生物免疫分析技術

1、4.1 免疫的原理免疫的原理 Ag + Ab AgAb 特異性、靈敏性特異性、靈敏性 在在Ag，Ab反應中，用容易示蹤的化學物反應中，用容易示蹤的化學物 質標記一種反應物，以了解反應是否發(fā)質標記一種反應物，以了解反應是否發(fā) 生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對 未知成分的樣品進行定性、定位及定量未知成分的樣品進行定性、定位及定量 分析）。分析）。 4.2 酶聯免疫法酶聯免疫法 n免疫酶技術：免疫酶技術：把抗原抗體的免疫反應和酶把抗原抗體的免疫反應和酶 的高效催化作用原理有機地結合起來。它的高效催化作用原理有機地結合起來。它 具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點，

2、具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點， 并克服上述兩種方法的缺點。并克服上述兩種方法的缺點。 n酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長， 免疫酶技術的敏感性接近放射免疫試驗，免疫酶技術的敏感性接近放射免疫試驗， 可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定 量測定，所得結果比較客觀。量測定，所得結果比較客觀。 n酶免疫測定或免疫酶技術是指酶標記抗體或酶酶免疫測定或免疫酶技術是指酶標記抗體或酶 標記抗體進行的抗原抗體反應。標記抗體進行的抗原抗體反應。它主要包括兩它主要包括兩 個方面：個方面： n免疫過氧化物酶法：免疫過氧化物酶法：以過氧

3、化物酶作為標記，以過氧化物酶作為標記， 與抗原或抗體結合，然后根據酶與其底物間所與抗原或抗體結合，然后根據酶與其底物間所 產生的不溶性顏色產物，借助于光學或電子顯產生的不溶性顏色產物，借助于光學或電子顯 微鏡觀察細胞及亞細胞水平的抗原或抗體。微鏡觀察細胞及亞細胞水平的抗原或抗體。 n酶聯免疫吸附法：酶聯免疫吸附法：根據可溶性抗原或抗體與不根據可溶性抗原或抗體與不 溶性固相載體結合后，還保留其免疫活性，結溶性固相載體結合后，還保留其免疫活性，結 合了作為標記的酶催化作用。合了作為標記的酶催化作用。 ELISA的基本原理和方法的基本原理和方法 ELISA的種類和變化的種類和變化 ELISA的特點的

4、特點 ELISA的應用實例的應用實例 ELISA 4.2.1 基本原理基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接， 然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。 測定的對象可以是抗體也可以是抗原。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。 在這種測定方法中有在這種測定方法中有3種必要的試劑：種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）免疫吸附劑） 酶標記的抗原或抗體（酶標記的抗原或抗體（標記物）標記物） 酶作用的底物（酶作用的底物（顯色劑）顯色劑） 測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體

5、上，測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上， 但仍保留其免疫活性，但仍保留其免疫活性， 然后加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯物然后加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯物 （標記物），此偶聯物仍保留其原免疫活性與（標記物），此偶聯物仍保留其原免疫活性與 酶活性，酶活性， 當偶聯物與固相載體上的抗原（抗體）反應當偶聯物與固相載體上的抗原（抗體）反應 結合后，再加上結合后，再加上 酶的相應底物，酶的相應底物， 即起催化水解或即起催化水解或 氧化還原反應而氧化還原反應而 呈顏色。呈顏色。 顏色反應的深淺與相應的抗體或抗原量成正顏色反應的深淺與相應的抗體或抗原量成正 比，因此可借助于顏色反應的深淺來定量

6、抗比，因此可借助于顏色反應的深淺來定量抗 體或抗原。體或抗原。 這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子 顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀） 加以測定。加以測定。 其方法簡單，方便迅速，特異性強。其方法簡單，方便迅速，特異性強。 4.2.2 酶及其底物酶及其底物 酶結合物是酶與抗體或抗原酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作半抗原在交聯劑作 用下聯結的產物。是用下聯結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它成敗的關鍵試劑，它 不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促

7、 反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不 同的底物同的底物 ，將得到不同的顏色反應。，將得到不同的顏色反應。 酶酶 底底 物物顯色反應顯色反應 測定波長測定波長 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 鄰苯二胺鄰苯二胺 四甲替聯苯胺四甲替聯苯胺 氨基水楊酸氨基水楊酸 鄰聯苯甲胺鄰聯苯甲胺 2,22,2- -連胺基連胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻 唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色 黃色黃色 棕色棕色 蘭色蘭色 藍綠色藍綠色 492 460 449 425 642 堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(PNP

8、)(PNP) 萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸鹽磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色 紅色紅色 400 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色 深藍色深藍色 405 420 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG) 硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 熒光熒光 黃色黃色 360,450 420 4.2.3 ELISA的種類和變化的種類和變化 （一）雙抗體夾心法（一）雙抗體夾心法 （二）間接法（二）間接法 （三）競爭法（

9、三）競爭法 （四）雙位點一步法（四）雙位點一步法 （五）捕獲法測（五）捕獲法測IgMIgM抗體抗體 （六）應用親和素和生物素的（六）應用親和素和生物素的ELISAELISA （一）雙抗體夾心法（一）雙抗體夾心法 此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原 步驟：步驟： A 將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗； B 加入待檢標本溶液，使溶液中的抗原與加入待檢標本溶液，使溶液中的抗原與 吸附的抗體結合，溫育后清洗；吸附的抗體結合，溫育后清洗； C 加入酶標記特異性抗體，溫育后清洗；加入酶標記特異性抗體，溫育后清洗； D 加入酶作用底

10、物，產生顯色反應，顏色加入酶作用底物，產生顯色反應，顏色 的改變與所加的待檢標本溶液中的抗原的改變與所加的待檢標本溶液中的抗原 量成正比。量成正比。 間接法是檢測抗體間接法是檢測抗體 最常用的方法，其最常用的方法，其 原理為利用酶標記原理為利用酶標記 的抗抗體以檢測已的抗抗體以檢測已 與固相結合的受檢與固相結合的受檢 抗體，故稱為間接抗體，故稱為間接 法。法。 步驟：步驟： A 將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或 聚乙苯乙烯小珠），經溫育后清洗；聚乙苯乙烯小珠），經溫育后清洗； B 加入待檢稀釋血清，若血清中有相應特異性抗加入待檢稀釋血清，若血清中

11、有相應特異性抗 體存在則與吸附的抗原結合，溫育后清洗；體存在則與吸附的抗原結合，溫育后清洗； C 加入酶標記的抗球蛋白抗體，此時酶標記抗抗加入酶標記的抗球蛋白抗體，此時酶標記抗抗 體與吸附的抗原抗體復合物結合，溫育后清洗；體與吸附的抗原抗體復合物結合，溫育后清洗； D 加入酶作用底物（或稱基質），酶分解底物并加入酶作用底物（或稱基質），酶分解底物并 顯色，用光電比色計測定底物顯色深淺，即可顯色，用光電比色計測定底物顯色深淺，即可 推知抗體量。推知抗體量。 （三）競爭法（三）競爭法 此法可用于檢測小分子抗原。此法可用于檢測小分子抗原。 步驟：步驟： A 將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；

12、將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗； B 將可能含抗原的待檢溶液和酶標記的已知抗原將可能含抗原的待檢溶液和酶標記的已知抗原 溶液以適當比例混合，加入已包被的載體孔中，溶液以適當比例混合，加入已包被的載體孔中， 溫育后清洗；溫育后清洗； C 加入酶作用的底物，產生顯色反應。色深表示加入酶作用的底物，產生顯色反應。色深表示 結合的酶標記抗原多，而待檢溶液中未標記的結合的酶標記抗原多，而待檢溶液中未標記的 抗原量少；反之，色淺表示結合的酶標記抗原抗原量少；反之，色淺表示結合的酶標記抗原 少，而待檢溶液中抗原量多。少，而待檢溶液中抗原量多。 對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充對照管由于只加酶標

13、抗原，與固相抗體充 分結合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程分結合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程 度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結 合的結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑合的結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑 制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合的制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合的 酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應 較弱。較弱。 4.2.4 特點特點 特點一：靈敏性特點一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知, 酶是一種酶是一種 有機催化劑，很少量

14、的酶即可誘導大量的催化反應有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ， 產生可供觀察的顯色反應現象。因此該體系常被稱產生可供觀察的顯色反應現象。因此該體系常被稱 為酶放大體系。為酶放大體系。ELISA實現了在細胞或亞細胞水平實現了在細胞或亞細胞水平 上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納 克水平上對其進行定量?？怂缴蠈ζ溥M行定量。 例如，在測定血清中某一物質的含量時，化學比例如，在測定血清中某一物質的含量時，化學比 色法的敏感度為色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感水平，酶反應測定法的敏感 度約為度約為510g/ml 。 特點

15、二：特異性特點二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗 原抗體的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決原抗體的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決 定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者 在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以 抗原抗體反應具有高度的特異性。抗原抗體反應具有高度的特異性。 例如乙肝病毒中的表面抗原（例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAgHBsAg）、）、e e 抗原（抗原（HBeAgHBeAg）和核心抗體（）和核心抗體（HBcAgHBcAg），雖來源），雖來源 于同一病毒，但僅與

16、其相應的抗體結合，而不于同一病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不 與另外兩種抗體反應?？乖贵w反應的這種特與另外兩種抗體反應?？乖贵w反應的這種特 異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合 物（例如血清）中測定某一特定的物質，而不物（例如血清）中測定某一特定的物質，而不 需先分離待檢物。需先分離待檢物。 ELISAELISA應用實例應用實例 飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中鹽酸克倫特羅的測定 飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素， 簡曲霉毒素簡曲霉毒素 ） 飼料中有害微生物的快速篩檢飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏

17、（如沙門氏 菌菌 ） 甲胺磷殘留分析甲胺磷殘留分析 甲基對硫磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析呋喃丹殘留分析 ELISA在飼料安全檢測中的應用在飼料安全檢測中的應用 ELISA用于農藥殘留的檢測用于農藥殘留的檢測 河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（例如殺暝松（ FN FN ）、）、 甲氟磷酸異已酶（甲氟磷酸異已酶（ SOMAN SOMAN ）、）、 草不綠（草不綠（ Alachor Alachor ）、）、 西維因（西維因（ Carbaryl Carbar

18、yl ）、）、 多菌靈及克菌丹（多菌靈及克菌丹（ Captan Captan ）等。）等。 農藥的檢測農藥的檢測： ELISA ELISA檢測檢測 “非典型肺炎非典型肺炎”冠狀病毒冠狀病毒 ELISA ELISA在結締組織病早期診斷中的應用在結締組織病早期診斷中的應用 檢測抗異質性胞核核糖蛋白檢測抗異質性胞核核糖蛋白A2A2（hnRNPA2hnRNPA2 ）/ /類風濕性關節(jié)炎（類風濕性關節(jié)炎（PtAPtA）3333抗體抗體 ELISAELISA在疾病診斷中的作用在疾病診斷中的作用 ELISA ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體法檢測幽門螺桿菌抗體 ELISAELISA試劑盒商業(yè)資訊試劑盒商業(yè)資訊

19、 ELISA試劑盒試劑盒 酶聯免疫井酶聯免疫井 DNM-9602GDNM-9602G酶標分析儀酶標分析儀 DNM-9602 DNM-9602 標配酶標分析儀標配酶標分析儀 DNM-9602ADNM-9602A酶標分析儀酶標分析儀 幾種酶標分析儀幾種酶標分析儀 4.3 放射免疫法放射免疫法 n放射免疫測定（放射免疫測定（radioimmunoassay，RIA） 是是1959年由年由Berson和和Yalow首先用于糖尿病患首先用于糖尿病患 者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈 敏性和抗原抗體反應的特異性這兩大特點結合起敏性和抗原抗體反應的特異性這

20、兩大特點結合起 來的免疫標記測定技術。來的免疫標記測定技術。 n其優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、精確性好、樣品其優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、精確性好、樣品 用量少，而且不需要復雜的提純步驟。缺點是需用量少，而且不需要復雜的提純步驟。缺點是需 要特殊的儀器設備和一定的防護條件，而且有些要特殊的儀器設備和一定的防護條件，而且有些 同位素標記物的半衰期較短以及試驗廢物難以處同位素標記物的半衰期較短以及試驗廢物難以處 理，對環(huán)境造成放射性污染。理，對環(huán)境造成放射性污染。 放射免疫測定法放射免疫測定法 基本原理基本原理 n放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗 原對有限量抗體

21、進行競爭性結合的基礎上。原對有限量抗體進行競爭性結合的基礎上。 待測抗原是指人體內某種微量活性物質待測抗原是指人體內某種微量活性物質 （如微生物寄生蟲抗原、激素、維生素、（如微生物寄生蟲抗原、激素、維生素、 酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上 述物質標記上放射性同位素，具有示蹤作述物質標記上放射性同位素，具有示蹤作 用。用。 n將標記抗原（將標記抗原（Ag*）和未標記抗原（）和未標記抗原（Ag）與特異性抗體）與特異性抗體 （Ab）相混合，結果形成標記的和未標記的抗原抗體）相混合，結果形成標記的和未標記的抗原抗體 復合物。標記和未標記的抗原競爭與抗體進行結合

22、的現復合物。標記和未標記的抗原競爭與抗體進行結合的現 象，成為競爭性抑制作用。象，成為競爭性抑制作用。 Ag* + Ab Ag*-Ab 標記抗原標記抗原 特異性抗體特異性抗體 標記抗原抗體復合物標記抗原抗體復合物 + Ag 非標記抗原非標記抗原 Ag-Ab 非標記抗原抗體復合物非標記抗原抗體復合物 4. 4 熒光免疫法熒光免疫法 n免疫熒光技術是根據抗原抗體反應具有高度的免疫熒光技術是根據抗原抗體反應具有高度的 特異性，以熒光素（常用的有異硫氰酸熒光黃特異性，以熒光素（常用的有異硫氰酸熒光黃 FITC和羅丹明和羅丹明RB200)作為標記物，與已知抗作為標記物，與已知抗 體結合。然后將熒光素標記

23、的抗體作為標準試體結合。然后將熒光素標記的抗體作為標準試 劑，用于鑒定未知的抗原，可在熒光顯微鏡下劑，用于鑒定未知的抗原，可在熒光顯微鏡下 檢查呈現熒光的特異性抗原抗體復合物及其存檢查呈現熒光的特異性抗原抗體復合物及其存 在部位。在部位。 4.2 酶聯免疫法酶聯免疫法 n免疫酶技術：免疫酶技術：把抗原抗體的免疫反應和酶把抗原抗體的免疫反應和酶 的高效催化作用原理有機地結合起來。它的高效催化作用原理有機地結合起來。它 具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點，具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點， 并克服上述兩種方法的缺點。并克服上述兩種方法的缺點。 n酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長， 免疫酶技術的敏感性接近放射免疫試驗，免疫酶技術的敏感性接近放射免疫試驗， 可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定 量測定，所得結果比較客觀。量測定，所得結果比較客觀。 n酶免疫測定或免疫酶技術是指酶標記抗體或酶酶免疫測定或免疫酶技術是指酶標記抗體或酶 標記抗體進行的抗原抗體反應。標記抗體進行的抗原抗體反應。它主要包括兩它主要包括兩 個方面：個方面： n免疫過氧化物酶法：免疫過氧化物酶法：以過氧化物酶作為標記，以過氧化物酶作為標記， 與抗原或抗體結合，然后根據酶與其底物間所與抗原或抗體結合，然后根據酶與其底物間所