腺病毒的擴(kuò)增及純化

1、重組腺病毒構(gòu)建，擴(kuò)增及純化基本技術(shù)操作（細(xì)菌內(nèi)同源重組AdEasy System）一 目的基因的克隆（以pshuttle-CMV質(zhì)粒為例）1. 選擇適當(dāng)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切連接，將目的片段插入pshuttl-CMV質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)。2. 重組質(zhì)粒鑒定： 酶切鑒定或測(cè)序。3. 重組質(zhì)粒擴(kuò)增，純化并準(zhǔn)備適量含目的基因的穿梭質(zhì)粒。4. 用PmeI單酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒，電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開。5. 膠回收線性化質(zhì)粒，以備共轉(zhuǎn)化使用。二 共轉(zhuǎn)化1 大腸桿菌BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備 從新鮮瓊脂板上挑取單個(gè)BJ5183細(xì)菌，接種于LB培養(yǎng)基中，37振搖過夜。 接種25ml過夜培養(yǎng)物于500ml LB培養(yǎng)基

2、，37振搖，至OD600 達(dá)到0.4。 迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中30min，至充分冷卻。 將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4下以2500r/min離心15 min，棄培養(yǎng)液，回收細(xì)胞。 以10ml預(yù)冷的10%甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。 加約1ml（適量）預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀，稀釋懸液100倍，測(cè)量OD600，至稀釋濃度為2-31010個(gè)細(xì)胞/ ml (1.0 OD600約2.51010個(gè)細(xì)胞/ml)。分裝，-80或液氮保存待用。2 病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)增，純化。3 將1-5l (約1g) 線性化的穿梭質(zhì)粒及1l（約100ng/l）病毒骨架質(zhì)粒（如pAdEasy-1）加入至含約40l

3、 BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)的EP管中混勻,冰上冷卻。4 將混合物加入電轉(zhuǎn)杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms）。5 電擊結(jié)束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養(yǎng)液，37低速振蕩40min。6 取適當(dāng)體積的電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂于數(shù)個(gè)卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37培養(yǎng)16-20hr。7 次日挑取平板上長(zhǎng)出的菌落（選擇最小的菌落）,接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養(yǎng)基，37培養(yǎng)10-15hr。8 堿裂法提取質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質(zhì)粒為可能陽性克隆，進(jìn)一步酶切鑒定。以PacI單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb）,及一條小片段（約3.

4、0或4.5kb）（同時(shí)可進(jìn)行其它酶切鑒定），則基本確定為陽性克隆。9 取1-5l 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5大腸桿菌細(xì)胞（BJ5183為recA+,質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變，DH5或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩(wěn)定擴(kuò)增已鑒定的重組質(zhì)粒），擴(kuò)增細(xì)菌并純化質(zhì)粒。三 重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)293細(xì)胞1 293細(xì)胞培養(yǎng)：轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)前，以方瓶為例，接種2106 293細(xì)胞于25cm2方瓶，使生長(zhǎng)密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）2 以PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒（轉(zhuǎn)導(dǎo)25cm2方瓶約需4gDNA），完全線性化后，乙醇沉淀，再以20 l ddH2O溶解。3 脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒（以Lipo

5、fectamine為例）:每4g PacI約需20l Lipofectamine包裹.質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于500l無血清培養(yǎng)基再混合,置于室溫下15-30min。4 以無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)瓶，另加2.5ml無血清培養(yǎng)基，37放置10min。5 將Lipofectamine-DNA混合物加入培養(yǎng)瓶，37孵箱放置4hr。6 4hr后，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FCS）。如有大量細(xì)胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基，37孵育過夜，再換液。7 培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。約2周后可觀察到

6、細(xì)胞病變（CPE）出現(xiàn)（如用pAdTrack-CMV質(zhì)粒，由于含GFP，可觀察到綠色熒光）。四 重組病毒鑒定1 轉(zhuǎn)導(dǎo)10-14d后，收集細(xì)胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細(xì)胞，離心后收集上清保存于-80。2 取30-50% 步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細(xì)胞。2-3d后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。3 感染后3-5d,當(dāng)1/3-1/2細(xì)胞漂浮時(shí)收集病毒。按步驟1收集細(xì)胞并準(zhǔn)備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。4 PCR鑒定重組病毒。取5l病毒上清加入10l蛋白酶K，55孵育1hr，再煮沸5min，離心后取1-2l作PCR。五 重組病

7、毒擴(kuò)增，純化1 75cm2方瓶中接種293細(xì)胞，至密度達(dá)到90%，加入適量病毒上清感染細(xì)胞。3-4d后，細(xì)胞幾乎變圓，且有一半細(xì)胞漂浮，則收集所有細(xì)胞。約500g轉(zhuǎn)速離心，棄上清。2 以滅菌PBS重懸沉淀，反復(fù)凍融4次。4下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm2方瓶細(xì)胞。3 CsCl連續(xù)梯度離心純化：50ml離心管中稱量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混勻，體積約為10ml。轉(zhuǎn)移至12ml超速離心管（用于SW41轉(zhuǎn)頭）中，覆蓋約2ml礦物油。平衡后，10下32000 rpm離心18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶。（也可CsCl不連續(xù)梯度離心：20ml超速

8、離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至體積達(dá)到20ml。平衡后，4下 23000rpm離心90min (SW28轉(zhuǎn)頭)，用注射器抽吸下層藍(lán)白色病毒帶）4 病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose），滅菌處理。4透析，更換3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80。六 病毒滴度測(cè)定（TCID50）1 細(xì)胞準(zhǔn)備

9、:96孔板中接種100l 293細(xì)胞,每孔細(xì)胞數(shù)約104個(gè),以2% DMEM培養(yǎng)2 稀釋病毒液準(zhǔn)備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個(gè)較高濃度（如10-3-10-10），每個(gè)濃度重復(fù)10個(gè)，每孔加入病毒稀釋液100l。另留兩排不加病毒液作為陰性對(duì)照。37下，孵箱培養(yǎng)10天。3 10d后觀察細(xì)胞，記數(shù)每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計(jì)算細(xì)胞病變率。（如某一濃度各孔細(xì)胞全部病變，比率為1，如無細(xì)胞病變，則比率為0）。4 計(jì)算T =10101 + d (S - 0.5) /mld = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋，d=1） S = 各濃細(xì)胞病變比率之和實(shí)驗(yàn)室重組腺病毒常用質(zhì)粒：病毒骨架質(zhì)粒：pAdEa

10、sy-1, pAdEasy-2穿梭質(zhì)粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV腺病毒的包裝，純化和感染技術(shù)背景：Adeasy系統(tǒng)利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優(yōu)點(diǎn)，并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1，使之成為較為安全、高效的病毒載體。利用帶有 E1 基因的 293 細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，通過倍比擴(kuò)增，富集病毒顆粒，并通過CsCl 梯度離心，透析進(jìn)行分離純化。對(duì)絕大多數(shù)的細(xì)胞株可以達(dá)到近乎100的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同樣具有所有病毒載體或轉(zhuǎn)染試劑都不可避免的細(xì)胞毒性問題。所需試劑：? 293細(xì)胞；? 重組好的

11、腺病毒質(zhì)粒；? Pac I限制性內(nèi)切酶；? 質(zhì)?；厥障嚓P(guān)試劑；? 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑；? TBS：10mMTris, 0.9% NaCl,pH8.1;? 40%CsCl：28.45gCsCl 溶于42.7ml 的TBS 中，4度保存；? 15%CsCl：9.085gCsCl 溶于47.69ml 的TBS 中，4度保存；? Beckman 離心管：14*89 mm，SW41 轉(zhuǎn)頭；? Polybrene(sigma)，10 mg/ml；? 透析袋：Spectrum Co. （成卷供應(yīng)，帶少量甘油，硫化物與重金屬），MW=800014400；? 滅菌甘油。操作流程：1. 293細(xì)胞（E1-tr

12、ansformedhumanembryonickidneycells 在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)接種于1或2個(gè)60mm 培養(yǎng)盤中，使之在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率為50-70%；2. 在轉(zhuǎn)染前，用Pac I處理目的質(zhì)粒（一般一個(gè)60mm 細(xì)胞盤需要6gDNA）。處理后質(zhì)粒用乙醇沉淀并重懸于20l 無菌水中；3. 用PEI或其他轉(zhuǎn)染試劑將6gPac I處理過的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；14. 8 個(gè)小時(shí)后移去混合液，加入 4 ml DMEM 完全培養(yǎng)液（10% CBS，1%Pen/Strep）；5. 在轉(zhuǎn)染后 7 到 10 天用細(xì)胞刮（而不是胰酶）將細(xì)胞從瓶中刮下并移入 50ml錐形管。離心后將細(xì)胞重懸于2.0ml PBS 或

13、全培液中。于液氮中凍結(jié)細(xì)胞，37水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進(jìn)行4 次。注意保存時(shí)不要反復(fù)凍融，可保存于-20；6. 將293細(xì)胞以50-70%的匯合率鋪于60mm 培養(yǎng)盤中，以30-50%的體積比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明顯的細(xì)胞裂解或CPE現(xiàn)象；7. 在有 1/3 到 1/2 的細(xì)胞脫離漂浮時(shí)，通常是感染后 3-5 天收集病毒。可進(jìn)一步通過Westernblot 或PCR（5l 病毒上清加上10l PCR-gradeProteaseK，55消化1小時(shí)，然后煮沸樣品5min，離心后取1-2l 進(jìn)行PCR反應(yīng)）證實(shí)重組腺病毒的存在；78. 按步驟5的方法收集病毒上清。在這種

14、情況下一般至少可收集到10 infectiousparticles/ml 的病毒。每輪的擴(kuò)增應(yīng)能提高一個(gè)數(shù)量級(jí)的梯度；9. 為了進(jìn)一步擴(kuò)增，將步驟8獲得的病毒上清進(jìn)一步感染100 mm 培養(yǎng)盤的細(xì)胞，按步驟5的方法收集病毒，并進(jìn)而將其感染150mm 細(xì)胞培養(yǎng)盤中的293細(xì)胞，以獲得足夠量的病毒；10. 將15%CsCl 和40%CsCl 加入Beckman 離心管中制備CsCl 梯度溶液；11. 將最終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；12. 超速離心，30000rpm，4度離心16個(gè)小時(shí)；13. 離心后，應(yīng)有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較

15、低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用16號(hào)針頭將這一條帶收集；14. 在TBS 中透析一小時(shí)，隨后在含有10甘油的TBS 中透析兩次，每次一小時(shí)；15. 將純化的腺病毒分裝于EP 管中；16. 在Eppendorf Biophotometer中測(cè)量透析液中的總蛋白量，1g病毒蛋白相當(dāng)于4109病毒顆粒；17. 長(zhǎng)期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反復(fù)凍溶；218. 由于腺病毒對(duì)不同細(xì)胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細(xì)胞毒副作用，通常通過梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對(duì)細(xì)胞數(shù)1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒顆粒感染靶細(xì)胞；加入相對(duì)培養(yǎng)液體積

16、1：1000的Polybrene。在 37度下平板離心30分鐘；19. 感染 812 小時(shí)后換液。將含有病毒的培養(yǎng)液小心移入含有消毒液的廢液缸中，加入適量全培液。參考文獻(xiàn)：1Proc. Natl. Acad. Sci. USA，Vol. 95, pp. 25092514, March 1998，Asimplifiedsystem for generatingrecombinant adenoviruses.2Current Protocols inHumanGenetics (2004)12.4.1-12.4.25.病毒感染力的滴定（TCID50的測(cè)定）實(shí)驗(yàn)操作步驟、計(jì)算方法2009-11-2

17、8 15:20一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解病毒感染力測(cè)定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50的操作步驟、計(jì)算方法及含義。二、測(cè)定病毒感染力的方法半數(shù)致死量LD50( 50% lethal dose)：用動(dòng)物或雞胚來檢測(cè)半數(shù)雞胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測(cè)半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用細(xì)胞來檢測(cè)蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細(xì)胞來檢測(cè)三、材料1、長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長(zhǎng)液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中