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1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 、培養(yǎng)基及胰酶的配制、培養(yǎng)基及胰酶的配制一、實(shí)驗(yàn)原理:一、實(shí)驗(yàn)原理:(一)細(xì)胞培養(yǎng)的氣體環(huán)境與(一)細(xì)胞培養(yǎng)的氣體環(huán)境與phph環(huán)境環(huán)境 ( ( 二)細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件二)細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件 1. 1. 培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液 培養(yǎng)液(基)、緩沖液、平衡鹽溶液、血清及消培養(yǎng)液(基)、緩沖液、平衡鹽溶液、血清及消化液、化液、phph調(diào)節(jié)液和抗生素等。調(diào)節(jié)液和抗生素等。 血清的主要成分及含量血清的主要成分及含量 培養(yǎng)基的主要種類(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的主要種類(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)(1) mem (1) mem (低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基,低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基,minimum eessentialminimum

2、 eessential media): media): (2) dmem(dulbeccos(2) dmem(dulbeccos modified eagle modified eagle medium)medium)(3) imdm(iscoves modified dulbeccos(3) imdm(iscoves modified dulbeccos medium) medium)(4) rpmi1640(4) rpmi1640(5) hamf10(5) hamf10、 hamf12hamf12(6) mccoys 5a(6) mccoys 5a 消消 化化 液液 0.1-0.25% 0

3、.1-0.25% 胰酶胰酶 0.02% 0.02% edtaedta ph=8.0 ph=8.0 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?. 1. 掌握掌握dmemdmem培養(yǎng)基、胰酶的配制培養(yǎng)基、胰酶的配制2. 2. 學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)針頭濾器的使用方法針頭濾器的使用方法三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟 ( (一)一) dmemdmem培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制1. 1. 三袋三袋dmemdmem粉末用雙蒸水溶解(先加入粉末用雙蒸水溶解(先加入2/3ddw2/3ddw,再用,再用ddwddw沖洗袋子)、磁力攪拌器攪拌半小時(shí)以上。沖洗袋子)、磁力攪拌器攪拌半小時(shí)以上。2. 2. 加入加入1.2g/1.2g/袋袋 nahco3n

4、ahco3定容定容3000 ml3000 ml、攪拌、攪拌3030分鐘。分鐘。每人在超凈臺(tái)內(nèi)用大濾器過濾、分裝、寫好種類、名字。(留每人在超凈臺(tái)內(nèi)用大濾器過濾、分裝、寫好種類、名字。(留取少許做污染測試放取少許做污染測試放co2co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱7272小時(shí))小時(shí))3. 3. 每每8 8個(gè)人為一組,每人過濾個(gè)人為一組,每人過濾90 ml90 ml,其余的過濾到,其余的過濾到100 ml100 ml試劑試劑瓶中,每瓶瓶中,每瓶90ml90ml培養(yǎng)基備用。培養(yǎng)基備用。 使用前在超凈臺(tái)內(nèi)加入使用前在超凈臺(tái)內(nèi)加入5656滅活好的滅活好的fcs 10 mlfcs 10 ml,使血清,使血清的終濃度為的終

5、濃度為10%10%,44保存待用。保存待用。(二)胰酶的配制(二)胰酶的配制1. 取實(shí)驗(yàn)一中準(zhǔn)備好的取實(shí)驗(yàn)一中準(zhǔn)備好的d dhanks hanks 液液 200 ml200 ml (8 8人一組)人一組)2. 2. 稱取稱取0. 5g0. 5g胰酶(胰酶(0.25%0.25%)放入研磨器中并加入少量)放入研磨器中并加入少量d d hankshanks液成為糊狀,研磨液成為糊狀,研磨200200次,再加入次,再加入d d hankshanks液終體積液終體積為為200ml200ml,合并胰酶,加,合并胰酶,加0.02%edta0.02%edta助消化,磁力攪拌使之助消化,磁力攪拌使之完全溶解。(

6、完全溶解。(8 8人一組,分別研磨,再合并)人一組,分別研磨,再合并)3. 3. 用用nahco3 nahco3 調(diào)調(diào)phph至至8.08.0。4. 4. 小濾器(實(shí)驗(yàn)一中已濕熱滅菌過的)過濾除菌至小瓶內(nèi)小濾器(實(shí)驗(yàn)一中已濕熱滅菌過的)過濾除菌至小瓶內(nèi),( ,(不不能裝的過滿能裝的過滿, ,防止冷凍后瓶爆裂防止冷凍后瓶爆裂) )、檢查濾器、貼好標(biāo)簽、檢查濾器、貼好標(biāo)簽、-20-20保存。每人過濾保存。每人過濾20 ml20 ml 。(注意:(注意:1. 1.擰緊濾器擰緊濾器2.2.注射器吸液體注射器吸液體3.3.注射器插好濾器注射器插好濾器4.4.對著對著燒杯慢推壓針芯看是否漏燒杯慢推壓針芯看是否漏5.5.如不漏對小瓶過濾。如不漏對小瓶過濾。6.6.濾器放在小濾器放在小瓶瓶口上,取下針頭再吸液體,反復(fù)多次,濾完。瓶瓶口上,取下針頭再吸液體,反復(fù)多次,濾完。7.7.檢查濾器檢查濾器濾膜是否完好。)濾膜是否完好。)四、思考題四、思考題1. 1.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血

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