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IP屬地：寧夏 上傳時間：2021-09-30 格式：DOC 頁數(shù)：5 大?。?0.50KB 積分：10.8 舉報 版權申訴

1、實驗步驟-參考205 covalent coupling-羧基修飾微球1、1ml微球（100mg/ml）在10ml激活緩沖液清洗2次。2、 第二次清洗后，微球重懸于10ml激活緩沖液，確保微球懸?。ㄝo助手段：渦流、聲波降解、滾動），此時微球懸液的濃度為10mg/ml。3、 混合時添加100mg wsc（添加wsc可能會引起凝結成塊，一般不大引起關注，應當通過孵化與生物分子解決）。4、 室溫（18-25）下連續(xù)攪拌15min。5、 耦合緩沖液洗2次，重懸于5ml耦合緩沖液，如第二步，盡可能確保顆粒懸浮。6、 在5ml耦合緩沖液溶解蛋白（1-10x過量單層），結合微球懸浮和蛋白解決方案。7、 室溫

2、下連續(xù)攪拌2-4h。8、 清洗 重懸于10ml淬滅溶液，輕輕混合30min，清洗，重懸于貯存緩沖液進行保存（理想的貯存濃度通常是10mg/ml）。9、 4保存。激活緩沖液-mes 或 diw -羧基乳膠微球ph?耦合緩沖液-mes/diw貯存緩沖液是什么？貯存緩沖液和清洗微球的緩沖液應保持一致。實驗方法：共價結合-生成nhs中間活化酯二步法water-soluble sulfo-n-hydroxysuccinimide can be added to increase coupling efficiency. the active ester intermediate formed by th

3、e n-hydroxy compound will replace the o-acylisourea intermediate formed by the wsc (unstable), is more stable to hydrolysis, and yet still highly reactive toward amines on the protein to be coupled. 此方法中，在edc存在下，nhs通過與微球上的羧基反應形成中間活化酯?；罨ケ萫dc更穩(wěn)定，不易水解。nhs / sulfo-nhs可提高偶聯(lián)效率。實驗步驟u bead activation1、 a方案

4、：每ml反應混合物加入下列各物：a 0.1ml 10x的activation buffer（10x的mes buffer通常用0.5m），其ph值為6.0-6.5；buffer的組成根據(jù)蛋白種類的不同而改變，常用buffer有醋酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、mes緩沖液。蛋白在等電點附近更易于吸附到微球上，因為在等電點附近，蛋白表面會有更多的疏水位點暴露出來。在這種情況下，抗體也更緊密，因此需要更多的抗體用于標記到微球上。然而，最終buffer的選擇，需要考慮最終抗體微球復合物的生物活性，因此，幾個不同濃度的抗體和不同ph的反應buffer應該進行優(yōu)化選擇。起始實驗，反應buffer的

5、離子強度應該在2550mm。b 0.1ml 10%的微球（100mg/ml），膠乳微球最終濃度為1%（w/v,10mg/ml）；c 0.23ml的50mg/ml的nhs的去離子水溶液；11.5mgd 一定體積 19.2mg/ml（100mm）的edc的去離子水溶液。 edc的用量，根據(jù)微球表面羧基濃度來計算。根據(jù)計算所需量，每mol的羧基應該再多加23mol的edc。但是，根據(jù)功能性檢測結果，還需要進一步的優(yōu)化。e 用去離子水（diw）最后定容為1.0ml；1、 b方案：每ml反應混合物加入下列各物：a、0.1ml 10%的微球（100mg/ml），膠乳微球最終濃度為1%（w/v,10mg/m

6、l）； 在1ml activation buffer（一般可用0.5m mes緩沖溶液）清洗2次。 微球置于干凈的離心管（離心10000rpm5min）tip頭小心棄上清 第二次清洗后，微球重懸于一定體積 activation buffer，確保微球懸浮。 重懸輔助手段：渦流、聲波降解、滾動等，此處將離心管在超聲波下聲浴60s。b、0.23ml的50mg/ml的nhs的去離子水溶液；11.5mgc、一定體積 19.2mg/ml（100mm）的edc的去離子水溶液；d、activation buffe最后定容為1.0ml。2、 在室溫（18-25）攪拌反應15-30分鐘 or 漩渦混勻，室溫下，

7、在旋轉(zhuǎn)混合器或輕微渦流或振蕩器上放置2小時。此步驟，微球的凝集經(jīng)常能觀察到！因為接下來的步驟中，edc會將相鄰兩個微球上的抗體連接起來，從而引起微球凝集或者中和微球表面的羧基或者兩者情況都發(fā)生。調(diào)節(jié)ph到6.5或超過6.5，優(yōu)化共價反應，對微球的分散有幫助。如果反應結束后微球凝集現(xiàn)象仍然發(fā)生，用新鮮的buffer清洗除去多余的edc和游離的蛋白，一般會使得凝集顆粒再分散。如果在最終的產(chǎn)品中凝集依然發(fā)生，嘗試稀釋微球，一開始可以稀釋到原來的50%濃度。如果稀釋后凝集依然發(fā)生，可以嘗試在所有buffer中加入tween20或tergitol np9等非離子型表面活性劑。這些表面活性劑不會干擾顆粒的

8、活性或共價結合，但是需要注意的是，要確保在這種表面活性劑存在下微球共價結合的抗體的穩(wěn)定。3、 離心 10000 rpm5min，小心棄去上清。u coupling the capture molecule to the activated beads4、 coupling buffer清洗 用mes緩沖液或diw洗滌膠乳微球懸浮物兩次；目的：除去未反應的nhs和edac移除未結合的化合物或蛋白，如果顆粒直徑大于0.2um，可以通過離心的方法，微球可以重新懸浮，然后攪拌，接著溫和的超聲分散。離心力不宜過大，這樣會導致微球不易分散。也可以用超濾或透析來純化。當用超濾時，濾膜孔徑應該足夠大，使得游離

9、的蛋白能自由的通過濾膜。用于清洗微球的buffer應該和storage buffer一樣。用于清洗的buffer的任何緩沖液成分及ph的改變，都會引起蛋白的脫落。5、 重新將膠乳微球在coupling buffer中懸浮，使其濃度為1%（w/v）；6、 同時，用coupling buffer稀釋結合蛋白（1-10x過量單層）。buffer一般為ph79，50-100mm，最終的濃度為1mg/ml；7、 稀釋完微球后，立即加入1ml的蛋白溶液（膠乳微球、蛋白質(zhì)和緩沖溶液的濃度分別為0.5%（w/v）、0.5mg/ml、25-50mm）；蛋白溶液應該在快速的攪拌下，快速加入到微球懸液中。小體積的話

10、，可以進行渦旋混合。當大體積時，應該在燒瓶或燒杯里攪拌劇烈些，蛋白溶液快速加入到漩渦中間。8、 將混合物置于水平振蕩器，室溫輕震2小時；9、 按1ml反應混合液加入2.5l/1l乙醇胺混合，攪拌反應10-30分鐘； quenching solution-乙醇胺，可以和加入蛋白反應后多余的羧基位基團反應。10、清洗 ，storage buffer清洗兩次。（note 3/4）除去未結合的蛋白質(zhì)和乙醇胺。11、重懸于適宜濃度的storage buffer（通常是10mg/ml）。12、4保存。緩沖液 activation buffer: mes coupling buffer:mes or diw

11、 storage buffer:diw or pbs？the buffer should not contain certain compounds that will interfere or compete with the reaction or ligand. for example, phosphate and acetate buffers can reduce the reactivity of carbodiimides, and are thus not recommended for use as activation buffers when coupling to co

12、oh-modified microspheres. a popular alternative in this instance is mes. also, buffers containing free amines, such as tris or glycine, should be avoided when working with amine reactive chemistries.blockers blocking agents are often coated on beads (via adsorption) following the coupling reaction.

13、these compounds are used to minimize nonspecific interactions between the coated bead and non-target molecules in the sample.blockers are often added to the storage buffer in varying amounts, standard concentrations being anywhere from 0.05% to 0.1% (w/v).技術說明1微球總表面積與其粒徑成反比，抗體的具體用量需要根據(jù)使用微球的大小做相應改變； 單位質(zhì)量的微球表面積（m2/g） ： a/m = 6/pd 其中 d= 微球粒徑（m） p = 微球密度 (聚苯乙烯 1.05g/ml) 例如：0.8m的聚苯乙烯微球，a/m = 6/1.050.8 = 7.14 m2/g 1.6m 的聚苯乙烯微球，a/m = 6/1.051.6 = 3.57 m2/g 2雖然疏水性吸附與緩沖液