realtimePCR和RTPCR詳解及其區(qū)別.

1、real-time pcr技術(shù)的原理及應(yīng)用摘要：一、實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理 （一）定義：在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。 （二）實(shí)時(shí)原理 1、常規(guī)pcr技術(shù)： 對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)一、實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理（一）定義：在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。（二）實(shí)時(shí)原理1、常規(guī)pcr技術(shù)：對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。2、實(shí)時(shí)

2、定量pcr技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)pcr擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析 3、如何對(duì)起始模板定量？ 通過(guò)ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析.4、幾個(gè)概念：（1）擴(kuò)增曲線 ：（2） 熒光閾值： （3）ct值： ct值的重現(xiàn)性： 5、定量原理：理想的pcr反應(yīng)： x=x0*2n非理想的pcr反應(yīng)： x=x0 (1+ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) x：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 x0：初始模板量 ex：擴(kuò)增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線 6、絕對(duì)定量1）確定未知樣品的 c(t)值2）通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的c(t)值推算出其初始量 7、dna的熒光標(biāo)記

3、： 二、實(shí)時(shí)熒光定量pcr的幾種方法介紹方法一：sybr green法（一）工作原理1、sybr green 能結(jié)合到雙鏈dna的小溝部位 2、sybr green 只有和雙鏈dna結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時(shí)，dna雙鏈分開(kāi)，無(wú)熒光4、復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈dna， sybr green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。 pcr反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化: 1、sybr green 使用濃度:太高抑制taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè) 2、primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn) 3、mgcl2的濃度:可以降低到1.5mm,以減少非特異性產(chǎn)物4、反應(yīng)buffer 體系的優(yōu)化5、反應(yīng)

4、溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定 6、其他與常規(guī)pcr相同（二）應(yīng)用范圍1、起始模板的測(cè)定；2、 基因型的分析；3、 融解曲線分析：可以優(yōu)化pcr反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)pcr有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。（三）優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)dna模板沒(méi)有選擇性；適用于任何dna； 使用方便；不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針；非常靈敏； 便宜。 缺點(diǎn)：容易與非特異性雙鏈dna結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性；但可以通過(guò)融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件； 對(duì)引物特異性要求較高。方法二：taqman-水解型雜交探針 *5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(reporter, r) ，如fam、vic等 *3端標(biāo)記有

5、熒光淬滅基團(tuán) (quencher, q)* 探針完整，r所發(fā)射的熒光能量被q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， r與q分開(kāi)，發(fā)熒光*taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針（一）工作原理 注意：每擴(kuò)增一條dna分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光pcr反應(yīng)的建立：1、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針tm為68-70 ，30 bp, 5不能有g(shù)，g可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物tm為59-602、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94 ，10-20s 60，30-60s（taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度72 ，45 s，3、優(yōu)化引物和探針

6、濃度：獲得最小ct值，信號(hào)/背景比值的最大值 引物濃度：50-900nm 探針濃度：50-250nm4、其他與常規(guī)pcr相同（二）優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo);委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高;不易找到本底低的探針real-time pcr與rt-pcr比較2009-08-20 16:50:02 來(lái)源:未知 【大 中 小】 評(píng)論: 條摘要：real-time pcr與rt-pcr是兩種不同的pcr方法，適用范圍也不同。 real-time pcr中文譯作實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，是一種最新發(fā)展的定量pcr技術(shù)。該技術(shù)

7、借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)pcr產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到pcr每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò) real-time pcr與rt-pcr是兩種不同的pcr方法，適用范圍也不同。real-time pcr中文譯作“實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)”，是一種最新發(fā)展的定量pcr技術(shù)。該技術(shù)借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)pcr產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到pcr每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定ct值，從而根據(jù)ct值確定起始dna拷貝數(shù)，做到了真正意義上的dna定量，較以往常用的終點(diǎn)定量的方法更加準(zhǔn)確。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量pcr又可以分為taqman探針和sybr

8、 green i熒光染料兩種方法。real-time pcr所采用的專用pcr儀能夠自動(dòng)在每個(gè)循環(huán)的特定階段對(duì)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)的記錄熒光強(qiáng)度的改變，從而對(duì)樣品的濃度進(jìn)行精確的定量。rt-pcr是reverse transcription pcr的簡(jiǎn)稱，中文譯作“逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)”，是將rna的反轉(zhuǎn)錄（rt）和cdna的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（pcr）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從rna合成 cdna，再以cdna為模板，擴(kuò)增合成目的片段。rt-pcr技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。作為模板的rna可以是

9、總rna、mrna或體外轉(zhuǎn)錄的rna產(chǎn)物。無(wú)論使用何種rna，關(guān)鍵是確保rna中無(wú)rna酶和基因組dna的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、oligo dt 及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mrna，三種都可。但二者的基本原理是相同的，即pcr技術(shù)。rt-pcr原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)2009-08-20 16:25:05 來(lái)源:未知 【大 中 小】 評(píng)論: 條摘要：一、知識(shí)背景： 1、基因表達(dá)：dna rna protein 單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因 104個(gè)絲心蛋白mrna（每個(gè)mrna存活4d，可以合成105個(gè)絲心蛋白） 共

10、合成109個(gè)絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mrna表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的一、知識(shí)背景：1、基因表達(dá)：dna rna protein單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因 104個(gè)絲心蛋白mrna（每個(gè)mrna存活4d，可以合成105個(gè)絲心蛋白） 共合成109個(gè)絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mrna表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。 2、pcr技術(shù)(polymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于dna聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：a、變性：通過(guò)加熱使d

11、na雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈dna；b、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。c、延伸：在dna聚合酶和dntps及mg2存在下，退火引物沿5 3方向延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和rt-pcr逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于rna病毒體內(nèi)的依賴rna的dna聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴rna的dna聚合酶活性：以rna為模板合成cdna第一條鏈；2、rnase水解活性：水解rnana雜合體中的rna；3、依賴dna的dna聚合酶活性：以第一條dna鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cdna.二、rt-pcr的準(zhǔn)備：1、引物的設(shè)計(jì)及

12、其原則：1）引物的特異性決定pcr反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mrna剪切方式以及可能存在的hnrna對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2）引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括a、引物長(zhǎng)度:一般為1530bp ，引物太短會(huì)影響pcr的特異性，引物太長(zhǎng)pcr的最適延伸溫度會(huì)超過(guò)taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿

13、基。gc含量（tm值）：4060，pcr擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低tm值減去510度。c、 3端要求：3端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是a時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，g、c居中間，因此引物的3端最好選用a、g、c而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的t。d、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3端不應(yīng)超過(guò)2個(gè)。f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。g、5端無(wú)嚴(yán)格限制：5末端堿基可以游離，但最好是g或c，使pcr產(chǎn)物的

14、末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如primer5.0，oligo6.0等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置。2、耗材：實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、ep管之類事先都需經(jīng)過(guò)0.1%depc水浸泡處理，除去rna酶，防止操作過(guò)程中rna降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活depc）。3、試劑準(zhǔn)備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)depc處理并高壓的水。三、rna的提取方法：rtpcr中從細(xì)胞分離的rna的質(zhì)量至關(guān)重要，包括rna的純度和完整性。rna分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少rna酶的污染。但rna酶活性非常

15、穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性rna酶外，環(huán)境中也存在大量rna酶。因此在提取rna時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)rna酶的環(huán)境，包括去除外源性rna酶污染和抑制內(nèi)源性rna酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（depc）去除外源性rna酶，通過(guò)rna酶的阻抑蛋白rnasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性rna酶。rtpcr步驟：1、rna的提?。?2、cdna的合成：逆轉(zhuǎn)錄體系的組成： depc處理水 8ul 10mm dntps 2.5ul random primers 0.4ul rnasin 0.5ul 總rna 2.53ug70 5min速置冰水中冷卻再加：5*逆轉(zhuǎn)錄buffer 5ul

16、逆轉(zhuǎn)錄酶(m-mlv) 1ul(200u) 加水至25ul37 60min90 5min3、pcr擴(kuò)增： 50ul pcr體系的組成： 10pcrbuffer 5ul mgcl2 3ul(2.0mm) 10mmdntps 1ul sense primer 1ul(1umol/l) antisense primer 1ul(1umol/l) cdna 1.5ul depc處理水 36.7ul taq 酶 0.8ul(2.4u) 總體積 50ul 4、pcr反應(yīng)條件： 94 5min 94 1min 退火溫度 40sec 72 50sec 2 29 cycles 72 7min 4 0sec四、p

17、cr條件的優(yōu)化：pcr條件的優(yōu)化主要是引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下2 變化尋找最佳退火溫度。此外mg2濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2mm左右。引物和模板的量等。五、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定：根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長(zhǎng)度產(chǎn)物所需凝膠濃度）取適量pcr產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10v/cm電泳4560min。成像系統(tǒng)成像分析。分離不同大小dna片段的合適瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（） 線性dna片段的有效分離范圍（kb）0.5 1300.7 0.8121.0 0.5101.2 0.471.5 0.23六、需注意的問(wèn)題：

18、1、注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、溴化乙錠（eb）、酚、異硫氰酸胍、紫外線等2、注意避免試劑污染3、始終注意避免rna酶的污染：4、保管好自己專用的試劑，公用試劑保管好，相互協(xié)調(diào)，注意實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生real time pcr 跟rt-pcr有什么區(qū)別關(guān)鍵詞： real time pcr rt-pcr 區(qū)別？ 2008-07-23 00:00 來(lái)源：丁香園 點(diǎn)擊次數(shù)：4932實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。1內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即pcr到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而pcr經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔pcr儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異,因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。2實(shí)時(shí)熒光定量pcr無(wú)需內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量pcr技