細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇[稻谷書店]

1、背景知識：細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi)，而且細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜(DMSO)作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢

2、融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。細(xì)胞凍存操作步驟： 1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的凍存培養(yǎng)液，冰上預(yù)冷； 2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管； 3. 離心500rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，由慢至快，滴入配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕柔吹打使細(xì)胞均勻（在冰上進(jìn)行）；一般一個小方瓶凍一支或者一個10cm培養(yǎng)皿凍2支。 5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1ml（若凍存多于1支，則每支要均勻分裝）； 6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者； 7. 凍存：放入裝有異丙

3、醇的程序降溫盒中，-70冰箱中放3天左右，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。注意事項(xiàng)： 1從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液； 2將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷； 3凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟：1. 從液氮容器中取出凍存管，迅速浸入37溫水中，并不時(shí)搖動令其盡快融化； 2. 當(dāng)最后一小塊冰快融化時(shí)，將凍存管放在冰浴上。 3. 用吸管吸出細(xì)胞懸液，由慢至快滴入已經(jīng)加10倍以上凍存液的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻； 4. 第二天，換培養(yǎng)液或者3. 用吸管吸出細(xì)胞懸液，由慢至快滴入已經(jīng)加10

4、倍以上凍存液的離心管中，輕輕混勻；離心， 500rpm，5min； 4. 棄去上清液，加培養(yǎng)液吹勻，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿。注意事項(xiàng)：1. 取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細(xì)胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細(xì)胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少

5、對細(xì)胞的損傷。4. 離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無異常。5. 細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml15m培養(yǎng)液，而經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。6. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。7. 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細(xì)胞生長，從以前的資料來看，DM