎日糧+枯草芽孢桿菌0.1%basal diets+ bcillus subtilis 0.1%益生元組pr

20、ebiotics基礎日糧+低聚木糖0.015%+低聚甘露糖0.1%basal diets+ xylooligoscaharide0.015%+ mannanoligosccharide 0.1%合生素組synbiotics基礎日糧+枯草芽孢桿菌0.1%+低聚木糖0.015%+低聚甘露糖0.1%basal diets+ bcillus subtilis 0.1% basal diets+ xylooligoscaharide 0.015%+ mannanoligosccharide 0.1%1.3 測定指標及其方法1.3.1 生產性能指標記錄與測定 試期內每天以重復為單位記錄試雞采食量，計算平均

21、日增重、日采食量和飼料轉化率，記錄雞只死亡數(shù)并剖檢檢查； 分別在雞第21日齡、42日齡早空腹，以重復為單位進行稱重；1.3.2 腸道樣品的采集 分別在21、42日齡屠宰試雞，每重復隨機選取4只（公母各半），禁食12h后頸靜脈放血屠宰，無菌操作，分離盲腸，將盲腸內容物迅速放入無菌的離心管中，液氮速凍，-80冰箱保存，備用。1.3.3 腸道內容物總dna的提取 將同一處理組的12個樣品混合均勻，采用德國qiagen公司的qiaamp dna stool mini kit試劑盒提取腸道內容物總dna，操作步驟按照產品說明書進行。提取的dna通過微量核酸測定儀（nano drop 2000）測定dna

22、濃度，置-20保存?zhèn)溆谩?.3.4 pcr-dgge 將提取的腸道內容物總dna作為pcr反應模板，采用對大多數(shù)細菌16s rrna基因v3區(qū)具有特異性的引物（341-517）設計合成引物27：gc-341f（5- cgc ccg ccg cgc gcg gcg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gcc tac ggg agg cag cag-3）和517r（5-att acc gcg gct gct gg-3）。pcr反應程序：94預變性4 min；94變性1min，55退火45 s，72延伸45s，30個循環(huán)，最后72延伸10 min。pcr反應體系為50l，上下游引

23、物各1l，10x緩沖液5l，dntp混合物4l，taqdna聚合酶0.5l，加水至50l。pcr擴增產物采用bio-rad dcode進行dgge凝膠電泳，凝膠濃度為40-60%。電泳條件為：先在40v下電泳1h，然后80v電泳10-12小時。電泳結束后，從玻璃板上取下凝膠，在eb染液中染色25 min后用tanon2500凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。將dgge圖譜上的差異條帶和共性條帶分別割膠回收后浸泡在50lte buffer中4過夜。取5l為模板再次擴增16s rdna v3區(qū)，擴增產物做dgge確認回收條帶pcr產物的正確性。將正確的膠回收條帶進行純化后，將產物連接在promega t ea

24、sy vector載體上4下過夜，然后轉化，挑選陽性克隆進行測序。將測序結果登陸genbank運用blast進行分析。1.3.5 實時熒光定量pcr（fq-pcr）反應總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌的特異性引物分別參照denman18、walter19、satokari20、huijsdens21的方法，其上下游序列見表3，引物對由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。表3 總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌特異性引物table 3 the specific primer for total bacteria, lactobacillus, bifidbacterium and e.coi

25、l項目items引物primer引物序列(5-3)primer sequence(5-3)擴增長度（bp）amplicon size(bp)總菌 total bacteria1114-fcggcaacgacgcaaccc1471275-rccattgtagcacgtgtgtagcc乳酸桿菌lactobacilluslac1-fgcagcagtagggaatcttcca347lac2-rgcattycaccgctacacatg雙歧桿菌bifidobacteriumbif164fgggtggtaatgccggatg511bif662rccaccgttacaccgggaa大腸桿菌e.coile.co

26、il-fcatgccgcgtgtatgaagaa96e.coil-rcgggtaacgtcaatgagcaaa參照taverniers22,23的方法制備fq-pcr所檢測菌的標準模板，采用能作為特異性引物模板的dna序列與克隆載體相連，獲得重組質粒，以重組質粒模擬菌群基因組dna作為標準品。fq-pcr反應體系為20l：sybr green qpcr mix（toyobo）10l，上下游引物各0.4l，dna模板5l，加水至20l。所檢測菌fq-pcr反應條件如下：總菌反應條件：94預變性4 min；94變性30s，66退火30 s，72延伸1min，35個循環(huán)，最后72延伸5 min。乳酸

27、菌反應條件：94預變性4 min；94變性45s，64退火45 s，72延伸1min，35個循環(huán)，最后72延伸5 min。雙歧桿菌反應條件：94預變性4 min；94變性45s，62退火45 s，72延伸1min，35個循環(huán)，最后72延伸5min。大腸桿菌反應：94預變性4 min；94變性45s，59退火45 s，72延伸1min，35個循環(huán)，最后72延伸5 min。所有熒光定量pcr反應在abi 7500 real-time pcr system（abi）上進行。1.4 數(shù)據(jù)分析dgge圖譜用quantity one軟件進行分析，用dice法計算相似性指數(shù)cs，用mega 4.1軟件構建系

28、統(tǒng)發(fā)育樹，進行聚類分析fq-opcr檢測數(shù)據(jù)采用spss13.0中的單因素方差分析（one-way anvoa）進行統(tǒng)計分析，均值采用duncan法進行多重比較。2 結果2.1 日糧添加合生素對肉仔雞生長性能的影響表4日糧添加合生素對肉仔雞生產性能的影響table 4 effect of supplemental synbiotics in broiler diets on growth performance項目item對照組control抗生素組antibiotics益生素組probiotics益生元組prebiotics合生素組synbiotics121d日采食量(g/只.d)daily

29、 feed intake37.080.82 a40.780.32b40.370.19b40.210.93b41.700.57b日增重(g/只.d)daily weight gain20.651.73 a25.261.75b26.551.35 b26.221.05 b26.151.71b料肉比feed conversion ratio1.920.04 b1.610.02a1.520.04a1.530.06a1.590.02a2242d日采食量(g/只.d)daily feed intake149.592.65a 154.701.54 b151.151.15 ab152.701.46 ab156.

30、452.10 b日增重(g/只.d)daily weight gain73.481.09a 76.170.81 b75.350.98b75.921.25b84.331.39c料肉比feed conversion ratio2.040.02b 2.030.01b2.010.01b 2.000.01 b1.860.01a142d日采食量(g/只.d)daily feed intake93.341.03 a97.581.04b96.510.75b96.531.08b99.080.84b日增重(g/只.d)daily weight gain46.390.29 a50.720.52b50.950.35

31、b50.750.30 b55.240.57c料肉比feed conversion ratio2.010.02 c1.920.02 b1.890.01 b1.900.03b1.790.01a注：同行數(shù)據(jù)肩注字母不同者表示差異顯著（p0.05）。從表3可看出，日糧添加合生素后，肉仔雞分別在121d、2242d及142d與其他組相比，1）、平均日增重：與對照組和抗生素組比較均有顯著提高（p0.05）；與益生素組和益生元組相比，肉仔雞在2242d、142d時均有顯著提高（p0.05）；2）料重比：與對照組雞相比均顯著降低（p0.05）、8.37%和6.77%（p0.05）；與益生素和益生元組相比，肉仔

32、雞在 2242d，142d飼養(yǎng)期顯著降低（p0.05）。3）、合生素對肉仔雞生長性能的影響效應生長后期（22-42d）大于生長前期。2.2 日糧添加合生素對肉仔雞腸道微生物菌群多樣性的影響 con-21 ant-21 pro-21 pre-21 syn-21 con-42 ant-42 pro-42 pre-42 syn-42圖1 不同處理組肉仔雞21d、42d盲腸內容物dgge圖譜（注：圖譜中數(shù)字為切膠編號）fig.1 polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis profiles generated fr

33、om chicken cecal contents圖2 各個處理組肉仔雞盲腸內容物在不同時期pcr-dgge圖譜條帶數(shù)fig.2 number of polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis bands from cecal contents將pcr-dgge圖譜（圖1），使用quantity one軟件分析該圖譜的條帶數(shù)并繪制柱狀圖（圖2）分析表明：dgge譜圖（圖-1、圖-2）共回收了23個條帶，分析這些條帶中可以看出，在21d、42d，日糧中添加合生素后，與對照組、抗生素組、益生元組相比其條帶數(shù)較多

34、。合生素組在21d、42d的dgge圖譜上條帶分別為27和32條，均高于其他處理組。說明日糧添加合生素可以增加肉仔雞腸道微生物多樣性，且肉仔雞在42d的多樣性高于21d。分析表明：各個處理組間也存在一些共性條帶，如圖中條帶13、14、15、19，說明在21d、42d肉仔雞腸道中均存在這幾種條帶所代表的微生物類型；各個處理組肉仔雞在21d和42d的腸道微生物差異比較大，如21d的優(yōu)勢條帶3、18在42d幾乎消失或含量很低。肉仔雞飼喂合生素后，在21d的條帶3、17成為其盲腸內優(yōu)勢菌群，且含量高于其他試驗組，說明合生素通過調節(jié)肉仔雞腸道，使條帶3、17所代表的微生物成為其優(yōu)勢菌群。2.3 日糧添加

35、合生素對肉仔雞盲腸微生物種類的影響 條帶號band number序列長度（bp）size genbank數(shù)據(jù)庫中最相近的菌種名稱（登錄號）ncbi blast matches(accession number)相似性（%）similarity band1188uncultured prevotellaceae bacterium clone m4-7(eu530358.1)99band2168uncultured bacterium clone e416qyj01edvlx(hq313909.1)98band3168uncultured clostridiales bacterium clon

36、e abxd_s7(fj440076.1)100band4168uncultured bacterium clone 13ac_h02(hm575008.1)100band5194uncultured phascolarctobacterium sp. clone abxd_i1(fj440060.1)99band6188bacteroides plebeius strain: m12(ab200217.1)100band7171clostridiaceae bacterium sh021(ab298756.2)97band8188uncultured bacteroides sp. clon

37、e gull50-86 (fj220958.1)94band9171uncultured bacterium clone 9ab_a06(hm574859.1)100band10169uncultured firmicutes bacterium clone tcf2-145(gu959521.1)99band11168ruminococcus gauvreauii strain ccri-16110(ef529620.1)99band1216816s rdna sequence amplified from human fecal sample (fp077207.1)98band13171

38、uncultured bacterium clone e416qyj01exgsg(hq315332.1)97band14176uncultured bacteroidales bacterium clone ms194a1_f09（ef709128.1）93band15183uncultured bacterium clone 054c03.b（eu837961.1）96band16174uncultured clostridia bacterium clone abxd_ae2（fj440031.1）98band17188uncultured chicken cecal bacterium

39、 clone 2f4（ab075670.1）99band18168uncultured bacterium clone 13ac_h02（hm575008.1）100band19192megamonas hypermegale strain abxd_z48（fj489251.1）99band20194uncultured bacterium clone a4-146（gq898022.1）100band21168uncultured bacterium ckncm319-b7-19（af376223.1）99band22194enterococcus cecorum strain sp200

40、7-00740-01（gu585588.1）100band23188uncultured prevotellaceae bacterium clone m4-7（eu530358.1）100對dgge圖譜中的主要條帶進行切膠回收，共回收了23個條帶，將這些條帶進行克隆轉化、測序，由測序結果知，各個處理組肉仔雞在21d和42d共分離出23種不同的細菌，未測出乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌等優(yōu)勢菌，主要以不可培養(yǎng)的細菌為主，主要包括不可培養(yǎng)的普雷沃氏菌屬（uncultured prevotellaceae bacterium）、不可培養(yǎng)的梭菌目細菌（uncultured clostridiales

41、bacterium）、不可培養(yǎng)的考拉桿菌屬細菌（uncultured phascolarctobacterium sp.）、不可培養(yǎng)的硬壁門細菌（uncultured firmicutes bacterium）、不可培養(yǎng)的擬桿菌屬細菌（uncultured bacteroidales bacterium）、巨大單胞菌（megamonas hypermegale）、瘤胃球菌屬（enterococcus cecorum）等。2.4日糧添加合生素對肉仔雞盲腸微生物菌群相似性的影響圖3各個試驗組微生物的pcr-dgge指紋聚類分析圖fig.3 cluster analysis profile of p

42、cr-dgge of microorganisms from each treament用mega 4.1軟件構建肉仔雞盲腸微生物菌群系統(tǒng)發(fā)育樹并進行聚類分析。從圖3可看出， 肉仔雞21日齡時，合生素組與對照組、抗生素組、益生素組、益生元組的相似性系數(shù)均相對較低，分別為55.6%、70.5%、60.7%、73.8%；42日齡時，合生素組與對照組、抗生素組、益生素組、益生元組的相似性系數(shù)相對較低，分別為51.3%、54.6%、63.1%、61.4%。由此可見，無論肉仔雞在21、42日齡，合生素組與益生素、益生元組的相似性較高，而與對照組、抗生素組相似性較低，說明合生素、益生素、益生元對肉仔雞腸道

43、菌群結構調節(jié)有相似作用，但調節(jié)強度不同，其原因是，合生素是益生素和益生元的復合物，能發(fā)揮兩者的協(xié)同作用。2.5 日糧添加合生素對肉仔雞盲腸總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量的影響 表5 real time-pcr方法檢測肉仔雞盲腸總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌含量table 5 populations of total bacteria, lactobacillus, bifidbacterium, and e.coil in cecal contents of broiler by real time-pcr 項目items對照組control抗生素組antibiotic益生素組pr

44、obiotics益生元組prebiotics合生素組synbioticslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feces總菌total bacterium21d8.450.07a8.650.01 bc8.620.06 b8.710.02 c8.740.02 d42d8.800.06ab8.750.02a8.850.02 bc8.880.02 c8.910.04 c乳酸桿菌la

45、ctobacillus21d5.420.06 a5.560.02 b5.380.03 a5.570.02 b5.640.03 c42d5.490.02 a5.590.05 b5.650.03 c5.530.02 a5.660.03 c雙歧桿菌bifidobacterium21d4.150.04 a4.220.04 a4.250.09 a4.200.03 a4.780.07b42d4.920.02 b4.790.05 a5.170.06 c5.160.04c5.280.05d大腸桿菌e.coil21d5.740.05 a5.220.01 ab5.190.09 ab5.390.01 ab5.060

46、.10 b42d5.210.03 a5.170.05 ab5.180.11 a5.060.08 bc5.010.08c用fq-pcr方法檢測肉仔雞盲腸微生物菌群，結果顯示，肉仔雞在21d、42d時，日糧添加合生素與對照組、抗生素組相比，均顯著提高其盲腸總菌、乳酸菌、雙歧桿菌含量，降低了大腸桿菌含量（p0.05）。隨著試雞日齡的增大，其盲腸內總菌數(shù)量呈增加趨勢，且合生素組試雞乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量也隨著日齡的增加而增多。本試驗中雙歧桿菌數(shù)量均低于乳酸菌和大腸桿菌，且含量在4.154.28 log copies /g feces。3 討論3.1日糧添加合生素對肉仔雞盲腸微生物菌群結構影響及其與促生長

47、性能的關系 hume等24報道，用傳統(tǒng)菌種分離培養(yǎng)技術和分子生物學技術分析雞盲腸微生物區(qū)系變化表明：隨著雞的生長，盲腸微生物菌群由簡單變?yōu)閺碗s，本試驗用pcrdgge分析結果與其相同：肉仔雞在21d時，日糧添加由枯草芽孢桿菌和低聚木糖、低聚甘露糖組成的合生素組試雞盲腸dgge圖譜共檢測到27個條帶，42d時，則檢測到32個條帶，且條帶數(shù)均高于同期其它試驗組；肉仔雞盲腸微生物菌群相似性分析表明：合生素組與對照組、抗生素組、益生素（枯草芽孢桿菌）組、益生元（低聚木糖、低聚甘露糖）組相比，其不同日齡菌群的相似性系數(shù)也相對較低。21d和42d，合生素與對照組的相似性系數(shù)分別為55.6%、51.3%，均

48、低于其與其它試驗組的相似性指數(shù)。說明合生素具有豐富肉仔雞盲腸菌群種類的作用，且隨著雞齡的增加而作用強化。合生素這種豐富肉仔雞盲腸微生物菌群種類的效用可能是其綜合了益生素和益生元疊加效果。本試驗分析還表明，無論肉仔雞在21、42日齡，合生素組與益生素、益生元組的相似性較高，而與對照組、抗生素組相似性較低，說明合生素、益生素、益生元對肉仔雞腸道菌群結構調節(jié)有相似作用，但調節(jié)強度不同，其原因是，枯草芽孢桿菌作為益生菌的一種，能調節(jié)腸道黏膜細胞因子的產生數(shù)量，如刺激單核細胞產生抗炎癥細胞因子，產生抗菌物質等，并與腸道病原菌競爭定植位點，平衡腸道微生態(tài)區(qū)系25,26，低聚木糖和低聚甘露糖在動物腸道內能作

49、為益生菌的重要營養(yǎng)基質，促進有益菌的生長27，為動物機體提供了健康的腸道內環(huán)境，減少有害微生物對腸道的刺激作用，進而促進絨毛的生長和完整性。而由枯草芽孢桿菌和低聚木糖、低聚甘露糖組成的合生素能使兩者協(xié)同作用，其效果明顯優(yōu)于單一益生素或益生元。合生素強化肉仔雞腸道微生物菌群種類的效應與其對生長性能影響具有較強的關聯(lián)性。隨著雞齡的增加合生素的強化作用越大，而對肉仔雞日增重、飼料轉化效率等經(jīng)濟性狀指標影響的總體評價仍然是生長后期（22-42d）的效用大于生長前期（0-21d）。導致合生素這種取向一致效應的原因可能是：肉仔雞在生長前期，消化道發(fā)育及功能不完善，日糧添加適量的合生素僅能幫助其建立相對優(yōu)化

50、的腸道微生物環(huán)境，上調上皮細胞相關基因的表達，并使宿主對這種基因產生記憶，有利于有益微生物的后期定植28，但對于生長前期不完善的肉仔雞腸道功能而言，其用于助生長的效用可能并不十分顯著，合生素的優(yōu)勢未能完全表達；而在肉仔雞生長后期，其腸道黏膜已完全適應有益菌的定植，且又源源不斷地從飼糧中獲得定植源合生素芽孢桿菌和營養(yǎng)基質寡糖，兩者協(xié)調發(fā)揮良好的效能，營造健康的腸道微生態(tài)環(huán)境，進而體現(xiàn)出明顯的促進動物生長效用29,30。3.2日糧添加合生素對肉仔雞盲腸微生物菌群數(shù)量的影響本試驗用fq-pcr技術檢測肉仔雞盲腸微生物的總菌數(shù)、乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌數(shù)量，結果顯示，肉仔雞日糧添加合生素與其他組比

51、較，均能顯著提高其盲腸總菌、乳酸菌、雙歧桿菌含量，降低了大腸桿菌含量（p0.05）；隨著試雞日齡的增大，其盲腸內總菌數(shù)、乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量也隨之增多。合生素對肉仔雞腸道微生物菌群數(shù)量影響的這種作用亦與其促生長性能效用一致。益生素對宿主的有益作用主要體現(xiàn)在爭奪有害菌定植位點，分泌抗菌素，競爭排斥有害菌31,15。益生元可以選擇刺激有益菌（如雙歧桿菌和乳酸菌）、抑制有害菌增殖32，fritts等33指出，枯草芽孢桿菌c-3102能降低肉仔雞腸道病原菌如沙門氏菌和彎曲菌，teo和tan29,34報道，枯草芽孢桿菌pb6能增加腸道有益菌如乳酸菌的增殖，降低腸道產氣莢膜菌和大腸桿菌數(shù)量。但本試驗測定結

52、果表明，肉仔雞盲腸雙歧桿菌數(shù)量低于104cfu/g，乳酸菌數(shù)量低于106cfu/g，均少于108cfu/g，與dgge檢測結果相同。說明雖然合生素能促進盲腸乳酸菌和雙歧桿菌的增殖，抑制大腸桿菌數(shù)量，但有益菌雙歧桿菌和乳酸菌，并不是肉仔雞盲腸內的優(yōu)勢菌，至少不是在本試驗分析條件下的優(yōu)勢菌，故需對其優(yōu)勢菌尚需做進一步研究。4.結論肉仔雞日糧中添加由枯草芽孢桿菌和低聚木糖、低聚甘露糖組成的合生素，分析其盲腸微生物菌群的dgge圖譜，表明合生素具有豐富肉仔雞盲腸菌群種類的作用，且隨著雞齡的增加作用強化；合生素與益生素、益生元飼喂肉仔雞，其盲腸菌群的相似性較高，而與對照組、抗生素組的相似性較低；合生素能

53、促進雙歧桿菌和乳酸菌的增殖，抑制大腸桿菌數(shù)量；合生素對肉仔雞盲腸微生物菌群影響的作用與其對肉仔雞促生長的效用一致。references1 johansen c h, bjerrum l, finster k, pedersen k. effects of a campylobacter jejuni infection on development of the intestinal microflora of broiler chickens.poultry science, 2006, 85: 579-587.2 stuart e d, christopher s m. developme

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