實(shí)驗(yàn)二 、培養(yǎng)基及胰酶的配制

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 、培養(yǎng)基及胰酶的配制、培養(yǎng)基及胰酶的配制一、實(shí)驗(yàn)原理：一、實(shí)驗(yàn)原理：（一）細(xì)胞培養(yǎng)的氣體環(huán)境與（一）細(xì)胞培養(yǎng)的氣體環(huán)境與phph環(huán)境環(huán)境 ( ( 二）細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件二）細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件 1. 1. 培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液 培養(yǎng)液（基）、緩沖液、平衡鹽溶液、血清及消培養(yǎng)液（基）、緩沖液、平衡鹽溶液、血清及消化液、化液、phph調(diào)節(jié)液和抗生素等。調(diào)節(jié)液和抗生素等。 血清的主要成分及含量血清的主要成分及含量 培養(yǎng)基的主要種類（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）培養(yǎng)基的主要種類（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）(1) mem (1) mem (低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，minimum eessentialminimum

2、 eessential media): media): (2) dmem(dulbeccos(2) dmem(dulbeccos modified eagle modified eagle medium)medium)(3) imdm(iscoves modified dulbeccos(3) imdm(iscoves modified dulbeccos medium) medium)(4) rpmi1640(4) rpmi1640(5) hamf10(5) hamf10、 hamf12hamf12(6) mccoys 5a(6) mccoys 5a 消消 化化 液液 0.1-0.25% 0

3、.1-0.25% 胰酶胰酶 0.02% 0.02% edtaedta ph=8.0 ph=8.0 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?. 1. 掌握掌握dmemdmem培養(yǎng)基、胰酶的配制培養(yǎng)基、胰酶的配制2. 2. 學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)針頭濾器的使用方法針頭濾器的使用方法三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟 ( (一）一） dmemdmem培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制1. 1. 三袋三袋dmemdmem粉末用雙蒸水溶解（先加入粉末用雙蒸水溶解（先加入2/3ddw2/3ddw，再用，再用ddwddw沖洗袋子）、磁力攪拌器攪拌半小時(shí)以上。沖洗袋子）、磁力攪拌器攪拌半小時(shí)以上。2. 2. 加入加入1.2g/1.2g/袋袋 nahco3n

4、ahco3定容定容3000 ml3000 ml、攪拌、攪拌3030分鐘。分鐘。每人在超凈臺(tái)內(nèi)用大濾器過濾、分裝、寫好種類、名字。（留每人在超凈臺(tái)內(nèi)用大濾器過濾、分裝、寫好種類、名字。（留取少許做污染測試放取少許做污染測試放co2co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱7272小時(shí)）小時(shí)）3. 3. 每每8 8個(gè)人為一組，每人過濾個(gè)人為一組，每人過濾90 ml90 ml，其余的過濾到，其余的過濾到100 ml100 ml試劑試劑瓶中，每瓶瓶中，每瓶90ml90ml培養(yǎng)基備用。培養(yǎng)基備用。 使用前在超凈臺(tái)內(nèi)加入使用前在超凈臺(tái)內(nèi)加入5656滅活好的滅活好的fcs 10 mlfcs 10 ml，使血清，使血清的終濃度為的終

5、濃度為10%10%，44保存待用。保存待用。（二）胰酶的配制（二）胰酶的配制1. 取實(shí)驗(yàn)一中準(zhǔn)備好的取實(shí)驗(yàn)一中準(zhǔn)備好的d dhanks hanks 液液 200 ml200 ml （8 8人一組）人一組）2. 2. 稱取稱取0. 5g0. 5g胰酶（胰酶（0.25%0.25%）放入研磨器中并加入少量）放入研磨器中并加入少量d d hankshanks液成為糊狀，研磨液成為糊狀，研磨200200次，再加入次，再加入d d hankshanks液終體積液終體積為為200ml200ml，合并胰酶，加，合并胰酶，加0.02%edta0.02%edta助消化，磁力攪拌使之助消化，磁力攪拌使之完全溶解。（

6、完全溶解。（8 8人一組，分別研磨，再合并）人一組，分別研磨，再合并）3. 3. 用用nahco3 nahco3 調(diào)調(diào)phph至至8.08.0。4. 4. 小濾器（實(shí)驗(yàn)一中已濕熱滅菌過的）過濾除菌至小瓶內(nèi)小濾器（實(shí)驗(yàn)一中已濕熱滅菌過的）過濾除菌至小瓶內(nèi),( ,(不不能裝的過滿能裝的過滿, ,防止冷凍后瓶爆裂防止冷凍后瓶爆裂) )、檢查濾器、貼好標(biāo)簽、檢查濾器、貼好標(biāo)簽、-20-20保存。每人過濾保存。每人過濾20 ml20 ml 。（注意：（注意：1. 1.擰緊濾器擰緊濾器2.2.注射器吸液體注射器吸液體3.3.注射器插好濾器注射器插好濾器4.4.對著對著燒杯慢推壓針芯看是否漏燒杯慢推壓針芯看是否漏5.5.如不漏對小瓶過濾。如不漏對小瓶過濾。6.6.濾器放在小濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復(fù)多次，濾完。瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復(fù)多次，濾完。7.7.檢查濾器檢查濾器濾膜是否完好。）濾膜是否完好。）四、思考題四、思考題1. 1.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血