第三章 分子發(fā)光分析

1、第三章第三章 分子發(fā)光分析分子發(fā)光分析 分子發(fā)光包括分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜發(fā)光和散射光譜等。等。本章主要討論本章主要討論熒光分析熒光分析。3.1 分子熒光和磷光分析分子熒光和磷光分析一、原理一、原理熒光和磷光的產(chǎn)生熒光和磷光的產(chǎn)生 室溫下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動能層。處于室溫下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動能層。處于基態(tài)的分子吸收能量基態(tài)的分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能等電能、熱能、化學(xué)能或光能等)后被后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時伴隨著光子

2、的輻射，這種現(xiàn)象稱為回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光發(fā)光”。下面從分子結(jié)構(gòu)理論來討論熒光和磷光的產(chǎn)生機(jī)理。下面從分子結(jié)構(gòu)理論來討論熒光和磷光的產(chǎn)生機(jī)理。續(xù)續(xù)每個分子具有一每個分子具有一系列嚴(yán)格分立的系列嚴(yán)格分立的能級、稱為電子能級、稱為電子能級，而每個電能級，而每個電子能級中又包含子能級中又包含一系列的振動能一系列的振動能層和轉(zhuǎn)動能層。層和轉(zhuǎn)動能層。示意于右圖。示意于右圖。圖圖中基態(tài)用中基態(tài)用S0表示表示，第一電子激發(fā)，第一電子激發(fā)單重態(tài)和第二電單重態(tài)和第二電子激發(fā)單重態(tài)分子激發(fā)單重態(tài)分別用別用S1、S2表示表示，第一電子激發(fā)，第一電子激發(fā)三重態(tài)和第二電三重態(tài)和第二電子激發(fā)三重態(tài)

3、分子激發(fā)三重態(tài)分別用別用T1，T2表示表示。0、1、2、3表示基態(tài)和激表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能層發(fā)態(tài)的振動能層。 S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨系間跨越越內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫振動弛豫能能量量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫振動弛豫熒光：熒光：10-710 -9 s；磷光：；磷光：10-4 100 s續(xù)續(xù) 電子激發(fā)態(tài)的多重度用電子激發(fā)態(tài)的多重度用M=2S+1 表示表示, S 為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和。為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和。其數(shù)值為其數(shù)值為0或或1。根據(jù)。根據(jù)Pauli不相容原理，分子中同一軌道所占據(jù)的兩個電子不相容原理，分子中同一

4、軌道所占據(jù)的兩個電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對。假如分子中全部軌道里的電子都必須具有相反的自旋方向，即自旋配對。假如分子中全部軌道里的電子都是自旋配對的。即是自旋配對的。即 S=0，分子的多重度，分子的多重度 M=1，該分子體系便處于單重態(tài)，該分子體系便處于單重態(tài)，用符號用符號S表示。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是處于單重態(tài)的。分子吸收能量后，表示。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是處于單重態(tài)的。分子吸收能量后，若電子在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的變化，這時分于處于激發(fā)的單重態(tài)，若電子在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的變化，這時分于處于激發(fā)的單重態(tài)，如上圖中的如上圖中的 Sl 和和 S2。如果電子在躍遷過程中

5、還伴隨著自旋方向的改變，這。如果電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，這時分子使具有兩個自旋不配對的電子，即時分子使具有兩個自旋不配對的電子，即 S=1，分子的多重度，分子的多重度M=3，分子處，分子處于激發(fā)的三重態(tài)于激發(fā)的三重態(tài), 用符號用符號T表示。處于分立軌道上的非成對電子，平行自旋表示。處于分立軌道上的非成對電子，平行自旋要比成對自旋更穩(wěn)定些要比成對自旋更穩(wěn)定些(洪特規(guī)則洪特規(guī)則)，因此三重態(tài)能級總是比相應(yīng)的單重態(tài)能，因此三重態(tài)能級總是比相應(yīng)的單重態(tài)能級略低，如上圖中的級略低，如上圖中的T1和和T2。 處在激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷等處在激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)

6、定的，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過程返回基態(tài)，其中以速度最快，激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢。去活化過程返回基態(tài)，其中以速度最快，激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢。有以下幾種基本的去活化過程。有以下幾種基本的去活化過程。激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷射躍遷(發(fā)光發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量。和無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光延遲熒光延遲熒光磷光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動弛豫振動弛豫無輻射躍遷無輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時間短、

7、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；熒光：熒光：10 -710 -9 s, 第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；基態(tài)；磷光：磷光：10 -410 s； 第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)基態(tài).非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程振動弛豫振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換： 同多重度電子能級中同

8、多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。通過等能級間的無輻射能級交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換： 激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。系間跨越系間跨越：不同多重態(tài)：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦

9、合進(jìn)行。軌道耦合進(jìn)行。輻射能量傳遞過程輻射能量傳遞過程電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（基態(tài)（T1 S0躍遷躍遷）；電子由電子由S0進(jìn)入進(jìn)入T1的可能過程：（的可能過程：（ S0 T1禁阻躍遷）。禁阻躍遷）。S0 激發(fā)激發(fā)振動弛豫振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動弛豫振動弛豫 T1。發(fā)發(fā)光速度很慢：光速度很慢： 10-4100 s 。光照停止后，可持續(xù)一段時間。光照停止后，可持續(xù)一段時間。熒光發(fā)射熒光發(fā)射電子由第一激發(fā)單重態(tài)的電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級最低振動能級基態(tài)基態(tài)（ 多為多為 S1 S0 躍遷躍遷），），發(fā)射波長為發(fā)射波長為 2 的

10、熒光；的熒光； 10-710-9 s 。發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長； 2 2 1 ；磷光發(fā)射磷光發(fā)射二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 1. 激發(fā)光譜激發(fā)光譜熒光和磷光都是光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長，熒光和磷光都是光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長，這可從它們的激發(fā)光譜曲線來確定。繪制激發(fā)光譜曲線時，選這可從它們的激發(fā)光譜曲線來確定。繪制激發(fā)光譜曲線時，選擇熒光擇熒光(磷光磷光)的最大發(fā)射波長為測量波長。改變激發(fā)光的波長，的最大發(fā)射波長為測量波長。改變激發(fā)光的波長，測量熒光強(qiáng)度的變化。以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)

11、度為縱測量熒光強(qiáng)度的變化。以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即得到熒光坐標(biāo)作圖，即得到熒光(磷光磷光)化合物的激發(fā)光譜?；衔锏募ぐl(fā)光譜。 任何熒光（磷光）化合物都具有兩個特征光譜：任何熒光（磷光）化合物都具有兩個特征光譜：激發(fā)光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜譜和發(fā)射光譜。他們是定性和定量分析的基本參數(shù)和依據(jù)。他們是定性和定量分析的基本參數(shù)和依據(jù)。2. 發(fā)射光譜發(fā)射光譜簡稱熒簡稱熒(磷磷)光光譜光光譜。如果將激發(fā)光波長固定在最大激發(fā)波長處，然。如果將激發(fā)光波長固定在最大激發(fā)波長處，然后掃描發(fā)射波長，測定不同發(fā)射波長處的熒后掃描發(fā)射波長，測定不同發(fā)射波長處的熒(磷磷)光強(qiáng)度，即得到熒光強(qiáng)度，即得到

12、熒(磷磷)光發(fā)射光譜。光發(fā)射光譜。下圖為萘的激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜和磷光發(fā)射下圖為萘的激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜和磷光發(fā)射光譜。光譜。 stokes 位移位移。在溶液中，分子熒光。在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長，稱為長，稱為Stokes位移。這是由于受激位移。這是由于受激分子通過振動弛豫而失去振動能，分子通過振動弛豫而失去振動能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失。因此的碰撞，也會有能量的損失。因此在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。 3. 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光

13、譜與發(fā)射光譜的關(guān)系(1) Stokes位移位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗振動弛豫消耗了能量。了能量。(2) 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量能級，吸收不同波長的能量(如能級圖如能級圖 2, 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光生波長一定的熒光(如如 2)。 (3) 鏡像

14、規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。 鏡像規(guī)則的解釋鏡像規(guī)則的解釋 基態(tài)上的各振基態(tài)上的各振動能級分布與第動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類振動能級分布類似似. 基態(tài)上的零振基態(tài)上的零振動能級與第一激動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾級之間的躍遷幾率最大，相反躍率最大，相反躍遷也然遷也然。200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲

15、的乙醇溶液熒（磷）光光譜三、溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度三、溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度1. 熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系發(fā)射的熒光光強(qiáng)發(fā)射的熒光光強(qiáng) If 正比于該系統(tǒng)正比于該系統(tǒng)吸收的激發(fā)光的光強(qiáng)，即吸收的激發(fā)光的光強(qiáng)，即.3!lc)(-2.32!lc)(2.3-lc2.3-1e32lc2.3-根據(jù)比爾定律：根據(jù)比爾定律：If = I a式中式中是摩爾吸光系數(shù)，是摩爾吸光系數(shù)，l是樣品池的光程，是樣品池的光程，c是樣品濃度。而式中是樣品濃度。而式中I a = I0 It= I0 (1-10-lc)If = I0 (1-10-lc) = I0 (1-e-2.3lc)式中式中I0

16、是入射光強(qiáng)度，是入射光強(qiáng)度，It 是透過光強(qiáng)度。是透過光強(qiáng)度。將此式代入上式得將此式代入上式得當(dāng)當(dāng)lc0.05 時，可省略第二項(xiàng)后時，可省略第二項(xiàng)后的各項(xiàng)，則的各項(xiàng)，則lc2.3-1elc-2.3續(xù)續(xù)當(dāng)入射光強(qiáng)與當(dāng)入射光強(qiáng)與I0與與l一定，上式可簡寫為一定，上式可簡寫為If = 2.3I0lc即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，但這種線性關(guān)系只有即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液的溶液中，當(dāng)在極稀的溶液的溶液中，當(dāng)lc0.05 lc0.05 時才成立。時才成立。對于較濃對于較濃的溶液，由于淬滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度與濃度的溶液，由于淬滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使

17、熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系。不呈線性關(guān)系。If = Kc四、影響熒光強(qiáng)度的因素四、影響熒光強(qiáng)度的因素1.熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：（1）分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才）分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光；能吸收激發(fā)光；（2）吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有）吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率 () 也稱熒光效也稱熒光效率或量子效率率或量子效率, 它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，通常用下它表示物質(zhì)發(fā)射

18、熒光的能力，通常用下式表示式表示. 吸收的光量子數(shù)吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)分子結(jié)構(gòu)影響熒光強(qiáng)度分子結(jié)構(gòu)影響熒光強(qiáng)度(a) 躍遷類型躍遷類型(b) 共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)(c) 剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)(d) 取代基效應(yīng)取代基效應(yīng)續(xù)續(xù)(a) 躍遷類型躍遷類型 實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)熒光化合物都是由實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)熒光化合物都是由* 或或n* 躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫或其他無輻射躍遷，躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生再發(fā)生*或或*n躍遷而產(chǎn)生熒光，其中躍遷而產(chǎn)生熒光，其中*躍躍遷的量子效率較高。遷的量子效率較高。(b) 共軛效應(yīng)共軛效應(yīng) 含有含有*躍遷能級的芳香族化合物的

19、熒光最強(qiáng)。這躍遷能級的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)。這種體系中的種體系中的電子共軛度越大，電子共軛度越大，電子非定域性越大，電子非定域性越大，越易被激發(fā)，熒光也就越易發(fā)生，而且熒光光譜將越易被激發(fā)，熒光也就越易發(fā)生，而且熒光光譜將向長波移動。所以絕大多數(shù)能發(fā)生熒光的物質(zhì)含有向長波移動。所以絕大多數(shù)能發(fā)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)；除少數(shù)高共軛體系外，能發(fā)生熒光芳香環(huán)或雜環(huán)；除少數(shù)高共軛體系外，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。任何有利于提高的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。任何有利于提高電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高熒光效率，并使電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高熒光效率，并使熒光波長向長波方向移動。熒光

20、波長向長波方向移動。續(xù)續(xù)(c) 剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子具有強(qiáng)烈實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子具有強(qiáng)烈的熒光因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動，使的熒光因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用減小，也分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用減小，也就減少了碰撞去活的可能性。就減少了碰撞去活的可能性。 比較熒光素和酚酞的結(jié)構(gòu)比較熒光素和酚酞的結(jié)構(gòu)。熒光素在溶液中有很強(qiáng)的熒光，熒光素在溶液中有很強(qiáng)的熒光，而酚酞卻沒有。這主要是熒光而酚酞卻沒有。這主要是熒光素分子中的氧橋使其具有剛性素分子中的氧橋使其具有剛性平面結(jié)構(gòu)。又如芴和聯(lián)苯在同平面結(jié)構(gòu)

21、。又如芴和聯(lián)苯在同樣條件下其量子效率分別為樣條件下其量子效率分別為1利利0.18，芴中的亞甲基使分子的，芴中的亞甲基使分子的剛性增加，導(dǎo)致兩者在熒光性剛性增加，導(dǎo)致兩者在熒光性質(zhì)上顯著的差別。質(zhì)上顯著的差別。續(xù)續(xù)(d) 取代基效應(yīng)取代基效應(yīng) 芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對該化合的的熒光芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對該化合的的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有很大的影響。強(qiáng)度和熒光光譜有很大的影響。一般說來，給電子基團(tuán)，一般說來，給電子基團(tuán)，如如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等，使熒光增強(qiáng)。等，使熒光增強(qiáng)。因?yàn)橐驗(yàn)楫a(chǎn)生了產(chǎn)生了p - 共扼作用共扼作用, 增強(qiáng)了增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)電子

22、共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。而吸電子基團(tuán)，如而吸電子基團(tuán)，如-COOH、-C=O、 -NO2、-NO、鹵素離子等，會減弱甚至、鹵素離子等，會減弱甚至?xí)銣鐭晒?。如硝基苯為非熒光物質(zhì)會淬滅熒光。如硝基苯為非熒光物質(zhì), 而苯酚、苯胺的熒光而苯酚、苯胺的熒光較苯強(qiáng)。較苯強(qiáng)。 2.2.溶劑對熒光強(qiáng)度的影響溶劑對熒光強(qiáng)度的影響溶劑的影響可分為溶劑的影響可分為一般溶劑效應(yīng)：一般溶劑效應(yīng)：指的是溶劑的折指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響。射率和介電常數(shù)的影響。有的情況下，增大溶劑的有的情況下，增大溶劑的極性，熒光增強(qiáng)，熒光峰紅移。極性，熒光增強(qiáng)，熒光峰

23、紅移。8-巰基喹啉在四氯化巰基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四種不同的極性溶劑中的情碳、氯仿、丙酮和乙腈四種不同的極性溶劑中的情況就是一例（見下表）。況就是一例（見下表）。續(xù)續(xù)8-8-巰基喹啉的熒光峰的位置和熒光效率與溶劑巰基喹啉的熒光峰的位置和熒光效率與溶劑介電常數(shù)的關(guān)系介電常數(shù)的關(guān)系但也有相反的情況。但也有相反的情況。例如苯氨萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、例如苯氨萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五種醇中，隨著醇的極性增大，熒光強(qiáng)度減丙醇、乙醇和甲醇五種醇中，隨著醇的極性增大，熒光強(qiáng)度減小，熒光峰藍(lán)移。小，熒光峰藍(lán)移。因此，熒光光譜的位置和強(qiáng)度與溶劑極性之因此，熒光光譜的位置和強(qiáng)

24、度與溶劑極性之間的關(guān)系，要看各種物質(zhì)與溶劑的不同而異。間的關(guān)系，要看各種物質(zhì)與溶劑的不同而異。例：芘的熒光發(fā)射光譜例：芘的熒光發(fā)射光譜激發(fā)波長激發(fā)波長334nm。芘的熒光發(fā)射光譜依次在芘的熒光發(fā)射光譜依次在373 nm、379 nm、384 nm、390 nm 和和410 nm 附近出現(xiàn)五重發(fā)射峰。其中附近出現(xiàn)五重發(fā)射峰。其中, 第一發(fā)射峰與第三發(fā)射第一發(fā)射峰與第三發(fā)射峰強(qiáng)度比峰強(qiáng)度比(I1/I3 )會隨著溶液極性的減小而下降。會隨著溶液極性的減小而下降。因此因此, I1/I3常用來表征其常用來表征其所處環(huán)境極性的大小所處環(huán)境極性的大小, 其值越大表明芘探針?biāo)幬h(huán)境的極性越大其值越大表明芘探

25、針?biāo)幬h(huán)境的極性越大; 反反之之, 若若I1/I3越小則表明芘探針?biāo)幬h(huán)境的極性越小。越小則表明芘探針?biāo)幬h(huán)境的極性越小。(a) 芘在水溶液中的熒光譜芘在水溶液中的熒光譜 (b)在甜菜堿溶液中的熒光譜在甜菜堿溶液中的熒光譜3. 溫度對熒光強(qiáng)度的影響溫度對熒光強(qiáng)度的影響溫度對熒光強(qiáng)度的影響較敏感，因此熒光分析時一溫度對熒光強(qiáng)度的影響較敏感，因此熒光分析時一定要控制好溫度。溫度上升使熒光強(qiáng)度下降。定要控制好溫度。溫度上升使熒光強(qiáng)度下降。主要的原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用。主要的原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)激發(fā)分子當(dāng)激發(fā)分子接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)換為接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能

26、轉(zhuǎn)換為基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。失振動能量。另一個原因是溶液溫度下降時，另一個原因是溶液溫度下降時，介質(zhì)的粘度增大，熒介質(zhì)的粘度增大，熒光物質(zhì)與溶劑分子碰撞也隨之減少。相反，光物質(zhì)與溶劑分子碰撞也隨之減少。相反，隨著溫度上升，碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換隨著溫度上升，碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。的去活幾率增加。4. 溶液溶液pH值對熒光強(qiáng)度的影響值對熒光強(qiáng)度的影響帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液的般都與溶液的pH有關(guān)。因此在熒光分析中要嚴(yán)格控制溶有關(guān)。因此在熒

27、光分析中要嚴(yán)格控制溶液的液的pH值。值。 OHO-OH -H+有熒光pH1無熒光 pH1.3OHO-有 熒 光無 熒 光例例Chunxue Yuan, Shohei Saito,Cristopher Camacho, Stephan Irle, Ichiro Hisaki, and Shigehiro Yamaguchi. A -Conjugated System with Flexibility and Rigidity That Shows Environment-Dependent RGB Luminescence. Journal of the American Chemical So

28、ciety. 2013, 135, 88428845(Received: April 27, 2013. Published: May 30, 2013)Anthraceneimide蒽酰亞胺蒽酰亞胺+cyclooctatetraene環(huán)辛四烯環(huán)辛四烯Conformational change of with flexible and rigid scaffolds, which perturbs the -conjugation.續(xù)環(huán)境的環(huán)境的影響影響(a) RGB(red, green and blue) emissions of 1 in PMMA(聚聚甲基丙烯酸酯甲基丙烯酸酯) mat

29、rix (blue), in CH2Cl2 solution (green), and in the crystalline state (red). Photographs under a 365 nm ultraviolet lamp irradiation. (b) The corresponding three luminescence spectra of 1 in the visible region. ex = 350, 350, and 450 nm for blue, green, and red emission spectra, respectively. The sam

30、e red emission band was observed even when ex = 350 nm.(a) Temperature-dependent fluorescence spectra of 1 in MTHF(2-MTHF(2-甲基四氫呋喃甲基四氫呋喃) from 163 K (solution) to 77 K (glass). ex = 350 nm. (b) Calculated potential energy diagram for the S0 and S1 states of 1 (see Figure 1) with fixed bent angle . T

31、he constrained geometry optimization was performed in the S1 state at the PBE0/def-SV(P) level.溫度的溫度的影響影響五、溶液熒光的淬滅五、溶液熒光的淬滅 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光淬滅熒光淬滅。能引起熒光。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為淬滅劑。熒光淬滅的形式很多，強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為淬滅劑。熒光淬滅的形式很多，機(jī)理也較復(fù)雜。機(jī)理也較復(fù)雜。Q 淬滅劑淬滅劑3.2 熒光分析儀熒光分析儀一、

32、基本結(jié)構(gòu)一、基本結(jié)構(gòu)熒光分析儀基本熒光分析儀基本部件示意圖部件示意圖 續(xù)續(xù)(1) 激發(fā)光源激發(fā)光源 在紫外在紫外可見區(qū)范圍，常用的光源是氙燈和高可見區(qū)范圍，常用的光源是氙燈和高壓汞燈。壓汞燈。(2) 樣樣 品品 池池 熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長方形為宜。用石英，形狀以方形和長方形為宜。(3) 單單 色色 器器 較精密的熒光分光光度計(jì)均采用光柵，有兩個較精密的熒光分光光度計(jì)均采用光柵，有兩個：第一單色器用于選擇激發(fā)波長；第二單色：第一單色器用于選擇激發(fā)波長；第二單色器用于分離出熒光發(fā)射波長。器用于分離出熒光發(fā)射波長。(4

33、) 檢檢 測測 器器 熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此要求檢測器具有熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此要求檢測器具有較高的靈敏度或光電倍增管作檢測器，并與激較高的靈敏度或光電倍增管作檢測器，并與激發(fā)光成直角。發(fā)光成直角。二、熒光分光光度計(jì)二、熒光分光光度計(jì) RF-5301PC型型 適合高靈敏度、高分辨率測定。適合高靈敏度、高分辨率測定。提供的數(shù)據(jù)處理、顯示功能。提供的數(shù)據(jù)處理、顯示功能。測定范圍測定范圍 220750nm及白色及白色光光帶寬帶寬 1.5，3，5，10，15，20nm靈敏度靈敏度 S/N比比150以上（帶寬以上（帶寬5nm、水拉曼峰時）、水拉曼峰時）測定方式測定方式 熒光、激勵、同期熒光、激勵

34、、同期光譜測定、定量測定、時間過程光譜測定、定量測定、時間過程測定測定日立日立F-4500儀器光路圖儀器光路圖四四. .可獲得三維光譜圖的儀器可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒(磷磷)光光譜圖光光譜圖3.3 分子熒光分析法及其應(yīng)用分子熒光分析法及其應(yīng)用1. 定量測定方法定量測定方法 由于自身發(fā)射熒光的化合物為數(shù)不多，由于自身發(fā)射熒光的化合物為數(shù)不多，因此往往利用有機(jī)試劑與熒光較弱或不顯因此往往利用有機(jī)試劑與熒光較弱或不顯熒光的物質(zhì)共價或非共價結(jié)合形成發(fā)熒光熒光的物質(zhì)共價或非共價結(jié)合形成發(fā)熒光的配合物來進(jìn)行測定。很多無機(jī)陽離子的的配

35、合物來進(jìn)行測定。很多無機(jī)陽離子的測定都用此法。測定都用此法。（i) 校準(zhǔn)曲線法校準(zhǔn)曲線法 熒光分析一般多采用校準(zhǔn)曲線法，即用已知量熒光分析一般多采用校準(zhǔn)曲線法，即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣一樣的處理后，配成一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣一樣的處理后，配成一系列標(biāo)淮溶液，在一定的儀器條件下測定這些系列標(biāo)淮溶液，在一定的儀器條件下測定這些溶液的熒光強(qiáng)度，作出校準(zhǔn)曲線。然后在同樣溶液的熒光強(qiáng)度，作出校準(zhǔn)曲線。然后在同樣的儀器條件下，測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，從的儀器條件下，測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，從校準(zhǔn)曲線上查出它們的濃度。校準(zhǔn)曲線上查出它們的濃度。(ii) 比比 較較 法法 如果已知某測定物質(zhì)的熒光校準(zhǔn)曲

36、線的濃度線如果已知某測定物質(zhì)的熒光校準(zhǔn)曲線的濃度線性范圍，取已知量的熒光物質(zhì)性范圍，取已知量的熒光物質(zhì)( (此量在校準(zhǔn)曲線此量在校準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)的線性范圍之內(nèi)) )配成一標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其熒光配成一標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其熒光強(qiáng)度。然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度。然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，由準(zhǔn)溶液的濃度和兩個溶液的熒光強(qiáng)度強(qiáng)度，由準(zhǔn)溶液的濃度和兩個溶液的熒光強(qiáng)度的比值，求得試樣中熒光物質(zhì)的含量。的比值，求得試樣中熒光物質(zhì)的含量。實(shí)例實(shí)例: : 稀土離子絡(luò)合物熒光探針測量膽紅素及其稀土離子絡(luò)合物熒光探針測量膽紅素及其熒光猝滅機(jī)理研究熒光猝滅機(jī)理研究邊 瑋 瑋邊 瑋 瑋 , ,

37、張 娜張 娜 , , 閻 芳閻 芳 , , 王 守 訓(xùn)王 守 訓(xùn) , , 李 耀 輝李 耀 輝 . . 分 析 化分 析 化學(xué)學(xué).2010,38 :1501 .2010,38 :1501 15041504摘要在摘要在NH4Ac-HAc 緩沖溶液緩沖溶液( pH 6.90) 中，強(qiáng)力霉素可以和銪離中，強(qiáng)力霉素可以和銪離子子( Eu3+) 生成二元絡(luò)合物，能量從強(qiáng)力霉素轉(zhuǎn)移到生成二元絡(luò)合物，能量從強(qiáng)力霉素轉(zhuǎn)移到Eu3+，發(fā)射出，發(fā)射出Eu3+ 位于位于612 nm 處的特征熒光。加入膽紅素后，強(qiáng)力霉素將能處的特征熒光。加入膽紅素后，強(qiáng)力霉素將能量轉(zhuǎn)移給膽紅素。因此，量轉(zhuǎn)移給膽紅素。因此，Eu3+

38、位于位于612 nm 處的特征熒光強(qiáng)度降處的特征熒光強(qiáng)度降低，且降低的熒光強(qiáng)度與加入膽紅素的濃度成正比，據(jù)此建立了低，且降低的熒光強(qiáng)度與加入膽紅素的濃度成正比，據(jù)此建立了熒光光度法測量膽紅素的方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測量的線性熒光光度法測量膽紅素的方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測量的線性范圍為范圍為5.0 10 - 8 3.0 10 - 5mol /L; 檢出限為檢出限為8.4 10- 9mol /L。本方法操作簡單，可以較好地避免共存物質(zhì)的干擾，并成功。本方法操作簡單，可以較好地避免共存物質(zhì)的干擾，并成功用于人血清樣品中膽紅素含量的測定。用于人血清樣品中膽紅素含量的測定。測量原理測量原理本實(shí)驗(yàn)選擇

39、強(qiáng)力霉素作為本實(shí)驗(yàn)選擇強(qiáng)力霉素作為Eu3+ 的配體，所形成的二元絡(luò)合物能夠發(fā)的配體，所形成的二元絡(luò)合物能夠發(fā)射出射出Eu3+ 位于位于612 nm 的特征熒光。實(shí)驗(yàn)表明，加入膽紅素能夠顯的特征熒光。實(shí)驗(yàn)表明，加入膽紅素能夠顯著降低著降低Eu3+位于位于612 nm 處的特征峰，并且熒光強(qiáng)度的降低值與加入處的特征峰，并且熒光強(qiáng)度的降低值與加入的膽紅素的濃度成正比，據(jù)此建立了測量人血清中膽紅素的熒光分的膽紅素的濃度成正比，據(jù)此建立了測量人血清中膽紅素的熒光分析方法。本方法可以在室溫下操作。應(yīng)用本方法測量人血清實(shí)際樣析方法。本方法可以在室溫下操作。應(yīng)用本方法測量人血清實(shí)際樣品中膽紅素含量，并討論了體

40、系熒光猝滅的機(jī)理。品中膽紅素含量，并討論了體系熒光猝滅的機(jī)理。膽紅素膽紅素強(qiáng)力霉素強(qiáng)力霉素2 實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分2 1 儀器與試劑儀器與試劑RF-540 型熒光分光光度計(jì)、型熒光分光光度計(jì)、UV-265 型紫外型紫外-可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)( 日本島津公司日本島津公司) ; PHS-3B 型酸型酸度計(jì)度計(jì)( 上海雷磁儀器廠上海雷磁儀器廠) 。膽紅素膽紅素( BR，上海衛(wèi)輝化學(xué)試劑廠，上海衛(wèi)輝化學(xué)試劑廠) 儲備液儲備液: 準(zhǔn)確稱取適量準(zhǔn)確稱取適量BR，以石英亞沸蒸餾水溶解，使，以石英亞沸蒸餾水溶解，使用前以石英亞沸蒸餾水稀釋得工作液用前以石英亞沸蒸餾水稀釋得工作液( 1.0 10-5 mol

41、 /L) ; 強(qiáng)力霉素強(qiáng)力霉素( DC，中國藥品生物制，中國藥品生物制品檢定所品檢定所) 儲備液儲備液: 準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取0.1918 g 強(qiáng)力霉素，以石英亞沸蒸餾水溶解并定容至強(qiáng)力霉素，以石英亞沸蒸餾水溶解并定容至500 mL，得得6.0 10-3 mol /L 的儲備液，使用時以石英亞沸蒸餾水稀釋得工作液的儲備液，使用時以石英亞沸蒸餾水稀釋得工作液( 6.0 10-4mol /L) ; Eu3+ 儲備液儲備液: 準(zhǔn)確稱取適量準(zhǔn)確稱取適量Eu2O3( 99. 99%，上海躍龍有色金屬有限公司，上海躍龍有色金屬有限公司) ，加入少量濃，加入少量濃HCl，加熱使其溶解，并揮發(fā)至近干，然后用，加熱

42、使其溶解，并揮發(fā)至近干，然后用0 1 mol /L HCl 稀釋至稀釋至100 mL，作為儲備液，作為儲備液，使用時以石英亞沸蒸餾水逐級稀釋至使用時以石英亞沸蒸餾水逐級稀釋至5. 0 10 -4mol /L; 0.10 mol /L NH4Ac-HAc( pH 6. 90) 緩沖溶液。以上儲備液與工作液均需置于緩沖溶液。以上儲備液與工作液均需置于0 4 的生化培養(yǎng)箱內(nèi)保存。的生化培養(yǎng)箱內(nèi)保存。2. 2 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2. 2. 1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 在在10 mL 比色管中依次加入比色管中依次加入2 0 mL 0 10 mol /L NH4Ac-HAc 緩沖液緩沖液( pH 6. 9

43、0) 、1. 0 mL 5. 0 10-4 mol /L Eu3+ 溶液、溶液、0.5 mL 6.0 10-5 mol /L DC(強(qiáng)力霉素強(qiáng)力霉素) 溶液和溶液和2.0 mL 1. 0 10-5 mol /L BR 溶液，以溶液，以石英亞沸蒸餾水定容至刻度，在室溫放置石英亞沸蒸餾水定容至刻度，在室溫放置20 min 后測量吸收光譜和熒光光譜。后測量吸收光譜和熒光光譜。在在ex /em =385 /612 nm 處，測定其熒光強(qiáng)度處，測定其熒光強(qiáng)度F，同時測定其試劑空白，同時測定其試劑空白( 緩沖緩沖液液-DC-Eu3+) 的熒光強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度F0，加入，加入BR 后使后使Eu3+-DC 體系

44、熒光強(qiáng)度的減小值表體系熒光強(qiáng)度的減小值表示為示為F = F0 - F。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行人血清中痕量膽紅素的含量測定。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行人血清中痕量膽紅素的含量測定。2.2.2 人血清樣品的處理方法人血清樣品的處理方法 按文獻(xiàn)按文獻(xiàn)3對血清進(jìn)行預(yù)處理對血清進(jìn)行預(yù)處理: 取血清取血清1.0 mL，加入乙腈加入乙腈2 mL，攪拌，以，攪拌，以4000 r /min 離心離心20 min，取上層清液至分液漏斗中，取上層清液至分液漏斗中，加入氯仿加入氯仿4 mL，用，用HCl 調(diào)至調(diào)至pH 1 2，振蕩，靜置，取下層溶液于另一分液，振蕩，靜置，取下層溶液于另一分液漏斗中，用漏斗中，用NaOH 調(diào)至調(diào)至

45、pH 12 13，振蕩，靜置，取上層清液，加，振蕩，靜置，取上層清液，加0.1 mol /L NH4Ac-HAc 緩沖溶液緩沖溶液( pH 6.90) 2 mL，用，用HCl 調(diào)至調(diào)至pH 6 7，定容至，定容至10.0 mL，待測。，待測。3 3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論3.1 熒光光譜和吸收光譜熒光光譜和吸收光譜DC-Eu3+ 以及加入不同體積以及加入不同體積BR 的的DC-Eu3+-BR 體系的熒光光譜體系的熒光光譜見圖見圖1。由圖。由圖1 可見，可見， DC-Eu3+ ( 曲線曲線1) 在在590和和612 nm 出現(xiàn)兩出現(xiàn)兩個個Eu3+的特征峰，分別對應(yīng)于的特征峰，分別對應(yīng)于Eu3+ 的

46、的5D07F1和和5D07F2躍遷，躍遷，這表明能量從配體這表明能量從配體DC 有效地轉(zhuǎn)有效地轉(zhuǎn)移到了移到了Eu3+。DC-Eu3+-BR 的熒的熒光光譜光光譜( 曲線曲線2 4) 和和DC-Eu3+的熒光光譜形狀相似，但在的熒光光譜形狀相似，但在DC-Eu3+-BR 體系中，加入不同量的體系中，加入不同量的BR，Eu3+在在612 nm 的特征熒光的特征熒光強(qiáng)度發(fā)生規(guī)律性降低。強(qiáng)度發(fā)生規(guī)律性降低。圖圖1 DC-Eu3+ 體系以及加入不同體積體系以及加入不同體積BR 的的DC-Eu3+ -BR 體系的熒光光譜體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of differ

47、ent mixture1. Doxycycline(DC)-Eu3+; 2. Eu3+-DC-Bilirubin(BR) ( BR: 0.5 mL ) ; 3. Eu3+-DC-BR ( BR:1.0 mL) ; 4. Eu3+-DC-BR (BR: 1.5 mL)3.2 酸度的影響酸度的影響 酸度對體系的熒光強(qiáng)度有很大的影酸度對體系的熒光強(qiáng)度有很大的影響響(見圖見圖3)。由圖。由圖3可見，在可見，在pH 6.0 8.0 之間，體系的之間，體系的F 先增大后降低。先增大后降低。當(dāng)當(dāng)pH = 6.8 7.0 時，體系的時，體系的F 值達(dá)值達(dá)到最大且基本保持不變，故本研究選到最大且基本保持不變，故

48、本研究選擇擇pH 6.90 的的0.1 mol /L NH4Ac-HAc 為為緩沖體系。同時考察了緩沖溶液用量緩沖體系。同時考察了緩沖溶液用量的影響，當(dāng)緩沖溶液加入量在的影響，當(dāng)緩沖溶液加入量在1.5 2.5 mL 時，時，F(xiàn) 基本保持穩(wěn)定且熒光強(qiáng)基本保持穩(wěn)定且熒光強(qiáng)度最大，故本研究中緩沖溶液加入量度最大，故本研究中緩沖溶液加入量選擇為選擇為2. 0 mL。3. 3 Eu3+ 濃度與強(qiáng)力霉素濃度比值的影響濃度與強(qiáng)力霉素濃度比值的影響3.6 線性范圍和檢出限線性范圍和檢出限3.7 血清中血清中BR 的測定的測定3. 4 反應(yīng)時間和加入順序的影響反應(yīng)時間和加入順序的影響3.5 共存物質(zhì)的影響共存物

49、質(zhì)的影響在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了人體中常見的在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了人體中常見的金屬離子和氨基酸類等共存物質(zhì)對檢測金屬離子和氨基酸類等共存物質(zhì)對檢測2 0 10 - 5mol /L膽紅素的影響。在相膽紅素的影響。在相對誤差在對誤差在 5%范圍內(nèi)時，范圍內(nèi)時，Cu2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、Ca2+、Zn2+、鳥嘌呤、腺嘌、鳥嘌呤、腺嘌呤、呤、L-組氨酸、組氨酸、L-胱氨酸、胱氨酸、L-亮氨酸、亮氨酸、L-賴氨酸、谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、蛋氨賴氨酸、谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、蛋氨酸等物質(zhì)不影響測定。酸等物質(zhì)不影響測定。測定結(jié)果測定結(jié)果熒光分析法的特點(diǎn)熒光分析法的特點(diǎn)(i)靈敏度高靈敏度高

50、與紫外與紫外可見分光光度法比較，熒光是從人射光的直角可見分光光度法比較，熒光是從人射光的直角方向檢測，即在黑背景下檢測熒光的發(fā)射。所以一般來說，熒光分方向檢測，即在黑背景下檢測熒光的發(fā)射。所以一般來說，熒光分析的靈敏度要比紫外析的靈敏度要比紫外可見分光光度法高可見分光光度法高24個數(shù)量級，它的測定個數(shù)量級，它的測定下限在下限在0.10.001ug.cm-3之間。之間。(ii) 選擇性強(qiáng)選擇性強(qiáng) 熒光法既能依據(jù)特征發(fā)射，又能依據(jù)特征吸收來鑒定物熒光法既能依據(jù)特征發(fā)射，又能依據(jù)特征吸收來鑒定物質(zhì)。假如某幾個物質(zhì)的發(fā)射光譜相似，可以從激發(fā)光譜的差異把它質(zhì)。假如某幾個物質(zhì)的發(fā)射光譜相似，可以從激發(fā)光譜

51、的差異把它們區(qū)分開來；而如果它們的吸收光譜相同，則可用發(fā)射光譜將其區(qū)們區(qū)分開來；而如果它們的吸收光譜相同，則可用發(fā)射光譜將其區(qū)分。分。(iii) 試樣量少和方法簡便試樣量少和方法簡便。(iv) 提供比較多的物理參數(shù)提供比較多的物理參數(shù) 熒光分析法能提供包括熒光分析法能提供包括激發(fā)光譜和發(fā)射光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、熒光效率、熒光壽命譜以及熒光強(qiáng)度、熒光效率、熒光壽命等許多物理參數(shù)。這些參數(shù)等許多物理參數(shù)。這些參數(shù)反映了分子的各種特性，能從不同角度提供被研究的分子的信息。反映了分子的各種特性，能從不同角度提供被研究的分子的信息。某些有機(jī)物的熒光測定某些有機(jī)物的熒光測定氨基酸和他們的熒光特性氨基酸和他們的熒光特性 氨基酸氨基酸方法方法激發(fā)波長激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長發(fā)射波長(nm)靈敏度靈敏度(ug/mL)色氨酸色氨酸直接測定直接測定pH112873480.003酪氨酸酪氨酸直接測定直接測定pH72803100.01苯丙氨酸苯丙氨酸直接測定直接測定H2O2602820.1精氨酸精氨酸印三酮法印三酮法305，3904950.3組氨酸組氨酸鄰苯二醛法鄰苯二醛法3404800.01酪氨酸酪氨酸-硝基硝基-萘酚法萘酚