原生質(zhì)體制備與融合

1、原生質(zhì)體制備與融合原生質(zhì)體制備與融合xxxxxx學(xué)院學(xué)院xxxxxx專業(yè)專業(yè)xxxxxx級級xxxxxx 學(xué)號學(xué)號20132013年年9 9月月2 29 9日日主要內(nèi)容主要內(nèi)容 原生質(zhì)體融合概述原生質(zhì)體融合概述 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體的融合 原生質(zhì)體融合的意義原生質(zhì)體融合的意義原生質(zhì)體融合概述原生質(zhì)體融合概述 原生質(zhì)體融合也稱細(xì)胞雜交、細(xì)胞融合或體原生質(zhì)體融合也稱細(xì)胞雜交、細(xì)胞融合或體細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交,是指把兩個親株分別通過酶解或其他方是指把兩個親株分別通過酶解或其他方法去除細(xì)胞壁，使在高滲環(huán)境中釋放出由原生質(zhì)法去除細(xì)胞壁，使在高滲環(huán)境中釋放出由原生質(zhì)膜包被著的球

2、狀體，然后球狀體細(xì)胞通過介導(dǎo)和膜包被著的球狀體，然后球狀體細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng)培養(yǎng),在離體條件下用人工方法將不同種的細(xì)胞通在離體條件下用人工方法將不同種的細(xì)胞通過無性方式融合成一個核或多核的雜合細(xì)胞的過過無性方式融合成一個核或多核的雜合細(xì)胞的過程。程。 原生質(zhì)體融合技術(shù)起源于原生質(zhì)體融合技術(shù)起源于20 世紀(jì)世紀(jì)60 年代，年代，最初應(yīng)用于動物細(xì)胞中，后逐漸擴展到植物細(xì)胞最初應(yīng)用于動物細(xì)胞中，后逐漸擴展到植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞。和微生物細(xì)胞。6、原生質(zhì)體、原生質(zhì)體 再生再生2、原生質(zhì)體原生質(zhì)體制備條件探究制備條件探究 4、原生質(zhì)體、原生質(zhì)體融合融合3、原生質(zhì)體原生質(zhì)體 制備制備 1、組織材料培養(yǎng)組織

3、材料培養(yǎng)或菌絲體活化或菌絲體活化 5、融合子、融合子的篩選的篩選原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體：通過酶解作用或其他方式除原生質(zhì)體：通過酶解作用或其他方式除去細(xì)胞壁后裸露的有生活力的原生質(zhì)團。去細(xì)胞壁后裸露的有生活力的原生質(zhì)團。 原生質(zhì)體不僅具有活細(xì)胞的性質(zhì)，而原生質(zhì)體不僅具有活細(xì)胞的性質(zhì)，而且可以融合形成雜種細(xì)胞。且可以融合形成雜種細(xì)胞。 原生質(zhì)體由于沒有細(xì)胞壁，所以易于原生質(zhì)體由于沒有細(xì)胞壁，所以易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器以及病毒、細(xì)攝取外來遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器以及病毒、細(xì)菌等。菌等。 組織組織 （葉片、愈傷、菌體）（葉片、愈傷、菌體）酶液酶解酶液酶解25黑暗處理黑暗處理10-15h過

4、濾、離心、過濾、離心、800r/min，5min原生質(zhì)體（含有酶液）原生質(zhì)體（含有酶液）洗滌液洗滌、離心洗滌液洗滌、離心重復(fù)操作兩次重復(fù)操作兩次加入培養(yǎng)液、離心加入培養(yǎng)液、離心二次加入培養(yǎng)液二次加入培養(yǎng)液25，黑暗培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng) 蔗糖溶液蔗糖溶液（18%或或19%）離心后加洗滌液洗滌離心后加洗滌液洗滌再離心再離心影響原生質(zhì)體制備的因素 酶系和酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響 利用酶分解細(xì)胞壁，由于各種生物的細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)存在差異，因此不同的生物所用酶的種類和濃度都有很大的差異。酶的種類和濃度是影響原生質(zhì)體制備的主要因素。一般來說，用混合酶分解細(xì)胞壁的效果一般優(yōu)于單酶。 酶解時間、溫度、pH值對原

5、生質(zhì)體制備的影響 酶解時間的長短直接影響原生質(zhì)化的效果，處理時間過短，脫壁不完全，處理時間過長，會導(dǎo)致原生質(zhì)體脫水皺縮，再生率顯著降低。而且不同的的酶都有各自的最適酶解溫度。酶解時溫度選擇的原則是既有利于原生質(zhì)化，又能防止原生質(zhì)體被破壞。酶解時的pH值隨酶和物種有一定的差異，需根據(jù)實際情況對pH值進行優(yōu)化。 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體制備的影響 細(xì)胞壁脫去后，原生質(zhì)體必須在高滲環(huán)境中保存及生長，否則會因為滲透壓而破裂。因此，滲透壓穩(wěn)定劑也是影響原生質(zhì)體制備的重要因素。0.5% 纖維素酶+1mol/L 的山梨醇處理Lecanicillium sp. 原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體的融合的不同產(chǎn)

6、物原生質(zhì)體的融合的不同產(chǎn)物電誘導(dǎo)融合法：電誘導(dǎo)融合法：短時間強電場作用，質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促使原生質(zhì)體融合激光誘導(dǎo)融合法：激光誘導(dǎo)融合法：讓原生質(zhì)體先緊密貼在一起，后用激光對接觸處照射，使細(xì)胞融合化學(xué)誘導(dǎo)融合法化學(xué)誘導(dǎo)融合法高高pH-高高Ca2+誘導(dǎo)誘導(dǎo)融合融合使體系處于高pH-高Ca2+條件下（0.05mol/LCaCl22H2O）無機鹽誘導(dǎo)融合無機鹽誘導(dǎo)融合以NaNO3作為融合劑PEG誘導(dǎo)融合誘導(dǎo)融合以PEG作為融合劑（相鄰原生質(zhì)體的分子橋）PEG-高高pH-高高Ca2+誘導(dǎo)誘導(dǎo)融合融合:是PEG誘導(dǎo)融合法和高pH-高Ca2+誘導(dǎo)融合法的結(jié)合。影響原生質(zhì)體融合的因素 無機離子對原生質(zhì)體

7、融合的影響無機離子對原生質(zhì)體融合的影響 原生質(zhì)體融合過程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促進融合，而K+、Na+會顯著降低融合率。 融合劑融合劑PEG對原生質(zhì)體融合的影響對原生質(zhì)體融合的影響 僅將原生質(zhì)體混合在一起融合率并不高，需要添加融合劑來提高融合率。PEG較常使用。PEG的相對分子質(zhì)量和濃度高低對融合都有較大的影響。PEG濃度過高會導(dǎo)致原生質(zhì)體皺縮甚至是中毒，過低導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。 融合時間和溫度對原生質(zhì)體融合的影響融合時間和溫度對原生質(zhì)體融合的影響 PEG處理時間是融合的最關(guān)鍵因素之一，尤其是對高Ca2+和高pH值溶液處理時，時間處理非常重要。PEG溶液加入后，原生質(zhì)體間即強烈的發(fā)生黏

8、著，融合能長時間有效進行，因此PEG處理時間常很短。溫度對原生質(zhì)體融合也有一定影響，細(xì)胞膜在較高溫度下流動性增加，PEG黏度下降，有利于原生質(zhì)體融合。（細(xì)菌原生質(zhì)體融合的溫度往往偏低，一般4、20 優(yōu)于37 。）融合子的篩選 利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選融合子利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選融合子 融合雙親為不同營養(yǎng)缺陷型，原生質(zhì)體融合后于基本培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。由于雙親都喪失了合成某種物質(zhì)的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長，而在融合子中，缺陷型的遺傳物質(zhì)得到互補，所以在培養(yǎng)基上可以長出菌落，以此來檢出融合子。 利用抗藥性標(biāo)記篩選融合子利用抗藥性標(biāo)記篩選融合子 微生物的抗藥性是由遺傳物質(zhì)決定的，不同種微生物對同種藥

9、物的抗性存在差異，利用這種差異對融合子進行篩選。 利用滅活標(biāo)記篩選融合子利用滅活標(biāo)記篩選融合子 通過滅活標(biāo)記篩選融合子是指單親或雙親的原生質(zhì)體經(jīng)紫外線照射、加熱或經(jīng)過某些化學(xué)藥劑處理，使其喪失在再生培養(yǎng)基上再生的能力，兩親株融合后，融合子損傷互補，因而可以在再生培養(yǎng)基上存活。 利用某些特殊生理特征作為標(biāo)記篩選融合子利用某些特殊生理特征作為標(biāo)記篩選融合子 利用親本對營養(yǎng)物質(zhì)的利用及固氮能力方面的差異來篩選融合子。融合子的篩選 利用熒光染料標(biāo)記篩選融合子利用熒光染料標(biāo)記篩選融合子 在制備原生質(zhì)體時，向酶解液中加入不同的熒光色素，使雙親原生質(zhì)體在特定波長下呈現(xiàn)不同顏色，原生質(zhì)體融合后，直接于篩選出帶

10、有兩色熒光的融合子 利用分子標(biāo)記篩選融合子利用分子標(biāo)記篩選融合子 融合子是雙親株融合的產(chǎn)物，必然帶有雙親的分子標(biāo)記，因此DNA水平上的分子標(biāo)記是鑒別融合子最可靠的指標(biāo)。 利用碳源利用標(biāo)記篩選融合子利用碳源利用標(biāo)記篩選融合子 利用親株對各種碳源利用的差異，結(jié)合其他特性分離篩選融合子。如：對于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌來說，前者是G-，不產(chǎn)芽孢，不能利用淀粉；后者則為G+，產(chǎn)芽孢，能利用淀粉，可以利用這些特性對融合子進行篩選。 利用其他標(biāo)記篩選融合子利用其他標(biāo)記篩選融合子 利用DNA水平上的分子標(biāo)記或DNA含量、氨基酸含量等生化指標(biāo)來篩選融合子，對具有能直接觀察的形態(tài)學(xué)差異的菌株可通過形態(tài)差異來篩選融合子。原生質(zhì)體再生影響原生質(zhì)體再生的因素 破壁后的殘余胞壁成分對再生的影響破壁后的殘余胞壁成分對再生的影響 原生質(zhì)體制備體系直接影響到再生過程。破壁后的適宜胞壁成分可促進細(xì)胞壁的再生。經(jīng)酶解后一定量的細(xì)胞殘壁可作為合成細(xì)胞壁的“半成品”，有助其再生。 培養(yǎng)及成分對再生的影響培養(yǎng)及成分對再生的影響 原生質(zhì)體置于再生培養(yǎng)基上，壁的再生以及結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)往往同時進行，互為協(xié)調(diào)。再生培養(yǎng)基中的某些物質(zhì)既可作為