蛋白質(zhì)、多肽的氨基酸組成及序列分析

1、第十章 蛋白質(zhì)、多肽的氨基酸組成及序列分析氨基酸是組成肽和蛋白質(zhì)的基本單位,也是生物體維持生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們參與機(jī)體的代謝過(guò)程，具有廣泛的生物活性和特殊的生理功能。在對(duì)肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究時(shí)，往往需要將其進(jìn)行完全水解，測(cè)定其氨基酸的組成；生物體內(nèi)游離氨基酸在神經(jīng)信息傳遞、代謝的調(diào)節(jié)以及肽、蛋白質(zhì)的合成等生理過(guò)程中起著重要作用，為了了解其生理功能及某些外源性刺激對(duì)其功能的影響，也需要對(duì)生物體液、細(xì)胞或組織內(nèi)的游離氨基酸進(jìn)行分析。除了氨基酸總量測(cè)定外，往往更需要對(duì)個(gè)別氨基酸進(jìn)行分析。常用的氨基酸分析方法可歸納為兩類(lèi)：衍生化間接分析法和無(wú)需衍生化的直接分析法。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)即蛋白

2、質(zhì)中多肽鏈中氨基酸的排列順序，既是研究蛋白質(zhì)分子高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，又有助于蛋白質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)的研究。在某些特定情況下，基因突變常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸的序列發(fā)生改變，從而引起功能失調(diào)和疾病產(chǎn)生。因此，測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列對(duì)新的診斷學(xué)方法開(kāi)發(fā)、新的治療方法建立以及多肽類(lèi)藥物的研究均有重要的意義。10. 1 氨基酸的衍生化間接分析法無(wú)論是游離氨基酸還是水解氨基酸的測(cè)定，由于多數(shù)氨基酸都缺少結(jié)構(gòu)檢測(cè)特征，既無(wú)紫外吸收，又無(wú)熒光，必須使之衍生，轉(zhuǎn)化為具有紫外可見(jiàn)光吸收或能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)才能檢測(cè)分析。10. 1. 1 氨基酸的衍生化反應(yīng)為了使測(cè)定氨基酸的方法靈敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是關(guān)鍵步驟

3、之一。近年來(lái)人們致力于開(kāi)發(fā)靈敏度高、衍生操作簡(jiǎn)單、形成的氨基酸衍生物穩(wěn)定的衍生化試劑。常見(jiàn)的衍生化試劑有茚三酮、鄰苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、異硫氫苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。茚三酮在酸性（pH = 3 4）和加熱條件下與氨基酸反應(yīng)生成氨、二氧化碳和藍(lán)紫色的復(fù)合物（最大吸收波長(zhǎng)為570 nm）：(10.1)除了a-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物質(zhì)，但無(wú)二氧化碳生成，b-，g-，d-和e-氨基酸比a-氨基酸反應(yīng)慢得多，生成的是藍(lán)色物質(zhì)，而亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應(yīng)形成黃色化合物（最大吸收波長(zhǎng)為440 nm）。氨基酸與茚三酮的反應(yīng)主

4、要用于柱后衍生，也可用于氨基酸的比色分析，是公認(rèn)的氨基酸總量的定量方法。在定量分析時(shí)，必須除去對(duì)測(cè)定有干擾的蛋白質(zhì)、氨和尿素。鄰苯二甲醛（OPA）與巰基試劑，通常與b-巰基乙醇連用，在堿性條件下與第一級(jí)氨基酸迅速反應(yīng)生成1硫代2烷基異吲哚，加成物可產(chǎn)生熒光，在紫外區(qū)也有較強(qiáng)的吸收，反應(yīng)式如下： (10.2)該反應(yīng)不僅適用于柱前衍生，也適用于柱后衍生，它既可進(jìn)行高靈敏度的熒光檢測(cè)（lex = 340 nm ，lem = 450 nm），檢測(cè)限達(dá)mol L-1，也可進(jìn)行一般的紫外檢測(cè)（最大吸收波長(zhǎng)為230 nm），檢測(cè)限達(dá)5mol L-1。紫外檢測(cè)的線性范圍為10 200 pmol，熒光為0.8

5、15 pmol，OPA本身不干擾分離和檢測(cè)，不必除去過(guò)量試劑，色譜圖基線也比較平穩(wěn)。OPA法主要的缺點(diǎn)是：（1）亞氨基酸不能與其直接反應(yīng)，需先氧化（如用次氯酸鈉）開(kāi)環(huán)后才能反應(yīng)。（2）熒光產(chǎn)物不穩(wěn)定。丹酰氯（Dansyl-Cl）在堿性條件下與氨基酸反應(yīng)生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，它同一級(jí)、二級(jí)氨基酸都能起反應(yīng)，但是反應(yīng)速率比較慢，在室溫條件下需35 min左右，反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系較大，反應(yīng)溫度升高可以加速產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，但最高不可超過(guò)60，否則Dansyl-Cl會(huì)發(fā)生水解，反而使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率降低。(10.3)Dansyl-氨基酸在酸性條件下（pH = 2 3）一般可被乙酸乙酯抽提，大量的Dansyl-

6、Cl的反應(yīng)副產(chǎn)物Dansyl-OH留在水相，干擾因素減小。但是Dansyl-精氨酸、Dansyl-天冬氨酸、Dansyl-谷氨酸、Dansyl-絲氨酸和Dansyl-蘇氨酸則大部分或部分留在水相，往往會(huì)被遺漏，而導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。Dansyl-Cl法的檢測(cè)限與OPA法相當(dāng)，線形范圍一般在15 150 pmol。優(yōu)點(diǎn)是（1）衍生物比較穩(wěn)定，一般可放置12 24 h；（2）Dansyl-Cl胱氨酸衍生物線性關(guān)系好，可用于體液中胱氨酸的定量測(cè)定。缺點(diǎn)是（1）反應(yīng)時(shí)間必須嚴(yán)格控制；（2）衍生物對(duì)紫外光照比較敏感，故反應(yīng)要在避光條件下進(jìn)行；（3）易生成多級(jí)衍生物，如賴氨酸、組氨酸、色氨酸生成二級(jí)衍生物。異硫

7、氰苯酯（PITC）可以和一級(jí)、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，在室溫條件下僅十分鐘即可完成，反應(yīng)產(chǎn)物具有紫外吸收（最大吸收波長(zhǎng)為254 nm）。PITC的衍生物單一、穩(wěn)定，-20 可貯存數(shù)月，4 水溶液可保存3天; 分析時(shí)間短,結(jié)果準(zhǔn)確,紫外檢測(cè)限可達(dá)1 pmol。(10.4)PITC法最大的缺點(diǎn)就是氨基酸衍生時(shí)需要真空干燥以除去過(guò)量試劑。氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）能與一級(jí)、二級(jí)氨基酸的氨基反應(yīng)，生成的衍生物可用熒光檢測(cè)（lex = 260 nm，lem = 310 nm），F(xiàn)MOC-Cl與氨基酸反應(yīng)迅速，實(shí)溫下約30s即可完成。反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，在4 避光條件下可儲(chǔ)存13天，在酸性條件下也可穩(wěn)定30小時(shí)以上

8、。反應(yīng)有很高的靈敏度，檢測(cè)極限為1 pmol，色譜分離中有很好的分辨率和分離速度。該法最大的優(yōu)點(diǎn)是不受樣品基質(zhì)的干擾。(10.5)FMOC-Cl法最大的缺點(diǎn)是（1）與His形成單、雙衍生物的比例不穩(wěn)定，影響定量。（2）FMOC-Cl在衍生過(guò)程中易產(chǎn)生試劑的水解反應(yīng)，過(guò)量的FMOC-Cl及其水解產(chǎn)物均有和FMOC-氨基酸類(lèi)似的熒光，可用戊烷抽提去除干擾，但抽提效率約為70%，只能除去部分干擾；另一種方法是采用1-氨基金剛烷與過(guò)量的FMOC-Cl試劑反應(yīng)，生成的衍生物可在全部氨基酸衍生物之后出峰，這就排除了試劑峰的干擾。2、4二硝基氟苯（FDBN）在堿性條件下（pH = 9.5）與氨基酸或肽的游離

9、氨基反應(yīng)生成黃色的二硝基苯酚（DNP）的衍生物。反應(yīng)速率較慢，在50暗處需要60分鐘左右。DNP-衍生物避光條件下比較穩(wěn)定，在室溫避光條件下可保存7天，在4條件下可保存30天。FDBN能與一級(jí)、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，DNP-衍生物的檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm, 最小檢出量可達(dá)10 pmol。不足之處是與谷氨酸的衍生化反應(yīng)較慢。(10.6)熒光胺本身沒(méi)有熒光，但是在堿性條件下，它與伯胺反應(yīng)形成具有熒光的產(chǎn)物（最大激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)475 nm），衍生化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度決定于反應(yīng)系統(tǒng)的pH值，在pH = 9時(shí)，熒光最強(qiáng)，而在pH = 7.4時(shí)，只有很低的熒光強(qiáng)度。由于這一反應(yīng)在室溫條件下幾

10、秒內(nèi)即可完成，而過(guò)剩的試劑在幾秒鐘內(nèi)就會(huì)被分解，不干擾測(cè)定。由于熒光胺在水溶液中不穩(wěn)定，必須用丙酮配制。熒光胺不能與仲胺如脯氨酸和羥脯氨酸反應(yīng)，除非他們與N-氯代琥珀酰亞胺作用轉(zhuǎn)變?yōu)椴贰?10.7)伯胺 熒光胺（無(wú)熒光） 熒光產(chǎn)物熒光黃異硫氰酸苯酯（FITC），在pH 9 10范圍內(nèi)與一、二級(jí)氨基酸在室溫條件下避光反應(yīng)12 h，生成具有熒光的產(chǎn)物（最大激發(fā)光波長(zhǎng)為490 nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為518 nm）。過(guò)量的試劑不干擾分離，反應(yīng)液可直接進(jìn)樣分析。衍生化產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，在室溫條件下可放置一天。 (10.8) FIC-氨基酸6氨基喹啉基N羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（ACQ），在pH 8.2 1

11、0.0范圍內(nèi)與一、二級(jí)氨基酸迅速反應(yīng)（除了Tyr需加熱到50），生成的衍生物具有紫外吸收（最大吸收波長(zhǎng)為 248 nm）和熒光（lex/lem = 245 nm /395 nm），過(guò)量的試劑將快速水解，衍生化產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，在室溫條件下可放置一周，在4條件下可保存兩周。反應(yīng)液可直接進(jìn)樣分析。紫外檢測(cè)的檢測(cè)限可達(dá)pmol，熒光檢測(cè)的檢測(cè)限可達(dá)40 fmol。(10.9)(10.10)N羥基琥珀酰亞胺3吲哚乙酸酯（SA），是一種較新的衍生化試劑，在pH 8.0 9.5范圍內(nèi)，室溫條件下與一、二級(jí)氨基酸反應(yīng)1小時(shí)左右（低溫對(duì)該衍生反應(yīng)有利，但溫度太低，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)），生成熒光衍生物（lex/lem

12、= 278 nm / 355 nm），過(guò)量試劑不需預(yù)先除去，干擾較小，反應(yīng)液可直接進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析，檢出限可達(dá)pmol。(10.11)氨基酸 SA 衍生氨基酸 NHS還有一些其他的衍生試劑如3對(duì)羥基甲酰喹啉2甲醛（CBQCA），試劑本無(wú)熒光，在pH 9 左右與一級(jí)氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的強(qiáng)熒光吲哚衍生物（lex/lem為 450 nm/550 nm），冰箱中可保存2周。最低檢測(cè)限可達(dá)5 fmol。N羥基琥珀酰亞胺奈乙酸酯（SINA）， pH 8.9時(shí)與一、二級(jí)氨基酸在室溫條件下反應(yīng)45分鐘生成具有紫外吸收（lmax = 280 nm）的衍生物。該衍生物穩(wěn)定，檢測(cè)限可達(dá) pmol。4氟7硝基苯并2、1

13、、3噁二唑（NBD-F）在 pH 8、60條件下與一級(jí)和二級(jí)氨基反應(yīng)2 min，然后將pH調(diào)至1生成強(qiáng)熒光衍生物（lex/lem為470 nm / 530 nm），最低檢測(cè)限可達(dá) fmol。 10. 1. 2 氨基酸的毛細(xì)管電泳分析法毛細(xì)管電泳(CE)具有微量、靈敏和柱效高的特點(diǎn)，適合于復(fù)雜樣品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛細(xì)管電泳主要采用兩種分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳。分離各種氨基酸衍生物的緩沖液常為磷酸、硼酸或混合液，也可在 SDS 膠束溶液中加入甲醇、四氫呋喃或尿素等以改善分離度。除了可進(jìn)行柱前衍生化，還可以進(jìn)行柱內(nèi)和柱后衍生化。檢測(cè)方式可用UV檢測(cè)，但大部分采用激

14、光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（LIF），激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)常用325 / 550 nm 和488 / 525 nm，可檢測(cè)到 amol 甚至 zmol 水平的量?？捎糜跍y(cè)定肽或蛋白質(zhì)經(jīng) Edman 降解后的氨基酸以及生理氨基酸。人體體液中生理氨基酸的水平及其改變，不僅受年齡營(yíng)養(yǎng)狀況的影響，而且與某些疾病如肝病、腎病以及先天遺傳代謝性疾病等密切相關(guān)。為了研究不同疾病狀況下氨基酸的代謝情況，需要一種快速測(cè)定氨基酸方法以滿足其需要。以區(qū)帶毛細(xì)管電泳為分離模式的高效毛細(xì)管電泳為快速測(cè)定血清中氨基酸提供了有效手段1, 見(jiàn)圖10.1。圖10.1 人血清中氨基酸和內(nèi)標(biāo)的毛細(xì)管電泳圖譜樣品預(yù)處理：0.5 ml血清加內(nèi)標(biāo)（10

15、 mmol L-1 D-正白酸）20l，加乙腈1.5 ml，渦旋30s，放置10 min后，15000 g離心10 min，上清液備用或置于-20保存。衍生化：待測(cè)標(biāo)本的上清液或氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml，加0.5 mol L-1 pH 9.5硼酸鈉緩沖溶液1 ml，加乙腈1 ml , FDBN 20l，搖勻，在50水浴加熱40分鐘。分離條件：（1）操作緩沖液的組成：0.03 mol L-1 pH 9.8四硼酸鈉緩沖液 異丙醇30% Brij = 82515025。（2）開(kāi)口石英毛細(xì)管：總長(zhǎng)度為370 mm，有效長(zhǎng)度為300 mm，內(nèi)徑為75m。（3）電壓：28 KV。（4）溫度：15。（5）進(jìn)

16、樣：壓力進(jìn)樣5 s。（6）UV檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。該方法在8分鐘內(nèi)可分離血清中16種氨基酸，如圖101所示，氨基酸的線性范圍10 700 mol L-1，最低檢測(cè)限為2.5 7.9 mol L-1，回收率為86.3 107.4%。利用FITC柱前衍生-毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光測(cè)定大鼠大腦皮質(zhì)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量，如圖10.2所示，可用于研究大鼠腦缺血時(shí)黃芩甙的藥理作用。結(jié)果顯示大腦缺血時(shí)，大腦皮質(zhì)的Glu, Asp, GABA和Gly濃度升高，而黃芩甙可降低Glu和Asp 的濃度，對(duì)腦缺血有保護(hù)作用2。樣品處理：取大鼠大腦皮質(zhì)絞碎，以51(w/v)加入15 mmol L-1硼酸緩沖液（pH

17、 9.2）勻漿20 min, 然后加入等體積的氯仿劇烈振搖15 min 去蛋白，20000 rpm 離心20 min，取上清液衍生化（或在-70保存）。衍生化：50 ml去蛋白的樣品，加400 ml的硼酸緩沖液（5 mmol L-1，pH 9.6），加50 l 90 mmol L-1 FITC丙酮溶液，在20 避光反應(yīng)16小時(shí)，進(jìn)樣前用操作緩沖液10倍稀釋。圖10.2 對(duì)照大鼠大腦皮質(zhì)勻漿的毛細(xì)管電泳圖譜分離條件：（1）未涂漬石英毛細(xì)管柱，總長(zhǎng)度為570 mm，有效長(zhǎng)度為500 mm內(nèi)徑為75 m。（2）毛細(xì)管的平衡：用操作緩沖液沖洗前用0.1 mol L-1 NaOH和去離子水沖洗。（3）操

18、作緩沖液的組成：15 mmol L-1硼酸緩沖液（pH為9.2）。（4）電壓：17.5 kV。（5）溫度：25。（6）進(jìn)樣：采用壓力方式進(jìn)樣5s。（7）檢測(cè)器：488 nm Ar+激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)。該方法六種氨基酸的檢測(cè)限為2.110-11 6.310-10 mol L-1，回收率為97.1 102.6 %，是一種快速、有選擇性和靈敏的測(cè)定大鼠大腦皮層氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的方法。10. 1. 3 氨基酸的反相高效液相色譜分析法反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析衍生化的氨基酸混合物具有分析時(shí)間較短、方法靈活多樣、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。將氨基酸進(jìn)行柱前衍生的關(guān)鍵在于衍生劑的選擇，選擇標(biāo)準(zhǔn)是能與各氨

19、基酸定量反應(yīng)，每種氨基酸只生成一種衍生物且有一定的穩(wěn)定性，操作簡(jiǎn)便，不產(chǎn)生或易于排除干擾物，色譜分離的分辨率高，檢測(cè)靈敏度高，分析時(shí)間短，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或使衍生物能在不同型號(hào)的高效液相色譜儀上測(cè)定。衍生后的氨基酸一般在高效烷基鍵合C18或C8柱上，根據(jù)液液分配原理進(jìn)行分離，流動(dòng)相多以乙酸鹽或磷酸鹽緩沖液為主，乙醇、甲醇或四氫呋喃為調(diào)節(jié)劑。由于氨基酸衍生物仍保留著兩性混合物的特點(diǎn)，故除改變調(diào)節(jié)劑外，還可通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，離子強(qiáng)度，柱溫等使之達(dá)到理想的分離。當(dāng)然，不同衍生物所選用的柱型、流動(dòng)相以及氨基酸的洗脫時(shí)間和順序不盡相同。柱前衍生反相高效液相色譜法可用于分析蛋白質(zhì)水解液、生理體液和食品

20、等樣品中的氨基酸。利用OPA柱前衍生-反相高效相色譜分離-熒光檢測(cè)的分析方法測(cè)定大鼠腦組織中分區(qū)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量，如圖10.3。結(jié)果可見(jiàn)興奮性氨基酸，尤其是谷氨酸在腦內(nèi)的含量相對(duì)較高3。圖10.3 大鼠大腦海馬的氨基酸的色譜圖樣品預(yù)處理: 分別取大鼠大腦皮質(zhì)、海馬、小腦和紋狀體，以19 (w/v) 加人生理鹽水，手動(dòng)玻璃勻漿器冰浴勻漿；勻漿液在3 000 rpm min-1 4低溫離心15 min，取上清液0.5 ml，加0.4 mol L-1高氯酸1 ml 去蛋白，同時(shí)加內(nèi)標(biāo)高絲氨酸液（Hse, 1 mmol L-1）50 l，混勻，3000 rpm min-1 4 低溫離心15 min

21、，取 0.5 ml上清液，加2 mol L-1 K2CO3溶液1 ml，用 0.1 mol L-1 K2CO3溶液稀釋到5 ml，14000 rpm min-1 4 低溫離心20 min，取上清液衍生化。衍生化反應(yīng)：將13.4 mg OPA 溶于1 ml無(wú)水乙醇中，加入20 l -巰基乙醇，加4 ml 0.1 mol L-1硼酸緩沖溶液（pH 9.6），每日補(bǔ)充20 l -巰基乙醇以維持巰基強(qiáng)度，可使用1周。預(yù)處理好的樣品40 l加入OPA衍生液20 l輕輕混勻，室溫靜置2 min，進(jìn)樣20 l。分析條件：色譜柱為 Hypersil ODS-3（4.6250 mm, 5 m），流動(dòng)相：磷酸二氫

22、鉀緩沖液(0.1 mol L-1，pH 6.0)甲醇乙腈體積比為631，流速1 ml min-1，柱溫40，熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm。這幾種氨基酸在0.5 40 mol L-1濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)在0.997 0.999之間，具有較好的線形關(guān)系。當(dāng)信噪比為3時(shí)，各氨基酸的最小檢測(cè)限在0.010.02 mol L-1范圍。10. 1. 4 氨基酸分析儀早在20世紀(jì)40年代初，人們便開(kāi)始用色譜法分析氨基酸。第一臺(tái)氨基酸分析儀是spackman、Stein和Moore在1958年以離子交換色譜儀為基礎(chǔ)建立的。此后，該類(lèi)儀器在關(guān)鍵部件以及分析速度、靈敏度和自動(dòng)化程度上都得到

23、了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。至80年代中，一個(gè)蛋白水解液分析只需30分鐘，靈敏度可達(dá)pmol級(jí)。80年代后液相色譜、特別是鍵合反相分配色譜及柱前衍生技術(shù)的發(fā)展又給氨基酸分析儀的發(fā)展注入了新的生機(jī)與活力。目前，離子交換色譜在氨基酸分析中仍占主導(dǎo)地位，被國(guó)內(nèi)外公認(rèn)為最準(zhǔn)確可靠的分離測(cè)定手段，而柱前衍生高效液譜法也已成熟，進(jìn)入了實(shí)用階段。10. 1. 4. 1 離子交換色譜氨基酸分析儀離子交換色譜氨基酸分析儀又常被稱做專用(自動(dòng))氨基酸分析儀。其基本原理是：先將氨基酸混合物在離子交換樹(shù)脂柱上分離，然后將分離的氨基酸衍生，根據(jù)衍生產(chǎn)物的特性選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器檢測(cè)，并進(jìn)行定性、定量分析。1離子交換樹(shù)脂 專用氨基酸分

24、析儀都是以磺酸型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為柱填料的。該樹(shù)脂又是由苯乙烯和二乙烯基苯聚合后磺化而成的。苯乙烯是主要成分，二乙烯苯是交聯(lián)劑，離子交換的活性基團(tuán)磺酸根即聯(lián)在苯乙烯乙烯基的對(duì)位上。交聯(lián)劑的百分含量(交聯(lián)度)影響著樹(shù)脂內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑大小，交聯(lián)劑多，分子結(jié)構(gòu)緊密，孔徑就小，適合分離分子量較小的離子。反之，交聯(lián)劑少，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑大，適合分離分子量大的離子。一般氨基酸分析儀采用的離子交換樹(shù)脂交聯(lián)度多為8 12%，目前各國(guó)各廠商的離子交換樹(shù)脂因所用的二乙烯基苯的純度、類(lèi)型 (如鄰、對(duì)位異構(gòu)體等)、磺化程度及其范圍雖不盡相同，但均是球狀的，粒度一般在5 10 m之間。2分離 氨基酸屬兩性電解質(zhì)，其

25、所帶電荷隨pH或離子強(qiáng)度而改變。在酸性溶液中(即pH在等電點(diǎn)以下時(shí))，呈正離子態(tài)，可被離子交換樹(shù)脂表面的磺酸基團(tuán)所吸引而附著在樹(shù)脂上，隨pH上升或離子強(qiáng)度增大，吸引力即會(huì)下降乃至消失而被洗脫下來(lái)。不同的氨基酸等電點(diǎn)、極性及分子大小不同，洗脫順序也不相同。一般酸性和帶羥基的氨基酸先洗脫下來(lái)，然后是中性氨基酸，最后是堿性氨基酸。在同類(lèi)氨基酸中，短碳鏈小分子的先洗脫出來(lái)，長(zhǎng)碳鏈大分子的后洗脫出來(lái)(如甘氨酸先于丙氨酸，纈氨酸先于亮氨酸)。而碳原子數(shù)相同的氨基酸，有支鏈的先洗脫出來(lái)(如異亮氨酸先于亮氨酸，亮氨酸先于正亮氨酸)，碳鏈上的羥基基團(tuán)可加速洗脫(如絲氨酸先于丙氨酸、羧脯氨酸先于脯氨酸、酪氨酸先于

26、苯丙氨酸，羥基賴氨酸先于賴氨酸)。氨基酸分離不僅受離子交換樹(shù)脂的型號(hào)、交聯(lián)度和粒度的影響，還受色譜柱的長(zhǎng)度、截面積、柱溫和洗脫緩沖液的陽(yáng)離子類(lèi)型、pH值、離子強(qiáng)度、淋洗梯度、流速以及其中有機(jī)溶劑含量的影響。特別需要指出的是洗脫液的陽(yáng)離子類(lèi)型，如Na+型緩沖液變化pH值和離子強(qiáng)度等，雖能很好的分離各種蛋白水解氨基酸，卻不能將天門(mén)冬酰胺、谷氨酰胺和一些相關(guān)的氨基酸分離開(kāi)來(lái)，因此在生理體液分析中除要改變柱長(zhǎng)、調(diào)節(jié)柱溫外，還必須將Na+緩沖體系改換成Li+緩沖體系。3衍生與檢測(cè)常用的衍生法是茚三酮法（紫外檢測(cè)）和鄰苯二甲醛法（熒光檢測(cè)）。4儀器的結(jié)構(gòu)與流程典型的氨基酸分析儀如日立(Hitachi) 8

27、35或Beckman l2l MB等一般采用3 5種不同pH 值的緩沖液。緩沖液經(jīng)加熱脫氣后，按時(shí)間切換，順序用泵輸送到色譜柱上，使由進(jìn)樣系統(tǒng)定量注入的氨基酸混合物逐步分離。分離后的氨基酸與另一臺(tái)泵輸送出的茚三酮混合，經(jīng)反應(yīng)槽加熱完成衍生，進(jìn)入紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)?；蚍蛛x后的氨基酸先與次氯酸鈉混合，氧化開(kāi)環(huán)后與OPA反應(yīng)，以熒光計(jì)檢測(cè)。檢測(cè)后得到的信號(hào)，放大后再送至記錄儀，積分儀或其它數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。如圖10.4所示。目前生產(chǎn)的氨基酸分析儀多是單柱的，色譜柱有不銹鋼或玻璃的，內(nèi)徑1.75 5 mm，柱長(zhǎng)15 30 cm之間。由于氨基酸的最佳分離應(yīng)在適當(dāng)?shù)臏囟龋?0 37 ）才能獲得，故色譜柱

28、通常都裝有循環(huán)水的夾套，由水浴的循環(huán)水控制溫度在0.5 。專用型氨基酸分析儀的發(fā)展主要體現(xiàn)在柱系統(tǒng)的變化和儀器的自動(dòng)化、電腦化，柱系統(tǒng)的變化首先體現(xiàn)在樹(shù)脂粒度的變化，以從20 m 以至3 m。其次內(nèi)徑縮小，從6 mm降至3 mm乃至1.75 mm，加之高壓泵的設(shè)計(jì)利用及顯色溫度的提高，使分析靈敏度和速度均有較大的提高，靈敏度以由nmol 級(jí)降至pmol級(jí)，分析速度提高了5 8倍。儀器的全自動(dòng)化和電腦化使操作更加方便。8912111076125恒溫6緩沖液1OCl-NaOHOPA(或茚三酮)緩沖液2緩沖液3圖10.4 氨基酸自動(dòng)分析儀的基本結(jié)構(gòu)與流程1緩沖液脫氣系統(tǒng)；2緩沖液選擇閥；3泵；4壓力

29、表；5進(jìn)樣器；6色譜柱；7程序儀；8混合室；9反應(yīng)器；10熒光計(jì)或光度計(jì)；11記錄儀；12積分儀10. 1. 4. 2 反相色譜氨基酸分析儀專用氨基酸分析儀發(fā)展到20世紀(jì)80年代中期，其分析速度與靈敏度進(jìn)一步的提高，受到樹(shù)脂粒度及柱后衍生等的嚴(yán)重制約。然而反相鍵合色譜和柱前衍生技術(shù)的發(fā)展給氨基酸分析開(kāi)辟了另一領(lǐng)域。反相色譜分析儀與專門(mén)的氨基酸分析儀相比，更靈敏（可達(dá)fmol級(jí)）、快速（完成一個(gè)蛋白水解液分析僅需13 30分鐘）、儀器投資少且可一機(jī)多用，目前有不少?gòu)S家推出了配套的技術(shù)與儀器。1、 儀器結(jié)構(gòu)反相分配色譜測(cè)定氨基酸可分為在線衍生或機(jī)外衍生兩種類(lèi)型，但無(wú)論那種類(lèi)型所用儀器均為通用高效液

30、相色譜儀。一般說(shuō)來(lái)，只要有二元泵、高效柱（粒度3-4 m，理論塔板數(shù)70 000），能進(jìn)行梯度淋洗并有適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器（紫外可見(jiàn)光或熒光光度計(jì)）即可。表10.1 柱前衍生HPLC各衍生方法的比較 OPA FMOC-Cl PITC FDNB Dansyl 衍生時(shí)間（min） 1 30 衍生物穩(wěn)定性 低 高 高 高 較高 與二級(jí)胺反應(yīng) 不 能 能 能 能 衍生操作 很簡(jiǎn)單 較復(fù)雜 較復(fù)雜 較復(fù)雜 簡(jiǎn)單 去除過(guò)量 抽干 不必 不必 需要 需要 不必 試劑 溶劑提取 不必 需要 不必 不必 不必 干擾性副反應(yīng) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 有 有 色譜分析 蛋白水解液 20 25 20 30 20 時(shí)間 生理體液 50 7

31、0 60 60 60 檢測(cè) 熒光/紫外 熒光/紫外 紫外 紫外 熒光 靈敏度 fmol fmol pmol pmol pmol線形范圍，pmol 0.3 15 0.1 5 50 200 5 200 15 1500 200 5 200CV% 0.4 2.2 1.9 4.6 2.6 5.5 1 3.2 1.5 4.1表10.1列出了一些常用的柱前衍生HPLC法的主要特點(diǎn)。目前不同的儀器廠家所推薦配套的方法各不相同，如Agilent和Gilson公司用OPA-FMOC結(jié)合法、LKB公司則由用戶從OPA、FMOC和PITC等法中任選, Waters公司使用的是PITC法(即PICOTAG方法)和Acc

32、QTagTM法。 2 應(yīng)用4,5 Waters公司PICOTAG氨基酸分析法是由樣品的水解，衍生和分離等條件集結(jié)而成。PICOTAG HPLC是由PICOTAG水解衍生工作臺(tái)和HPLC系統(tǒng)構(gòu)成。PICOTAG水解衍生工作臺(tái)對(duì)樣品的水解和衍生有良好的效果，進(jìn)行水解時(shí)的溫度控制、樣品的干燥、衍生反應(yīng)試劑的去除、真空操作、氮?dú)庵脫Q等工作。以PITC作為柱前衍生化試劑，采用反相色譜的原理進(jìn)行氨基酸分析，分離柱為PICOTAG專用柱，用梯度洗脫的方式洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，蛋白水解的17種氨基酸可在12分鐘內(nèi)完成分離（見(jiàn)圖10.5所示）。此外，PICOTAG方法靈敏度高，檢出限可達(dá)1 pmol。P

33、icoTag方法測(cè)定體液游離氨基酸的方法如下:（1）HPLC儀（Waters），510泵，490E全波長(zhǎng)可見(jiàn)-紫外檢測(cè)器，PICOTAG色譜柱，PICOTAG水解衍生裝置，810色譜工作站。（2）試劑 流動(dòng)相：A：0.07 mol L-1醋酸鈉，2.5 mmol L-1 EDTA，pH 6.5。B：乙腈水甲醇為4.541.5。內(nèi)標(biāo)液：稱取蛋氨酸砜113.2 mg，用25 ml 0.1 mol L-1 HCl稀釋后，再稀釋10倍使內(nèi)標(biāo)濃度為2.5 mmol L-1。圖10.5 蛋白質(zhì)水解后PITC衍生氨基酸樣品250 pmol的分離結(jié)果衍生試劑：異硫氰酸苯酯甲醇三乙胺水為1711，臨用前配制。樣

34、品稀釋液：取0.71g磷酸氫二鈉，加超純水溶解至1 000 ml，用10 % 磷酸乙腈液（955）調(diào)pH至7.4。（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液和體液標(biāo)本的制備氨基酸混合標(biāo)樣：取2.5 mmol L-1的酸性、中型氨基酸標(biāo)樣10 l，2.5 mmol L-1堿性氨基酸標(biāo)樣10 l，2.5 mmol L-1內(nèi)標(biāo)液20 l，加0.1 mmol L-1 HCl 100 l，搖勻。血清標(biāo)本：取清晨空腹血1 ml，離心后取血清100 l，加入20 l內(nèi)標(biāo)液充分混勻，用離心式超濾法除蛋白，超濾液于-20 保存?zhèn)溆?。?）衍生反應(yīng)：取制備好的氨基酸混合標(biāo)樣或體液標(biāo)本20 l，加入20 l 衍生試劑在室溫反應(yīng)20分鐘，抽干加

35、入100 l樣品稀釋液，充分溶解后直接進(jìn)樣。 （5）色譜條件：柱溫：46 。流速：1 ml min-1。檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。進(jìn)樣量：10 l。進(jìn)樣后按照下列程序進(jìn)行梯度洗脫：時(shí)間（min） 0 13.5 24.0 30.0 50.0 62.5 67.0A液（%） 100 97.0 94.0 91.0 66.0 0 100 結(jié)果表明：該方法可將血清中常見(jiàn)的游離氨基酸分離，如圖10.6所示。氨基酸濃度在10 1000 mol L-1之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.994 0.999之間，信噪比為2時(shí)，血清游離氨基酸最低檢測(cè)濃度為2 mol L-1。Waters公司的AccQTagTM氨基酸分析

36、法，采用AQC作為柱前衍生試劑，比PICOTAG（R）法快速、靈敏，提高了定量的準(zhǔn)確度，水解氨基酸的檢測(cè)限低于1 pmol。AccQTagTM氨基酸分析法只需HPLC儀和AccQTagTM化學(xué)包（AccQTagTM試劑盒和Nova-PakC18 4 m柱）。采用AccQTagTM法分析水解氨基酸如圖10.7所示。Agilent公司的氨基酸分析方法，運(yùn)用了可靠的衍生化反應(yīng)和分析技術(shù)。利用自動(dòng)進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)在線衍生化與HPLC相結(jié)合，氨基酸與OPA和FMOC發(fā)生反應(yīng)，然后進(jìn)行色譜分析。酸水解后的蛋白質(zhì)、多肽樣品在pH 10.2的緩沖液中可以直接衍生化。在3巰基丙酸（3-MPA）存在下一級(jí)氨基酸首先與O

37、PA反應(yīng)，二級(jí)氨基酸不和OPA反應(yīng)，然后再用FMOC進(jìn)行衍生。加入的吲哚與3-MPA相結(jié)合可降低氨基酸的疏水性，所以O(shè)PA衍生化產(chǎn)物比PMOC衍生化產(chǎn)物的色譜出峰時(shí)間更早。過(guò)量的FMOC及其降解產(chǎn)物在二級(jí)氨基酸后出峰，不會(huì)干擾分析，分析過(guò)程快速、準(zhǔn)確、靈敏且重現(xiàn)性好。圖10.6 血清游離氨基酸色譜圖圖10.7 AccQTagTM法分析水解氨基酸的色譜圖柱：Nova-PakRC18 3.9150 mm, 4 m; 柱溫：37 ；流動(dòng)相A: AccQTagTM流動(dòng)相；流動(dòng)相B：乙腈; 流動(dòng)相C: 超純水; 流速：1 ml min-1; 梯度：AccQTagTM方法；檢測(cè): 熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為250

38、 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為395 nm。10. 2 氨基酸直接分析法氨基酸直接分析法是基于陰離子交換分離，積分脈沖安培法檢測(cè)，不需將氨基酸進(jìn)行衍生。1999 年 Clarke 等人發(fā)展了一種積分脈沖安培檢測(cè)波形。用積分脈沖安培檢測(cè)的高效陰離子交換色譜，無(wú)需衍生，可以直接分離測(cè)定氨基酸，對(duì)大多數(shù)氨基酸的檢測(cè)限小于l pmol，線性范圍可以達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。10. 2. 1 陰離子交換分離氨基酸具有兩性離子結(jié)構(gòu)，在酸性介質(zhì)中，以氨基陽(yáng)離子狀態(tài)存在；在堿性介質(zhì)中，以羧基陰離子狀態(tài)存在，這就是氨基酸直接分析方法的基礎(chǔ)。氨基酸直接分析用薄殼陰離子交換樹(shù)脂為固定相，陰離子交換樹(shù)脂含有的堿性基團(tuán) N(CH3)3O

39、H (強(qiáng)堿性)或NH3OH (弱堿性)，可以解離出 OH，能與溶液中的氨基酸陰離子發(fā)生交換。氨基酸與樹(shù)脂的親合力主要取決于它們之間的靜電吸引，其次是氨基酸烷基側(cè)鏈與樹(shù)脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水作用和氨基酸的空間構(gòu)型。在 pH 12 13 條件下，氨基酸與陰離子交換樹(shù)脂之間的靜電吸引的大小次序是：酸性氨基酸 中性氨基酸 堿性氨基酸。因此，氨基酸的洗脫順序大體是堿性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸。通常堿性溶液為流動(dòng)相，其中氫氧化鈉不僅提供洗脫離子 OH，而且堿性pH條件也是氨基酸在金電極表面進(jìn)行氧化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)積分脈沖安培檢測(cè)的必須條件。醋酸根離子（Ac）對(duì)陰離子交換樹(shù)脂的親力大于 OH，是一種較強(qiáng)的

40、洗脫離子，它對(duì)于極性較小，保留較強(qiáng)的氨基酸起“推”的作用。10. 2. 1 脈沖積分安培檢測(cè)用于氨基酸檢測(cè)的安培檢測(cè)器通常采用金工作電極、Ag/AgCl參比電極和鈦對(duì)電極。在 pH 12 13 溶液中，在金工作電極和 Ag/AgC1 參比電極之間施加一個(gè)較高的電位，一氨基酸在金電極表面被氧化，大多數(shù)氨基酸開(kāi)始先被氧化為亞胺(1)，然后進(jìn)一步氧化為腈基化合物(2)，另外，少量的亞胺發(fā)生水解生成醛類(lèi)化合物(3)。反應(yīng)過(guò)程如下：R-CH(NH2)COO一 R-CH=NH + H+ + 2e (10.12)R-CH=NH R-CN + H+ + 2e (10.13)R-CH=NH + H2O R-CH

41、O + NH3 (10.14)氨基酸的脂肪側(cè)鏈抑制氨基酸的氧化反應(yīng)(如亮氨酸和異亮氨酸)，而氨基酸側(cè)鏈中的羥基(絲氨酸和蘇氨酸)、酰胺基(天門(mén)冬氨酸)和咪唑基(組氨酸)有利于這些氨基酸的氧化反應(yīng)。在金電極上得到氨基的最大氧化電流所需的電位已超過(guò)金表面被氧化的電位。在高電位時(shí)，金電極本身形成表面氧化層和氨基酸氧化產(chǎn)物的附著，金電極會(huì)很快失效。金電極表面氧化時(shí)所產(chǎn)生的電流無(wú)疑會(huì)增加背景和基線噪音以及基線的不穩(wěn)定性。而脈沖電化學(xué)檢測(cè)器就解決了這一問(wèn)題，由三個(gè)不同的脈沖電位代替直流安培檢測(cè)器中的加于工作電極上的恒定電位。較工作電位高的正電位用來(lái)除去金電極上被測(cè)成分的氧化產(chǎn)物。由于金電極本身會(huì)部分氧化成

42、氧化金，再加一個(gè)大的負(fù)電位，使氧化金還原到還原狀態(tài)。該脈沖每 0.5 1s 循環(huán)一次。在金電極上得到氨基的最大氧化電流所需的電位超過(guò)金表面氧化的電位，金電極表面氧化所產(chǎn)生的電流無(wú)疑會(huì)增加背景和基線嘈聲以及基線的不穩(wěn)定性。為此，1989年 Johnson 等人6引入了一種新的技術(shù)積分脈沖安培。與脈沖安培相似，積分脈沖安培法中加到工作電極上的也是一種自動(dòng)重復(fù)的電位對(duì)時(shí)間的脈沖電位波形，其不同之處是采樣時(shí)的電位不是恒定的，而是在高-低值之間掃描。在高電位時(shí)，氨基和金的氧化同時(shí)發(fā)生，在高電位時(shí)所形成的氧化金在低電位時(shí)被還原，因此由積分整個(gè)高-低循環(huán)的電流所得到的信號(hào)僅僅是被分析成分的信號(hào)。檢測(cè)氨基酸的

43、積分安培電位波形如圖10.8所示，由六步組成，分為三個(gè)區(qū)，E1 和 E2 為吸附/引發(fā)區(qū)；E3 和 E4 為電流積分區(qū)；E5和E6為清洗/活化區(qū)。吸附步驟的施加電壓E1一般為負(fù)電位，其大小和持續(xù)時(shí)間影響吸附氨基酸的靈敏度，導(dǎo)致吸附氨基酸和非吸附氨基酸的響應(yīng)因子的擴(kuò)大，影響堿性氨基酸的線形范圍。必須控制E1的持續(xù)時(shí)間，一般小于 40 ms。E2 提供一個(gè)可以開(kāi)始積分而氧又不會(huì)被還原的電位。開(kāi)始積分之前在E2的延遲時(shí)間允許充電電流減弱，短的延遲時(shí)間可減小由于醋酸鈉梯度所引起的色譜基線改變以及不同氨基酸響應(yīng)因子的差距，E2 的推薦時(shí)間為 60 ms。為了獲得最高靈敏度，亦應(yīng)為負(fù)電位（-0.05 V）

44、，使金電極完全還原，同時(shí)氨基酸的吸附在較低的速度下繼續(xù)進(jìn)行。開(kāi)始積分時(shí)，第一積分電位 E3 上升到足以氧化氨基酸和電極表面被氧化的正電位，應(yīng)大于 0.20 V，最佳值在 0.25 0.30 V 之間。受金電極氧化的限制，不宜太高，否則背景和噪音將增加。在第二積分電位E4，積分電位由 E3 降到 E4（積分開(kāi)始前的電位），此時(shí)氧化金的還原電荷將抵消金氧化的電荷，氧化金的還原比氧化快，為了實(shí)現(xiàn)背景補(bǔ)償，電位 E4（-0.05 V）的時(shí)間不必像電位E3 那樣長(zhǎng)，總的積分時(shí)間約為 450 ms（E3 為 290 ms，E4 為 140 ms）。積分完畢后，立即將電位降至清洗電位 E5（-2V），對(duì)電極

45、進(jìn)行清洗，然后迅速升高電位至活化電位 E6（+0.6 V），再立即回到初始電位 E1，從而完成一次積分周期，總的信號(hào)值決定于高低電位之間的電流積分值。時(shí)間（s） 電勢(shì)（V） 積分0.0 -0.200.04 -0.200.05 -0.050.11 -0.05 開(kāi)始0.12 +0.280.41 +0.280.42 -0.050.56 -0.05 結(jié)束0.57 -2.000.58 -2.000.59 +0.600.60 -0.20圖10.8 測(cè)定氨基酸的積分安培電位波形圖10. 2. 2 應(yīng)用美國(guó)Dionex公司的氨基酸直接分析儀的色譜條件如下：分離柱：AminoPac PA10 (250 mm 2

46、 mm i. d)，溫度：30 ，流速：0.25 ml min-1，進(jìn)樣體積：25 l，檢測(cè)方式：積分脈沖安培檢測(cè)器（IPAD），Ag/AgCl 參比電極，金工作電極。水解產(chǎn)物中氨基酸分析的梯度洗脫條件如下Time Water 0.25 mol L-1 1.0 mol L-1(min) (%) NaOH (%) NaAc (%) Curve進(jìn)樣 0.0 90 10 2.0 90 10 5.0 85 15 88.0 64 36 8 11.0 64 36 18.0 40 20 40 21.0 44 16 40 8 23.0 14 16 70 8 42.0 14 16 70 8 42.1 20 80

47、 544.1 20 80 44.2 90 10 574.0 90 10 梯度曲線的形狀是按照美國(guó)Dionex公司GS 50 梯度泵的使用手冊(cè)No.031612第二稿的定義。此方法已用于分析氨基酸注射液7（用去離子水分別稀釋 l 000倍，經(jīng)過(guò)0.45 m 濾膜過(guò)濾），所得色譜圖見(jiàn)圖10.9。氨基酸的檢出限為0.3 10.3 pmol，線性范圍約為2個(gè)數(shù)量級(jí),樣品加標(biāo)回收率為 88.3 104.6。圖10.9 氨基酸注射液樣品 (稀釋1 000倍) 色譜圖1.Arg.2.Lys.3.glucose.4.Ala.5.Thr.6.Gly.7.Val.8.Ser.9.Pro.10.Iso.11.Leu

48、.12.Met.13.His.14.Phe.15.Glu.16 Asp. 17.Cys.18.Tyr.10.3 氨基酸的液質(zhì)聯(lián)用分析液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已成為分離、鑒定各種化合物的重要手段之一。液質(zhì)聯(lián)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)液相檢測(cè)器的不足，它集 LC 的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在分析各種復(fù)雜生物基質(zhì)(全血、血漿、尿、膽汁及生物組織)中的氨基酸時(shí)，由于其選擇性強(qiáng)、靈敏度高，不僅可以避免復(fù)雜、繁瑣、耗時(shí)的樣品前處理工作，而且能分離鑒定以往難于辯識(shí)的痕量氨基酸，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的應(yīng)用，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，可以大大提高分析的專一性，改善信噪比，提高靈敏度。同時(shí)，利用碰撞

49、誘導(dǎo)解離(CID)可將化合物的分子離子或準(zhǔn)分子離子打碎，通過(guò)中性丟失掃描、母離子掃描和子離子掃描，并與原型氨基酸結(jié)構(gòu)信息相比較，即可鑒定出氨基酸代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。甲狀腺素是碘化酪蛋白的主要活性成分，但甲狀腺素并不以游離的方式存在，而是以氨基酸殘基或者以某種特殊的方式膠聯(lián)于碘化酪蛋白中。動(dòng)物飼喂碘化酪蛋白后能起到間接補(bǔ)充甲狀腺素的作用。動(dòng)物甲狀腺分泌的甲狀腺素有兩種，即：3，3，5三碘甲腺原氨酸(T3)和3，3，5，5四碘甲腺原氨酸 (T4)。其中T3的活性大約是T4的5倍，但含量較小，通常所說(shuō)的甲狀腺素是指T4。一碘酪氨酸 (MIT) 和二碘酪氨酸 (DIT) 是甲狀腺素體內(nèi)合成的前體物質(zhì)。碘化

50、酪蛋白是我國(guó)禁止在動(dòng)物飼料和飲水中添加和使用的藥物添加劑之一，但缺乏有效的檢測(cè)方法。由于碘化酪蛋白并不是一種純物質(zhì)，直接測(cè)定非常困難。在國(guó)外衍生氣相色譜法和高效液相色譜法曾依次被用來(lái)測(cè)定碘化酪蛋白、體液和甲狀腺球蛋白中碘化氨基酸(甲狀腺素)的含量 ，但都缺少相應(yīng)的確證方法。LC/MS 具有靈敏度高，選擇性強(qiáng)，分離、定量和確證一次完成等特點(diǎn)，使用 LC/MS 技術(shù)，通過(guò)分離鑒定試樣的水解產(chǎn)物中的三碘甲腺原氨酸和四碘甲腺原氨酸，并以一碘酪氨酸和二碘酪氨酸作為旁證指示碘化酪蛋白的存在，從而為監(jiān)測(cè)碘化酪蛋白的使用提供了依據(jù)。樣品制備：取100 mg 碘化酪蛋白于聚四氟乙烯消化管中，加入2 ml 13.

51、5 mol L-1的氫氧化鈉溶液，于振蕩器上輕輕振動(dòng)使樣品被氫氧化鈉溶液浸透，然后在110 烘箱水解6 h。水解液用等物質(zhì)的量的乙酸中和，定容于100 ml 容量瓶中，過(guò)0.45 m 的濾膜。采用Waters Symmetry Shield RP18 (3.9150 mm, 5 m )，用乙腈 B ( 0.1 的甲酸) 和水 A (0.1的甲酸)為流動(dòng)相，0.8 ml min-1的流速(柱后分流 0.2 ml min-1進(jìn)質(zhì)譜)，B從10到50梯度洗脫 40 min。以選擇離子檢測(cè)，見(jiàn)圖l0.108。質(zhì)譜條件：采用掃描范圍 150 900 amu，毛細(xì)管電壓3 kv，脫溶劑氣 300 L h-1，采用正離子( ESI)式檢測(cè)，錐孔壓為 40 V。SIR方式檢測(cè)均采用準(zhǔn)分子離子( M+1 )作為檢測(cè)離子。圖10.10 樣品的選擇離子(SIR)色譜圖1. 3 - 一碘