細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)

1、器械的清洗器械的清洗2011.10.112011.10.11為何要進(jìn)行清洗？為何要進(jìn)行清洗？ 離體培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都十分敏感，這離體培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都十分敏感，這些物質(zhì)包括微生物、細(xì)胞殘余物以及非營養(yǎng)成分些物質(zhì)包括微生物、細(xì)胞殘余物以及非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)。的化學(xué)物質(zhì)。 除一次性用品外，玻璃、塑料、橡膠和金屬質(zhì)地除一次性用品外，玻璃、塑料、橡膠和金屬質(zhì)地等其他培養(yǎng)用品，無論新舊，使用前均需徹底清等其他培養(yǎng)用品，無論新舊，使用前均需徹底清洗。洗。experiment of cell engineeringexperiment of cell engineering玻璃器皿的清洗玻

2、璃器皿的清洗刷洗浸泡浸酸沖洗 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 1 主要包含有： 培養(yǎng)瓶，血清瓶培養(yǎng)瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，離心移液管，離心管，試管管，試管，培養(yǎng)皿等。 2 清洗步驟：清洗步驟： 泡在含有洗潔凈的自來水中撈出來用毛刷將實(shí)驗(yàn)器具各個(gè)面刷洗至少25遍自來水沖洗25遍過一遍一蒸水烘干泡入鉻酸過夜 從鉻酸中撈出器具，自來水沖洗25遍過三遍一蒸水，三遍三蒸水烘箱內(nèi)烘干收入柜子備用用前高溫滅菌（121，25min） 烘干使用 注意：1、新的玻璃器具先要泡過夜，然后清洗步驟與上面相同。2、移液管用含洗潔精的自來水超聲3次，每次半小時(shí)。清洗標(biāo)準(zhǔn)： 玻璃透亮，內(nèi)外壁水膜均勻、無油跡，無任何殘留物

3、質(zhì)。 塑料、橡膠類器皿的清洗塑料、橡膠類器皿的清洗 1 塑料類器皿主要包括： 孔板、大槍頭、瓶蓋、濾器瓶蓋、濾器、超聲管、注射器等。 2 橡膠類器皿主要包括： 乳膠頭、橡膠頭、膠塞、膠墊等。 2 清洗步驟：清洗步驟： 泡在有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個(gè)面刷洗至少25遍自來水沖洗25次以上過一遍一蒸水泡入鹽酸過夜從酸中撈出后自來水沖洗25遍過三遍一蒸水，三遍三蒸水烘箱內(nèi)烘干收入柜子用前高溫滅菌（121， 20min） 烘干使用 注意: 乳膠類器材由于常有滑石粉類成分，故應(yīng)先用流水充分清洗。 細(xì)胞培養(yǎng)定義細(xì)胞培養(yǎng)定義u定義：定義： 模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生

4、存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。u優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1活細(xì)胞：同時(shí)、大量、均一性、重復(fù)性；2可控制： 各種物理、化學(xué)、生物等因素可調(diào)控；3研究方法多樣：倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記；4應(yīng)用廣： 不同物種、不同年齡、不同組織、正?；虍惓＃[瘤）；u缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同； 當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，時(shí)間久了，必然發(fā)生變化。 細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 傳代：傳代： 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織

5、并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 接觸抑制接觸抑制（contact inhibition） 細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停止增長； 細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的g0期； 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長。 體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“ hayflick極限”。 傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。 傳代次數(shù)與個(gè)體年齡成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。 細(xì)胞傳代次數(shù)細(xì)胞傳代次數(shù)（passage number） 原代培養(yǎng) （primary cult

6、ure）從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長。 克?。╟lone）亦稱無性繁殖系或無性系。對(duì)細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。 細(xì)胞系（cell line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖 細(xì)胞株（cell strain）從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。 原代培養(yǎng)與細(xì)胞系原代培養(yǎng)與細(xì)胞系原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿 原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期 the american type culture

7、 collection (atcc) the european collection of animal cell culture (ecacc) national institute of health (nih), usa national cancer institute (nci), usa細(xì)胞系資源細(xì)胞系資源 有限細(xì)胞系，無限細(xì)胞系 細(xì)胞系 cell line 細(xì)胞株 cell strain 培養(yǎng)細(xì)胞的特性 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式 貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞 懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞 每代貼附生長

8、細(xì)胞的生長過程 游離期 貼壁期 潛伏期 對(duì)數(shù)生長期 停止期（平臺(tái)期） 游離期： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí) 貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)） 潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長話動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期 一般為624小時(shí)。 對(duì)數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最

9、佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性二、細(xì)胞培養(yǎng)基本要二、細(xì)胞培養(yǎng)基本要求求 常用儀器設(shè)備常用儀器設(shè)備 培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 血清血清 其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 o2 co2: 5% co2 +h2o h2co3 h+ + hco3- ph: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒常用儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸 co2培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器 液氮罐 自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀 耗材

10、：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管 壓力蒸汽消毒器：壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣 電熱干燥箱：電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒 濾器：濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺(tái)：超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境 紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 超凈臺(tái) n超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 濾 器 co2培養(yǎng)箱nco2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37

11、，5co2 。n使用co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：n 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。n 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器培養(yǎng)器皿 浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小小時(shí)）、時(shí)）、 流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干烘干n常用玻璃器皿清洗 清潔液的配制培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的選擇沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： 1.建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞

12、首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。 2.其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。 3.用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。 血清使用注意事項(xiàng)血清使用注意事項(xiàng)1.血清必須貯存于20 -70，若存放于4，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。如果一次無法用完一瓶，可將4045 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 2.血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫

13、下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。3.熱滅活（heat-inactivation）是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。4.勿將血清置于37太久，若在37放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)凝絮物：凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白發(fā)生

14、之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，造成，這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因?yàn)闀?huì)養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過濾膜。阻塞過濾膜。 顯微鏡下觀察之顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過熱

15、處理之血清，沉淀物的形通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”，常，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此中欲培養(yǎng)此“微生物微生物“，但在但在37環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換不會(huì)影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清

16、之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。另一批號(hào)的血清。 血清沉淀物血清沉淀物 如何避免沉淀物的產(chǎn)生如何避免沉淀物的產(chǎn)生?解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20至至4至室溫至室溫)，若血，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大清解凍時(shí)改變的溫度太大(如如-20至至37)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。淀物。 解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。的發(fā)生。 請(qǐng)勿將血清置于請(qǐng)勿將血清置于37太久。若在太久。若在37放置太久，血清會(huì)變得混濁，放置太久，血清會(huì)變得混

17、濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。量。 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多?；尉鶆?。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重

18、要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，44下放置下放置7 7天天即可分解約即可分解約50%50%，所以都是在使用前添加，所以都是在使用前添加配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上時(shí)，要重新周以上時(shí)，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)入培養(yǎng)液內(nèi)使用終濃度為使用終濃度為1-4mm1-4mm一般配制為一般配制為100100倍濃縮液，即濃度為倍濃縮液，即濃度為200mm200mm（29.22g/l

19、29.22g/l）配制方法為配制方法為 ：谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mm200mm的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫3030），過濾除菌，分），過濾除菌，分裝小瓶，裝小瓶，-20-20保存，使用時(shí)可向保存，使用時(shí)可向100ml100ml培養(yǎng)液中加入培養(yǎng)液中加入0.5-2ml0.5-2ml谷谷氨酰胺濃縮液，終濃度為氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mm 1-4mm 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無ca2+、mg2+的緩沖液 pbs：nacl 8.0 g kcl 0.2 g na2hpo

20、4.h2o 1.56 g kh2po4 0.20 加水至1000 ml 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制 抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95 血清 5一20 碳酸氫鈉 2.0 g/l 青、鏈霉素 各100單位毫升培養(yǎng)基的配制 rpmi-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調(diào)節(jié)ph值至7.2 加血清（終濃度 10）

21、 三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞原代培養(yǎng) 細(xì)胞換液與傳代細(xì)胞換液與傳代 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存與復(fù)蘇換液：全量換液和半量換液換液時(shí)機(jī)的選擇：培養(yǎng)液ph值：細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多， ph值下降，營養(yǎng)液酸化變黃，。細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞換液細(xì)胞傳代方法 根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。1.懸浮生長細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2 半懸浮生長細(xì)胞傳代（hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，

22、可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3貼壁生長細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。貼壁生長細(xì)胞傳代方法：1. 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測）。3. 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4. 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5. 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。6. 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇

23、的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是dmso，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法 1預(yù)先配制凍存液： 含20%血

24、清培養(yǎng)基10% dmso 2 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml) 3 加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。 4 年后，存活率可達(dá)80一90。 dmso液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。收到細(xì)胞的處理方式收到細(xì)胞的處理方式 ( (一一) )1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)，收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請(qǐng)立即若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開始培養(yǎng)，通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存或立即冷凍保存(置于置于70 c， 隔夜后，隔夜

25、后， 移到液氮移到液氮)。 2. 冷凍細(xì)胞解凍程序冷凍細(xì)胞解凍程序: 2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類，不同之血清種類， 若因?qū)嶒?yàn)需要，若因?qū)嶒?yàn)需要， 必須有所不同時(shí)，必須有所不同時(shí)， 務(wù)必以緩慢比例漸次務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，改變培養(yǎng)基組成， 確定細(xì)胞適應(yīng)后，確定細(xì)胞適應(yīng)后， 方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。 2.2. fbs (fe

26、tal bovine serum, 胚牛血清胚牛血清), cs (calf serum, 小牛血清小牛血清)和和hs (horse serum, 馬血清馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。定之血清種類培養(yǎng)之。 2.3. 將培養(yǎng)基置于將培養(yǎng)基置于37 c 水槽中回溫，水槽中回溫， 回溫后噴以回溫后噴以70 % 酒精并擦拭酒精并擦拭之，之， 移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管， 立即放入立即放入37 c 水槽中快速水槽中快速解凍，解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，水面高度不可接近或

27、高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后，分鐘內(nèi)全部融化后， 以以70 % ethanol 擦拭冷凍擦拭冷凍管外部，管外部， 移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。 2.4. 依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺(tái)內(nèi)取依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺(tái)內(nèi)取10 ml 培養(yǎng)基加至培養(yǎng)基加至t25 或或t75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入t25 或或t75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基，內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入混合均勻，放入37 c，5 % co2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 2.5. 對(duì)絕大多

28、數(shù)細(xì)胞而言，對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1 % 以下之冷凍保護(hù)劑以下之冷凍保護(hù)劑dmso，不會(huì)對(duì)細(xì)，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除， 待第二待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對(duì)極少數(shù)因?qū)μ齑_定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對(duì)極少數(shù)因?qū)mso 敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除dmso 者，者， 則可將解凍則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心培養(yǎng)基中，離心300 xg (約約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后， 轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中， 再放入再放入37 c， 5 % co2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收到細(xì)胞的處理方式收到細(xì)胞的處理方式 ( (二二) ) 收到收到t25 flask t25 flask 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞時(shí)， 處理方式為處理方式為 1. 1. 于寄送過程中，為避免起