瓊脂糖凝膠電泳

1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 與蛋白質(zhì)分子相類似，核酸分子也是兩性電解質(zhì)。在pH3.5時(shí)，核酸分子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù) 極移動(dòng)；在pH8.08.3時(shí)，堿基幾乎不解離，磷酸全部解 離，核酸分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。v 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是采用瓊脂糖凝膠作為電泳支持物的一種簡(jiǎn)單、快速分離純化和鑒定核酸特別是DNA的方法。v 瓊脂糖瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取出來(lái)的，為一種聚合鏈線性分子。瓊脂糖凝膠的孔經(jīng)較大，主要用于分離較大片段的DNA分子（100bp60kb）。一、電泳基本原理一、電泳基本原理 不同大小和構(gòu)象的核酸分子電荷密度大致相同，在自由泳動(dòng)時(shí)，各核酸分子的遷移率區(qū)別很

2、小，難以分開。但采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構(gòu)象不同的核 酸分子泳動(dòng)率產(chǎn)生較大的差別，則可達(dá)到分離的目的。 DNA片段在凝膠上移動(dòng)的距離在一定范圍內(nèi)是分子質(zhì)量的函數(shù)，分子質(zhì)量越大，移動(dòng)越緩慢。因此，利用瓊脂糖凝膠電泳相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)DNA的移動(dòng)度，可測(cè)定DNA片段的相對(duì)分子質(zhì)量。瓊脂糖凝膠濃度與瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍分子的有效分離范圍膠濃度（）膠濃度（） 線性線性DNA分子大小（分子大?。╧b）0.3 5600.6 1200.7 0.8100.9 0.571.2 0.461.5 0.242.0 0.13二、儀器設(shè)備及材料二、儀器設(shè)備及材料1

3、、電泳裝置：、電泳裝置：包括電泳槽（多采用水平方式）、 膠床和梳子三部分組成。2、穩(wěn)壓電泳儀：、穩(wěn)壓電泳儀：電壓可變范圍0300600V， 電流可變范圍0250500mA。3、紫外線檢測(cè)儀：、紫外線檢測(cè)儀：可產(chǎn)生254、302、366nm 3個(gè) 波段紫外線，并配備防護(hù)眼鏡和5mm厚的黑色 有機(jī)玻璃防護(hù)板。4、照相機(jī)：、照相機(jī)：5、微波爐：、微波爐：6、其它：、其它：三角燒瓶、量筒、膠帶紙、一次性手套等。三、主要試劑三、主要試劑1、瓊脂糖：、瓊脂糖：根據(jù)需要用電泳緩沖液配成不同濃度。 本實(shí)驗(yàn)配制 2 Agrose： 2g Agrose 100ml 0.5TBE EB少許（終濃度0.5g/ml）2

4、、電泳緩沖液：、電泳緩沖液： 常用的緩沖液有TBE、TAE和TPE三種。本實(shí)驗(yàn)選用TBE，先配制5TBE 貯存液：54g Tris堿27.5g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)（或4.65g EDTA）加dd H2O至1000ml。用時(shí)稀釋為0.5TBE。調(diào)pH至8.23、6上樣緩沖液：上樣緩沖液： 4貯存 0.25% 溴酚藍(lán) 0.25% 二甲苯青FF 30 甘油水溶液4、10mg/ml 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）：）：貯存液 在100ml水中加入1g 溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)確保其完全溶解，棕色瓶室溫保存。v 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）染色原理：）染色原理： 溴化乙

5、錠是一種熒光染料，其分子可以嵌入到核酸的堿基對(duì)之間，在紫外線的激發(fā)下，發(fā)出橙色熒光。這是因?yàn)椋涸谧贤饩€照射時(shí)，核酸吸收波長(zhǎng)為254nm的紫外線并將能量傳遞給溴化乙錠；同時(shí)嵌入在核酸堿基間的溴化乙錠吸收302nm和366nm波長(zhǎng)的紫外線，來(lái)自兩方面的能量最終激發(fā)出波長(zhǎng)為590nm的紅橙色可見熒光。v 溴化乙錠用于核酸染色的優(yōu)點(diǎn)：溴化乙錠用于核酸染色的優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)單染色操作簡(jiǎn)單，一般在凝膠中加入終濃度0.5g/ml的EB即可，在電泳過(guò)程中隨時(shí)可以觀察核酸的泳動(dòng)。也可在電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在EB里30分鐘即可。EB染色不會(huì)引起核酸的斷裂染色不會(huì)引起核酸的斷裂，其它染料做不到這 一點(diǎn)。EB染色靈

6、敏度較高染色靈敏度較高，可以檢測(cè)出10ng的DNA樣品。v 溴化乙錠缺點(diǎn)：溴化乙錠缺點(diǎn)： EB是一種強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性。是一種強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性。注意：操作中務(wù)必帶上防護(hù)用手套。如不慎皮膚與溶液接觸，應(yīng)立即用清水徹底沖洗。含溴化乙錠的溶液使用后應(yīng)進(jìn)行凈化處理，使其 致誘變活性下降為原來(lái)的1/200左右，方可丟棄。四、電泳操作步驟四、電泳操作步驟2、膠床準(zhǔn)備：、膠床準(zhǔn)備：取出洗凈并曬干的膠床和梳子，在膠床未封閉的兩端貼上膠布或膠帶紙，形成約58mm的擋墻。將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙。將膠床放在調(diào)整好的水平臺(tái)上。1、凝膠準(zhǔn)備、凝膠準(zhǔn)備：用0.5TBE配制2

7、瓊脂糖凝膠。 稱2g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5TBE； 微波爐加熱大約1分鐘，熔化瓊脂糖；熔化的瓊脂糖自然冷卻到6070時(shí)，加入EB 0.5g/ml，并輕輕混勻。3、鋪膠、鋪膠：將冷卻致60的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度凝膠厚度35mm。4、室溫下靜置、室溫下靜置1小時(shí)左右，凝膠固化。小時(shí)左右，凝膠固化。撕去膠床兩端的膠帶紙，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極。5、向電泳槽中加入、向電泳槽中加入0.5TBE電泳緩沖液電泳緩沖液，以越過(guò)凝膠表面12mm為宜。6、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。 原梳齒處 (樣品孔) 即被緩沖液充滿，如發(fā)現(xiàn)

8、有氣泡，應(yīng)設(shè)法去除。7、樣品準(zhǔn)備：、樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻。8、上樣：、上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中。加樣量一般1030l。9、蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳。、蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳。開始電泳前，再次確認(rèn)凝膠樣品孔處于電場(chǎng)的負(fù)極。電泳條件：電壓15v/cm；時(shí)間1小時(shí)左右。10、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。11、電泳結(jié)果分析：、電泳結(jié)果分析：紫外檢測(cè)儀直接觀察電源條帶；攝影記錄；凝膠成像分析系統(tǒng)處理。五、注意事項(xiàng)：五、注意事項(xiàng)：1、凝膠濃度選擇根據(jù)樣品DNA分子大小而定，所以電泳前應(yīng)對(duì)DNA片段大小有粗略的估計(jì)。2、用膠帶紙封閉膠床兩端時(shí)，要確保嚴(yán)密，以免灌膠時(shí)有膠液漏出。3、用微波爐熔化瓊脂糖時(shí)，應(yīng)控制好時(shí)間，以免突然產(chǎn)生氣泡，使瓊脂糖溢出來(lái)。4、凝