免疫細(xì)胞化學(xué)常用試劑

1、免疫細(xì)胞化學(xué)常用試劑一、固定劑大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì)為水溶性，在用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，常需固定。但肽類和蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)不同，因而對不同的固定方法或固定劑的反應(yīng)也不盡相同。某些固定劑甚至可同時破壞和/或保護(hù)同一抗原的不同抗原決定簇。因此，在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，很有必要了解所要研究的物質(zhì)（蛋白質(zhì)或肽類）的化學(xué)性質(zhì)，并根據(jù)需要來選擇適宜的固定劑（或固定方法）以及改進(jìn)固定條件。目前，免疫細(xì)胞化學(xué)研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑，其中以甲醛類和戊二醛最為常用。在此，簡要介紹幾種目前較為常用和推薦的固定劑，以供讀者選用。1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.3）試劑：多

2、聚甲醛40g0.1mol/L磷酸緩沖液至1000ml配制方法：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡稱PB），加熱至60左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混勻。該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，最好是動物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)浸泡固定224h。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長期保存。2.4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉試劑：A液：多聚甲醛40g蒸餾水400mlB液：Na2HPO42H2O16.

3、88g蒸餾水300mlC液：NaOH3.86g蒸餾水200m配制方法：A液最好在500ml的三角燒瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時，要盡量避免吸入氣體或濺入眼內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 將pH調(diào)至7.27.4，最后，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml充分混合，4冰箱保存?zhèn)溆?。該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時，最好加入少量新鮮配制的戊二醛，使其終濃度為0.5%1%。該固定劑較溫和，適于組織的長期保存。組織標(biāo)本于該固定液中，4冰箱保存數(shù)月仍可獲得滿意的染色效果。3Bouins液及改

4、良Bouins液試劑：飽和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先將飽苦味酸過濾，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。改良Bouins液即不加冰醋酸。該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑這一，對組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整。但因偏酸（pH為33.5），對抗原有一定損害，且組織收縮較明顯，故不適于組織標(biāo)本的長期保存。此外，操作時，應(yīng)避免吸入或與皮膚接觸。4Zambonis(Stefaninis)液試劑：多聚甲醛20g飽和苦味酸 150mlKarasson-Schwlts PB至1000ml配制方法：稱取多聚甲醛20g，加入飽

5、和苦味酸150ml，加熱至60左右，持續(xù)攪拌使充分溶解、過濾、冷卻后，加Karasson-Schwlts PB至1000ml充分混合（Karasson Schwlts磷酸緩沖液的配制配制方法見后）。該固定液適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對超微結(jié)構(gòu)的保存較純甲醛為優(yōu)，也適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，為實驗室常用固定劑之一。我們在應(yīng)用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的飽和苦味酸，以增加其對組織的穿透力和固定效果，保存更多的組織抗原。固定時間為618h。5PLP液PLP液即過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-aldehyde fixative）試劑：過碘酸鈉

6、賴氨酸鹽酸鹽（或鹽酸賴氨酸）：多聚甲醛蒸餾水配制方法：（1）貯存液A（0.1mol/L賴氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：稱取賴氨酸鹽酸鹽1.827g溶于50ml蒸餾水中，得0.2mol/L的賴氨酸鹽酸鹽溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，將pH調(diào)至7.4，補(bǔ)足0.1mol/L的PB至100ml，使賴氨酸濃度也為0.1mol/L,4冰箱保存，最好兩周內(nèi)使用。此溶液的滲透濃度為300mOs mmol/L/kg。（2）貯存液B（8%多聚甲醛溶液）：稱8g多聚甲醛加入100ml蒸餾水中，配成8%多聚甲醛液（方法見前）。過濾后4冰箱保存。（3）臨用前，以3份A液與1份B液

7、混合，再加入結(jié)晶過碘酸鈉（NaIO4），使NaIO4終濃度為2%。由于AB兩液混合，pH從約7.5降至6.2，故固定時不需再調(diào)pH值。固定時間為618h。該固定劑較適于富含糖類的組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。其機(jī)制是借助于過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過賴氨酸的雙價氨基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。由于組織抗原絕大多數(shù)都是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定劑有選擇性地使糖類固定，這樣既穩(wěn)定了抗原，又不影響其在組織中的位置關(guān)系。Mclean和Nakane等認(rèn)為，最佳的混合是：含0.01mol/L的過碘酸鹽、0.075mol/L的賴氨酸、2%的多聚甲醛及0.

8、037mol/L的磷酸緩沖液。6Karnovskys液（pH7.3）試劑：多聚甲醛30g25%戊二醛80ml0.1mol/L PB至1000ml配制方法：先將多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混勻。該固定劑適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，用該固定液在4短時固定，比在較低濃度的戊二醛中長時間固定能更好地保存組織的抗原性和細(xì)微結(jié)構(gòu)。固定時最好先灌注固定，接著浸泡固定1030min，用緩沖液漂洗后即可樹酯包埋或經(jīng)蔗糖溶液后用于恒冷切片。70.4% 對苯醌 （Parabenzoquinone）試劑：對苯醌4.0g001mol/L PBS1000ml配

9、制方法：稱取4.0g對苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。對苯醌對抗原具有較好的保護(hù)作用，但對超微結(jié)構(gòu)的保存有一定影響，故常與醛類固定劑混合使用。一般要求臨用前配制，且避免加熱助溶，因加熱或放置時間過長，固定液變?yōu)樽厣梁稚?，會使組織標(biāo)本背景增加，影響觀察。此外，對苯醌有劇毒，使用時避免吸入或與皮膚接觸。8PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）試劑：對苯醌20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸鈉緩沖液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸鈉緩沖液溶解對苯

10、醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸鈉緩沖液至1000ml充分混合。對苯醌與戊二醛及甲醛聯(lián)合應(yīng)用，即可阻止醛基對抗原的損害，又不影響超微結(jié)構(gòu)的保存，故適于多種類抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)，尤其是免疫電鏡的研究。9碳二亞酰胺-戊二醛（ECD-G）液試劑：0.05mol/L PB500ml0.01mol/L PBS 500mlTris約14g濃HCl 少許ECD 10g25%戊二醛3.5ml配制方法：先以約500ml的PB與相同體積的PBS混合，加入Tris（使其終濃度為1.4%）溶解，以濃HCl調(diào)pH至7.0，再將事先稱取好的ECD和戊二醛加入混合液，振搖后計時，用pH計檢測，約23min時，p

11、H降至6.6，再以1N的NaOH在4min內(nèi)調(diào)pH至7.0，此時，將該混合固定液加入盛有細(xì)胞（經(jīng)PBS漂洗過）的器皿中，在23固定7min后，以PBS洗去固定液，即可進(jìn)一步處理。ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboiimide hydrochloride，簡稱乙基-CDI，常用于多肽類激素的固定，對酶等蛋白質(zhì)的固定也有良好效果。ECD單獨(dú)應(yīng)用時，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛、Tris及PB聯(lián)合應(yīng)用，效果明顯改善，細(xì)胞質(zhì)仍可滲透，利用細(xì)胞中抗原的定位，超微結(jié)構(gòu)保存較好。目前認(rèn)為是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞電鏡水平免疫細(xì)胞化學(xué)研究

12、的很好的固定劑。10四氧化鋨（鋨酸Osmic Acid, OsO4）配制：將洗凈裝有OsO4的安瓿中加熱后，迅速投入裝有溶劑的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用鉆石刀在安瓿上劃痕，洗凈后再放入瓶中，蓋好瓶塞，用力撞擊安瓿，待其破后加溶劑稀釋。為保證充分溶解，應(yīng)在用前幾天配制。（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作為儲備液，于冰箱中密封保存。（2）1% OsO4-PB：試劑：A、2.26%NaH2PO42H2O4.15mlB2.52%8.5mlC、5.4%葡萄糖5mlD、OsO40.5g配制方法：先分別配好A、B、C三種液體，取A液41.5ml與B液8.5ml混合，將pH

13、調(diào)至7.37.4，取AB混合液45ml再與5ml C液混合即為0.12mol/L PBG。（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.27.4）：試劑：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.27.4）10ml配制方法：取2%OsO4儲備液10ml與等量0.2mol/L、pH7.27.4的二甲胂酸鈉緩沖液充分混合即可。OsO4是電鏡研究所必需的試劑，常用于后固定。盡管OsO4主要為脂類固定劑，但也可與肽類及蛋白質(zhì)起作用，形成肽-蛋白質(zhì)或肽-脂交聯(lián)。過氧化物酶的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理后，電子密度增高，適于電鏡研究。但由于OsO4的反應(yīng)產(chǎn)物對光及電

14、子有較明顯的吸收能力，因此在免疫細(xì)胞化學(xué)染色前常需去除，去鋨在光鏡水平常用1%的高錳酸鉀，在電鏡水平則常用H2O2來處理。以上介紹了目前免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的一些固定液。關(guān)于固定液種類還很多，如70%90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%1%醋酸的70%90%的酒精等），這些溶液都能促使蛋白質(zhì)凝固。它們最初只是光學(xué)顯微鏡通用的固定液，但在免疫細(xì)胞化學(xué)上用其它方法不成功時，也可試用?？傊?，掌握一個原則，免疫細(xì)胞化學(xué)中，含重金屬的固定液禁用（但Zenker-Formalin可進(jìn)行短時的固定）。目前多數(shù)認(rèn)為，對生物標(biāo)本較好的固定措施是：用4的Karnovskys液灌注固定1030min后，接著在pH

15、7.3、0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液中漂洗過液，這種短時冷固定處理，有助于超微結(jié)構(gòu)和許多肽類抗原的保存。對其它較難保存的抗原可嘗試PFG、PLP及Zambonis液等混合固定液。二、緩沖液免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的緩沖液種類較多，即使是同種緩沖液，其濃度、pH、離子強(qiáng)度等也常常不同。在此介紹幾種最常用的緩沖液的配制。10.2mol/L(pH7.4)磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer, PB）試劑： NaH2PO42H2ONa2HPO412H2O配制方法：配制時，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸

16、鹽緩沖液（PB），根據(jù)需要可配制不同濃度的PB和PBS。（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；稱取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：稱取NaHPO4.12H2o 71.632g（或 Na2HPO47H2O 53.6g或 Na2HPO42H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。 （3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO412H2O,充分混合即為0.2mol/L的PB（pH約為

17、7.47.5）。若pH偏高或偏低，可通過改變二者的比例來加以調(diào)整，室溫保存即可。20.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate Buffered Saline, PBS）試劑：0.2mol/L PB50mlNaCl 8.59g(約0.15mol/L)重蒸水 至1000ml配制方法：稱取NaCl 8.59g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻即可。若擬配制0.02mol/L的PBS，則PB量加倍即可，依此類推。PB和PBS是免疫細(xì)胞化學(xué)實驗中最為常用的緩沖液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗組織標(biāo)本、稀釋血清等，其

18、pH應(yīng)在7.257.35之間，否則需要調(diào)整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情況下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀釋成0.01mol/L的PBS時，常可達(dá)到要求的pH值，若需調(diào)整pH，通常也是調(diào)PB的pH。3Karasson Schwlts磷酸鹽緩沖液試劑： NaH2PO4H2O3.31gNa2HPO47H2O33.77g重蒸水 至1000ml配制方法：同前該緩沖液主要用于配制Zambonis固定液。40.5mol/L pH7.6的Tris- HCl緩沖液。試劑：Tris(三羥甲基氨基甲烷)60.57g1N HCl約420ml重蒸水 至1000ml配制方法：先以少

19、量重蒸水（300500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH將pH調(diào)至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液為儲備液，于4冰箱中保存。免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的Tris-HCl緩沖液濃度為0.05mol/L，用時取儲備液稀釋10倍即可。該液主要用于配制Tris緩沖生理鹽水（TBS）、DAB顯色液。5Tris緩沖生理鹽水（Tris Buffered,Saline,TBS）試劑：0.5mol/L Tris-HCl緩沖液100mlNaCl3.59g(0.15mol/L)重蒸水至1000ml配制：先以重蒸水少許溶解NaCl,再加Tris-HCl緩沖液，最后加重蒸水至1000ml，

20、充分搖勻使Tris終濃度為0.05mol/L。TBS主要用于漂洗標(biāo)本，常用于免疫酶技術(shù)中。6Tris-TBS(PBS)試劑：Triton X-10010ml(1%)或3ml(0.3%)0.5mol/L Tris緩沖液（pH7.6）1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)NaCl8.59g重蒸水至1000ml配制方法：先以重蒸水少許溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris緩沖液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻。該液常用濃度為1%及0.3%，前者主要用于漂洗標(biāo)本，后者主要用于稀釋血清。70.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸緩沖液試劑：0.2mol/L二甲

21、胂酸鈉500ml0.1N HCl28ml蒸餾水至1000ml配制方法：先稱取二甲胂酸鈉（MW：214）42.8g,加蒸餾水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸鈉溶液；再取HCl 1.7ml加蒸餾水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸鈉溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸餾水至1000ml，即為0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液。8幾種常用的不同pH值緩沖液的配制表（1）0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH5.78.0）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2HPO4(ml)5.793.56.55.892.08.05.

22、990.010.06.087.712.36.185.015.06.281.518.56.377.522.56.473.526.56.568.531.56.662.537.56.756.543.56.851.049.06.945.055.07.039.061.07.133.067.07.228.072.07.323.067.07.419.081.07.516.084.07.613.087.07.710.589.57.88.591.57.97.093.08.05.394.7(2)0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.199.10）pH0.2mol/L Tris(ml)0.2mol/L

23、 HCl(ml)H2O7.1910.018.012.07.3610.017.013.07.5410.016.014.07.6610.014.015.07.7710.014.016.07.8710.013.017.07.9610.012.018.08.0510.011.019.08.1410.010.020.08.2310.09.021.08.3210.08.022.08.4110.07.023.08.5110.06.024.08.6210.05.025.08.7410.04.026.08.9210.03.027.09.1010.02.028.0(3)0.2mol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.65.

24、6）pH0.2mol/L醋酸（ml）0.2mol/L醋酸鈉（ml）3.646.33.73.844.06.04.041.09.04.236.813.24.430.519.54.625.524.54.820.030.05.014.835.25.210.539.55.48.841.25.64.845.2(4)0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH5.07.4）pH0.2mol/L二甲胂酸鈉（ml）0.2N HCl(ml)蒸餾水5.02523.551.55.22522.552.55.42521.553.55.62519.655.55.82517.457.56.02514.860.36.22511.96

25、3.16.4259.265.86.6256.768.36.8254.770.37.0253.271.87.2252.172.97.4251.473.6注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸鈉-HNO3緩沖液。（5）0.2mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.210.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3(ml)9.24.046.09.37.542.59.49.540.59.513.037.09.616.034.09.719.530.59.822.028.09.925.025.010.027.522.510.130.020.010.233.017.010.33

26、5.514.510.438.511.510.540.59.510.642.57.510.745.05.0三、顯色液免疫細(xì)胞化學(xué)中，由于抗原-抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物本身無色，無法直接觀察，因而需借助于某些化學(xué)基團(tuán)的呈色作用，使其得以顯示，以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有：1DAB（Diaminobenzidine）顯色液DAB即3，3-二氨基苯聯(lián)胺試劑：DAB（常用四鹽酸鹽）50mg0.05mol/L TB 100ml30% H2O23040l配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分搖勻，使DAB終濃度為0.05%,過濾后顯色前加入30%的H

27、2O23040l，使其終濃度為0.01%。DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法（如酶標(biāo)法、PAP法等），其終產(chǎn)物可直接在光鏡下觀察，也可經(jīng)OsO4處理后，增加反應(yīng)產(chǎn)物的電子密度，用于電鏡觀察。但有幾點(diǎn)需注意：DAB溶解要完全，否則未溶解的顆粒沉積于標(biāo)本上影響觀察；DAB濃度不易過高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作時應(yīng)戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時徹底沖洗，接觸DAB的實驗用品最好經(jīng)洗液浸泡24h后使用。24-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）顯色液配方1：4-Cl-1-萘酚 100mg純乙醇 10ml0.05mol/L TB(pH7.6)190m

28、l30% H2O2 10l(0.003%)配制方法：先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其終濃度為0.005%，切片顯色時間通常為520min。配方2：4-Cl-1-萘酚N-二甲基甲酰胺（DMF）0.05mol/L TB(pH7.6)30% H2O2配制方法：先將4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加熱溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色變?yōu)樾鯛睿?.5加熱5min后加入H2O2，攪動使絮狀消失，趁熱過濾，當(dāng)降至略低于50時才放入組織標(biāo)本（注意：溫度過高易損傷標(biāo)本，過低則易重新出現(xiàn)沉淀）。顯色時間通常為5min左右。4-Cl-1-萘酚的終產(chǎn)物顯示藍(lán)

29、色。多數(shù)認(rèn)為最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等認(rèn)為，白色沉淀可作為背景，使陽性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標(biāo)本，勿用酒精脫水。33-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）顯色液試劑：AEC20mg二甲基甲酰胺（DMF）2.5ml0.05mol/L醋酸緩沖液（pH5.5）50ml30%H2O225ml配制方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前，加入30%H2O2。切片顯色時間為520min。該顯色液作用后，陽性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產(chǎn)物溶于酒精和水，

30、故需用甘油封固。4TMB顯色液試劑：TMBHCl亞硝基鐵氰化鉀無水酒精配制方法：（1）醋酸鹽緩沖液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸鈉400ml中混合，再加蒸餾水稀釋至1000ml，用醋酸或NaOH將pH調(diào)至3.3。（2）A液：取上述緩沖液5ml，溶解100mg亞硝基鐵氰化鉀，加蒸餾水92.5ml混合。（3）B液：稱取5mg TMB加入2.5ml無水酒精中，可加熱至3740直到TMB完全溶解。（4）孵育液：放入標(biāo)本前數(shù)秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于試管中充分混合。（液體在20min內(nèi)應(yīng)保持清亮的黃綠色，否則可能已有污染）。酶反應(yīng)時，加入終濃度為0.

31、005%的H2O2。（5）主要顯色步驟：組織標(biāo)本在蒸餾水（或PBS）中漂洗數(shù)次（每次約1015min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（1930），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.05.0ml）繼續(xù)孵育液20min左右（1923），撈出標(biāo)本漂洗數(shù)次（共30min左右）。在04條件下可在漂洗液放置4h直至貼片、脫水，封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負(fù)染23min，也可在1%派諾寧（pH3.33.5）中負(fù)染5min后貼片、脫水、封片。TMB即四甲基聯(lián)苯胺（Tetrabenzidine）是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，因此容易進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞器中的HRP反

32、應(yīng)，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深蘭色沉淀物，這使得TMB成為組化實驗中的一種很好的發(fā)色團(tuán)。同時反應(yīng)產(chǎn)物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應(yīng)進(jìn)行。TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色，利于光鏡觀察，且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大，常超出單個細(xì)胞器的范圍（而DAB則被限制在其內(nèi)），故TMB反應(yīng)的檢測閾較低。由于上述優(yōu)點(diǎn)，目前TMB常用于光鏡及超微結(jié)構(gòu)水平的HRP及HRP-WGA神經(jīng)投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A液和B液應(yīng)在2h內(nèi)新鮮配制。另外，TMB是一種較強(qiáng)的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時應(yīng)帶手套及在通風(fēng)條件下操作。5NBT顯色液試劑A

33、液：5%NBT：稱 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）內(nèi)，充分混合，常存于4，也可裝成小份，-20保存，用前復(fù)溫。B液：5% BCIP：稱取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF內(nèi)，混勻。4或分裝存于-20，用前恢復(fù)至室溫。C顯色液：取A液40l，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,鈐0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管內(nèi)，充分混勻；再加入B液40l，輕輕混合即可。最好用前新鮮配制。NBT即四唑氮藍(lán)（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,為深藍(lán)色無定形微溶物質(zhì)。BCIP即5-溴-4-

34、氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。當(dāng)二者存在時，在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍(lán)色或紫色沉淀。四、粘附劑在免疫細(xì)胞化學(xué)工作中，由于標(biāo)本（如切片）的脫落常影響工作的質(zhì)量的速度，故粘附劑的選擇和使用就顯得較為重要。1鉻礬明膠液試劑：鉻礬0.5g明膠（Gelatine）5gH2O 1000ml方法：在1000ml的燒杯或燒瓶中，以500800ml H2O加溫溶解明膠，待其完全溶解后，再加入鉻礬。注意溫度過高易使明膠燒糊，包被玻片時最好控制水溫在70。如有明顯殘渣，過

35、濾后使用。2甲醛-明膠液試劑：40%甲醛2.5ml明膠0.5g蒸餾水至100ml配制方法：用少許蒸餾水（約80ml）加熱溶解明膠，待完全溶化后，加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至100ml混勻即可。3多聚賴氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）試劑：多聚賴氧酸 5g蒸餾水 1000ml配制方法：稱取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液濃度為0.5%，可適當(dāng)稀釋配成0.010.5%濃度。4保存，也可-20備用。PLL可反復(fù)冰凍，效果無明顯影響，工作液常再稀釋1050倍。4Vectabond試劑該試劑是Vector公司新進(jìn)推出的一種新型玻片粘附劑。該試劑與一般的粘附劑不同，它是通過對玻璃表面起化學(xué)修

36、飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，貼上后不易脫落，保留時間較久。一個試劑盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮配）。處理載玻片前（事先酸處理），用染色缸裝好各種液體，按下列程序進(jìn)行：干凈載玻片丙酮5minVectabond試劑工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：將載玻片用鑷子夾住浸入Vectabond試劑12次dH2O，25min干燥（37過夜）用鋁箔包好，室溫存放備用。注意：避免污染（塵埃等）。綜上述方法處理的載片一般可存放半年以上。五、封固劑1甘油-TBS及甘油-PBS配制方法：按比例將甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4，冰箱靜止

37、；待氣泡排除后方可使用。2甘油-明膠（凍）試劑：明膠 10g甘油 12ml蒸餾水 100ml香草酚 少許配制方法：稱取1g明膠于溫?zé)幔s40）的蒸餾水中，充分溶解后過濾，再加入12ml甘油混合均勻。少許香草酚是為了防腐。3液體石蠟液體石蠟因含雜質(zhì)少，很少引起非特異性熒光，故常用于熒光組化及免疫熒光法時標(biāo)本的封固。4DPX試劑：Distrene 10g酸二丁 5ml二甲苯35mlDPX為中性封固劑，用于多種染色方法勻不易褪色，但組織收縮較明顯，故應(yīng)盡量使其為均勻的一薄層。DPX現(xiàn)有商品出售，可直接應(yīng)用。若感過于粘稠，也可加少量二甲苯稀釋后應(yīng)用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯揮發(fā)后，片子上出現(xiàn)許

38、多干燥的空泡，影響觀察，遇有這種情況，可用二甲苯浸泡掉蓋玻后重新封固。六、酶消化液10.1%胰蛋白酶試劑：胰蛋白酶 0.1gm0.1%氯化鈣（pH7.8）100ml配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH將其pH調(diào)至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前將胰蛋白酶消化液在水浴中予熱至37（載有標(biāo)本的玻片也在TBS中予熱至同樣樣溫度）。該消化液時間約為530min。20.4%胃蛋白酶試劑：胃蛋白酶 400mg0.1N HCl 100ml配制方法：同胰蛋白酶。消化時間在37約為30min。30.06% Pronase試劑：Pronase0.06g0.05mol/L TB(pH

39、7.5) 100ml配制方法：同前。在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中，有時經(jīng)Formalin過度固定的標(biāo)本，常會產(chǎn)生過量的醛基，遮蓋抗原，影響一抗與抗原的結(jié)合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化時間應(yīng)根據(jù)不同組織而異，總之，在保持組織形態(tài)不被破壞的前提下，宜盡量延長消化時間。以上三種酶消化液中，以第一種最為常用。七、其它1蔗糖溶液免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的蔗精，常用濃度為5%30%。一般光鏡研究，僅用20%蔗糖處理已足矣，若制備電鏡標(biāo)本，在冰凍前最好經(jīng)上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）處理，以確保其良好的細(xì)微結(jié)構(gòu)。（1）20%蔗糖液：試劑：蔗糖 20g0.1mol/L PB(pH7.5) 至100ml配制方法：先以少許0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4冰箱保存。該液多用于純光鏡研究。標(biāo)本在剛放入濃度如此高的蔗糖液，常浮在上面，當(dāng)標(biāo)本沉到底部時即可。通常光鏡標(biāo)本浸泡在20%蔗糖液中過夜。都能達(dá)到要求。（2）20%蔗糖-5%甘油：試劑：蔗糖 20g甘油 5ml0.1mol/L PB至100ml(約95ml)配制方法：先用少許PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混勻，最后補(bǔ)足PB至100ml，于