反義c-myc寡核苷酸對(duì)大鼠自體移植靜脈內(nèi)膜增生的影響

1、反義c-myc寡核苷酸對(duì)大鼠自體移植靜脈內(nèi)膜增生的影響【摘要】目的研究反義c-myc寡聚脫氧核苷酸(ODN)對(duì)大鼠自體移植靜脈內(nèi)膜增生的影響。方法移植靜脈外周涂以加有反義c-myc寡聚脫氧核苷酸的F127凝膠，于術(shù)后1、2周測量靜脈內(nèi)膜平均厚度及觀察血管內(nèi)膜內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)情況。結(jié)果手術(shù)后1、2周，移植靜脈內(nèi)膜的平均厚度、內(nèi)膜中c-myc蛋白表達(dá)在反義c-myc寡聚脫氧核苷酸組均減少，并存在量效關(guān)系(P0.01)。而只用F127膠組及正義寡聚脫氧核苷酸組均無抑制作用。結(jié)論反義c-myc寡聚脫氧核苷酸對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生有抑制作用，并存在量效關(guān)系。此作用可能是通過抑制血管內(nèi)膜內(nèi)細(xì)胞c-myc蛋

2、白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的?！娟P(guān)鍵詞】反義c-myc寡聚脫氧核苷酸；靜脈移植；內(nèi)膜增生 Effect of antisense c-myc oligodeoxynucleotides on intimal hyperplasia of vein autografts of ratsWANG Chun, MA Wenfeng, WANG Xinwen, et al. The No.3 Department of General Surgery, First Clinical Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China【Abstrac

3、t】 Objective To study the inhibitory effect of antisense c-myc oligodeoxynucleotides on intimal hyperplasia of vein autografts. Methods Antisense c-myc oligodeoxynucleotides of different concentrations, which was dissolved in 30 % pluronic F127 gel solution, was applied around the transplanted vein

4、adventitia. The samples were got 1 and 2 weeks after operation to measure the thickness and observe the expression of c-myc protein in intima. Results At the first week and second week postoperatively, the thickness of vein intima and the c-myc protein expression index were obviously inhibited in a

5、dose-dependent manner in the antisense group as compared with that in the control groups (P 0.01). But in the groups of F127 or sense oligodeoxynucleotides only no inhibitory effects were found. Conclusions Antisense c-myc oligodeoxynucleotides can inhibit intimal hyperplasia of rat vein autografts

6、in a dose-dependent manner, which was contributed to the decrease of the expression of c-myc protein in intima.【Key words】 Antisense c-myc oligodeoxynucleotides; Vein grafting; Intimal hyperplasia 本研究旨在探討反義c-myc寡聚脫氧核苷酸(ODN)對(duì)移植靜脈的內(nèi)膜增生的抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。 材料和方法1.材料：(1)F127多聚凝膠，購自Sigma公司；溶于生理鹽水中制成30%的溶液，4保存

7、。(2)18mer正反義c-myc ODN，購自北京醫(yī)科大學(xué)分子病理實(shí)驗(yàn)室；溶于30% F127凝膠溶液，濃度分別為1、3g/L，4保存(序列：正義5-ATGCCCCT-CAACGTGAGC-3；反義5-GCTCACGTTGAGGGG-CAT-3)。(3)c-myc蛋白抗體，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。(4)即用型SABC產(chǎn)品：購自武漢博士德生物工程有限公司。2.實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組：Wistar大鼠50只，雌雄不拘，體重300g左右，隨機(jī)分成10組，每組5只。分組情況如下：(1)空白對(duì)照1周；(2)空白對(duì)照2周；(3)F127凝膠1周；(4)F127凝膠2周；(5)正義c-myc ODN 300

8、g 1周；(6)正義c-myc ODN 300g 2周；(7)反義c-myc ODN 100g 1周；(8)反義c-myc ODN 100g 2周；(9)反義c-myc ODN 300g 1周；(10)反義c-myc ODN 300g 2周。3.動(dòng)物模型的建立：大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%戊巴比妥鈉(40mg/kg體重)經(jīng)腹腔麻醉。切取頸靜脈的分支頭靜脈長約4mm，肝素鹽水沖洗備用，頸總動(dòng)脈兩端上血管夾，切斷后將頭靜脈間置移植于頸總動(dòng)脈，用11-0無損傷縫線作端端吻合，過血實(shí)驗(yàn)判定移植血管通暢后，靜脈外周涂以加有濃度分別為1、3g/L的反義c-myc ODN的F127凝膠100l(即100g或300g

9、)，對(duì)照組用正義c-myc ODN(3g/L)或只應(yīng)用F127凝膠100l。4.標(biāo)本制作：標(biāo)本用福馬林漂洗固定12h后石蠟包埋，作光鏡切片。5.觀測指標(biāo)：(1)組織學(xué)觀察：切片用蘇木素-伊紅(HE)染色和彈力纖維(V-G)染色，用計(jì)算機(jī)像分析儀觀察血管中段橫截面內(nèi)膜，每60度測量1次該處內(nèi)膜厚度，共6處，計(jì)算平均厚度。(2)免疫組織化學(xué)觀察：標(biāo)本先給予微波抗原修復(fù)，然后鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC法)c-myc蛋白免疫組織化學(xué)染色。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。細(xì)胞核染成棕黃色為陽性。400倍光鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)中的染色陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞為分子計(jì)算c

10、-myc蛋白表達(dá)指數(shù)，并用百分比表示，觀察血管內(nèi)膜內(nèi)細(xì)胞c-myc蛋白表達(dá)情況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行分析處理，t檢驗(yàn)及2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果1.肉眼和光鏡觀察：靜脈移植術(shù)后1、2周，肉眼觀察見空白對(duì)照組靜脈增粗，管壁變厚、混濁。顯微鏡下觀察，HE染色及V-G染色可見靜脈內(nèi)膜、中膜均增厚。術(shù)后2周移植靜脈內(nèi)膜增生比術(shù)后1周時(shí)更為明顯。F127組、正義ODN組的表現(xiàn)與空白對(duì)照組相似。在反義c-myc ODN組，肉眼觀察下靜脈管壁較薄、透明。顯微鏡下觀察，移植靜脈內(nèi)膜比正常非移植靜脈有所增生，但與對(duì)照組相比，內(nèi)膜增生受到明顯抑制(P0.01)，300g組受抑制更為明顯(P0.

11、01)。2.免疫組織化學(xué)方法觀察：正常靜脈壁內(nèi)細(xì)胞極少為c-myc蛋白染色陽性，表明細(xì)胞處于增殖靜止期。在空白對(duì)照組，靜脈移植術(shù)后1周，內(nèi)膜中c-myc蛋白陽性細(xì)胞明顯增多。術(shù)后2周，內(nèi)膜中c-myc蛋白陽性細(xì)胞依然較多，但比1周時(shí)有所減少，兩者差異有顯著性(P0.01)。而在反義c-myc ODN組，靜脈移植術(shù)后1周及2周，c-myc蛋白表達(dá)指數(shù)顯著低于各對(duì)照組(P0.01)。300g組受抑制更加明顯(P0.01)。在F127組、正義ODN組，靜脈內(nèi)膜中細(xì)胞c-myc蛋白表達(dá)未受抑制。各組的PBS對(duì)照均無陽性染色。討論c-myc基因是細(xì)胞增殖的早期應(yīng)答基因，c-myc蛋白是細(xì)胞從G0/G1期

12、進(jìn)入S期的驅(qū)動(dòng)因子。移植靜脈壁內(nèi)c-myc mRNA表達(dá)高峰在術(shù)后26h，c-myc蛋白表達(dá)高峰為術(shù)后1周1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靜脈移植術(shù)后1周及2周，靜脈內(nèi)膜的平均厚度、c-myc蛋白表達(dá)在反義c-myc ODN組均減少，并存在量效關(guān)系，提示反義c-myc ODN對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生有抑制作用。100g組抑制30%，300g組抑制50%。這種抑制作用可能是通過抑制靜脈內(nèi)膜內(nèi)細(xì)胞c-myc蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。反義c-myc ODN抑制細(xì)胞增殖的機(jī)理可能有：(1)干擾mRNA的翻譯；(2)與mRNA結(jié)合促進(jìn)RNAase H對(duì)其降解；(3)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)干擾DNA轉(zhuǎn)錄及mRNA的剪切、修飾及運(yùn)輸。反義c

13、-myc ODN還可能非特異地與其他mRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合而起作用。反義c-myc ODN還可能干預(yù)細(xì)胞的遷移、凋亡及合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)而起作用2。細(xì)胞內(nèi)DNA/RNA雜交可能會(huì)誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，還能激活一些蛋白，如25AS，腺苷酸環(huán)化酶，以上3種途徑均能抑制增殖3。只用F127凝膠組及正義ODN組均無抑制移植靜脈內(nèi)膜增生的作用，所以反義ODN的作用是序列特異性的。基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(972278)作者單位：王淳（110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院普外三科）馬文鋒（110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院普外三科）王新文（110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院普外三科）孫成林（110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院普外三科）段志泉（110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院普外三科）參考文獻(xiàn)1，王新文，張強(qiáng)，王斌，等.c-myc基因表達(dá)對(duì)移植血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.中華醫(yī)學(xué)雜志，1999，79：381-383.2，Shi AF, Ali F, Anthony G, et al. Transcatheter delivery of c-myc antisense oligomers reduces neointimal formati