污染肝素中多硫酸化硫酸軟骨素的分步醋酸纖維素薄膜電泳分析

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減污染肝素中多硫酸化硫酸軟骨素的分步 醋酸纖維素薄膜電泳分析（作者：?jiǎn)挝唬亨]編：）作者：王皓 于廣利趙峽郝翠胡艷南殷秀紅【摘要】 采用離子交換色譜法從污染肝素原料中分離出多硫酸化硫 酸軟骨素（OSCS）,建立了分步醋酸纖維素薄膜電泳法分析污染肝素中OSC洽量的方法。結(jié)果表明，先以0.05 mol/L醋酸鋇緩沖液（pH 5.0）電泳，再以0.15 mol/L醋酸鋅緩沖液（pH 6.3）電泳，可以將肝素和 OSC完全分開(kāi)，檢出限為0.1 g/L;通過(guò)灰度積分建立定量校準(zhǔn)曲線(xiàn)，相關(guān)系數(shù)為0.9934，平均回收率為102.1%106.1%; RSD為4.1% 6.0%

2、?！娟P(guān)鍵詞】 肝素，硫酸軟骨素，醋酸纖維素薄膜電泳1引言肝素（heparin , HP）作為抗凝劑在臨床中廣泛應(yīng)用1,2,其常見(jiàn) 的不良反應(yīng)僅為出血或血小板減少。2008年初，美國(guó)臨床應(yīng)用的HP 注射劑發(fā)生了較嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，推測(cè)可能與HP原料中含有多硫酸化硫酸軟骨素（oversulfated chondroitin sulfate , OSCS有關(guān)3, 但缺乏足夠的證據(jù)。為了加強(qiáng)該類(lèi)原料質(zhì)量監(jiān)督，建立一種快速有效 的檢測(cè)HP中OSCS勺方法十分必要。目前，檢測(cè) HP的常用方法主要 有生物學(xué)方法4、分光光度法5,6、光散射法7、電化學(xué)分析法 8、HPLC法9以及毛細(xì)管電泳法10等。但由于OSC

3、S和HP結(jié)構(gòu) 十分相似，常規(guī)的生物學(xué)方法難以對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)， 而毛細(xì)管電泳（CE） 和核磁共振（NMR等方法3,11雖然可以用于OSCS僉測(cè)，但存在設(shè)備 昂貴、分析時(shí)間長(zhǎng)以及操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。本研究采用離子交換色譜法從污染的肝素鈉原料（con tami natedheparin , CHP）中分離得到 OSCS并通過(guò)1H NMF確證了其結(jié)構(gòu)。在 分析比較了不同緩沖液體系中 OSCS昔酸纖維素薄膜電泳行為的基礎(chǔ) 上，建立了醋酸頓|醋酸鋅分步電泳法。本方法可將OSCS HP和其 它糖胺聚糖有效分離，并可對(duì) OSCS進(jìn)行定量分析，達(dá)到了快速檢測(cè) HP中雜質(zhì)的目的。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑AKTAFPL

4、C快速蛋白純化系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）;Elx 808酶標(biāo)儀（美 國(guó)Bio Tek公司）;3000 xi 電泳儀（美國(guó)Bio Rad公司）;DYCP 38B 臥式水平電泳槽及 WD 9404超級(jí)加樣器（北京六一公 司）;BIO ： CAPT200M凝膠采集系統(tǒng)（美國(guó)SIM公司）;Gel Pro Analyzer 軟件（美國(guó) Media Cybernetics 公司）;Jeol JNMECP600 MHz 超導(dǎo)核磁共振波譜儀（日本電子株式會(huì)社）。透明質(zhì)酸（HA,來(lái)源于鏈霉菌）、硫酸軟骨素A（CS A,來(lái)源于牛 氣管）、硫酸軟骨素 C（CS C,來(lái)源于鯊魚(yú)軟骨）、硫酸皮膚素（DS,來(lái)源于豬腸粘膜）、硫

5、酸乙酰肝素（HS,來(lái)源于牛腎臟）、肝素（HP,來(lái) 源于豬腸粘膜）等糖胺聚糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Sephadex G10 凝膠（Super fine，瑞典 Pharmacia Biotech 公司）;Q Sepharose Fast Flow凝膠（美國(guó)GE公司）;醋酸纖維素薄膜（硬膜，9 cmx 7 cm,北京 六一公司）;其它試劑均為分析純；所用水均經(jīng) Millipore純水儀過(guò)濾。2.2污染肝素中多硫酸軟骨素的分離純化采用 Q Sepharose Fast Flow（XK 12 cm x 1.0 cm , i.d.） 離子 交換柱分別對(duì)HP標(biāo)準(zhǔn)品、CHP進(jìn)行分離，依次以雙蒸水和0.

6、4, 0.6, 0.8, 1.2和2.0 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度各洗脫 2倍柱 體積，分部收集（2 mL/管）并用硫酸 咔唑法12逐管檢測(cè)，合并收 集含糖組分，經(jīng)Sephadex G10脫鹽后冷凍干燥，備用。2.3 1H，NMR寸雜質(zhì)成分的分析13將30 mg HP標(biāo)準(zhǔn)品及分離所得雜質(zhì)以0.5 mL重水溶解，凍干， 重復(fù)3次，以0.5 mL重水溶解，以0.5% 2,2丨二甲基 2|硅戊基5磺酸鈉（DSS）為內(nèi)標(biāo)，在25 C采用核磁共振波譜儀測(cè)定。2.4電泳方法電泳緩沖液1為0.05 mol/L醋酸鋇（pH 5.0）;電泳緩沖液2為 0.15 mol/L 醋酸鋅（pH 6.3

7、）;電泳緩沖液3為0.1 mol/L 吡啶 0.47 mol/L 甲酸（pH 3.0）。將醋酸纖維素薄膜用50%?醇溶液浸泡過(guò)夜，電泳前用濾紙吸去 其表面的甲醇溶液，置于電泳緩沖液中浸泡約20 min。用濾紙吸去薄膜表面的電泳緩沖液，分別吸取 10卩L標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液于超級(jí) 加樣器孔中，用加樣器點(diǎn)樣(0.5卩L)，置于電泳槽中平衡10 min。 分別采用醋酸鋇、醋酸鋅和吡啶甲酸3種電泳緩沖液，在如下條件進(jìn)行電泳：0.05 mol/L 醋酸鋇(pH 5.0)，電流6 mA,電泳時(shí)間35min;0.15 mol/L 醋酸鋅(pH 6.3)，電流 8 mA,電泳時(shí)間 35 min;0.1 mol/L

8、吡啶擬0.47 mol/L甲酸(pH 3.0),電流7 mA電泳時(shí)間20 min。電泳結(jié)束后用0.5%(w/V)阿利新藍(lán)染色約20 min，再以2%昔酸溶液 脫色至本底為白色。2.5實(shí)驗(yàn)方法分別取OSCS口 CHP適量，將OSC依次配制成0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 和5.0 g/L 水溶液，CHF配制成5.0 g/L 水溶液，按 上述方法進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將所有電泳條帶采用 Gel Pro Analyzer凝膠定量分 析軟件進(jìn)行灰度積分，建立 OSCS的濃度 灰度積分值關(guān)系曲線(xiàn)，并 且按照該曲線(xiàn)計(jì)算CHP中 OSCS勺含量。3結(jié)果與討論3.1 HP標(biāo)準(zhǔn)

9、品和CHP的離子交換色譜分析由于HP和OSCS勻帶有負(fù)電荷，并且其電荷密度不同，可以通過(guò) 陰離子交換色譜，以逐漸增大的離子強(qiáng)度將 HP和OSCS離。HP標(biāo) 準(zhǔn)品和CHP在 Q Sepharose Fast Flow 離子交換柱的NaCI梯度洗脫 曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。()肝素(HP); (* )污染肝素(CHP); (-) NaCl.由圖1可見(jiàn),HP標(biāo)準(zhǔn)品在0.8 mol/L和1.2 mol/L NaCI兩個(gè)梯度中各洗脫出一個(gè)峰，后一個(gè)峰所占比例較大；在2.0 mol/L處未見(jiàn)有糖峰。CHP在 0.8 mol/L和1.2 mol/L NaCI處洗脫曲線(xiàn)與HP標(biāo)準(zhǔn)品相似，但是在2.0 mol/L處則有一個(gè)

10、新峰出現(xiàn)，將此峰標(biāo)記為 CHP 3。通過(guò)與HP的洗 脫曲線(xiàn)比較，認(rèn)定CHP 3峰為CHP中的雜質(zhì)成分。為了進(jìn)一步對(duì)雜 質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，采用 Q Sepharose Fast Flow 柱(20 cm x 2.6 cm) 為制備柱對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分離，收集 2.0 mol/L NaCl洗脫出的組分，濃 縮后以Sephadex G10柱(95 cm x 2.6 cm)脫鹽，凍干。對(duì) CHP 3的 單糖組成分析表明，其含有大量氨基半乳糖和葡萄糖醛酸，符合硫酸 軟骨素類(lèi)物質(zhì)的單糖組成特征；同時(shí)1H NMR的研究也表明其含有氨 基半乳糖，通常HP中乙酰氨基葡萄糖的甲基氫信號(hào)在 2.03 ,而OSCS 中乙酰氨

11、基半乳糖甲基氫信號(hào)在 2.122.15。通過(guò)與HP標(biāo)準(zhǔn)品比較 并結(jié)合文獻(xiàn)3,11 , CHP 3在2.13有強(qiáng)信號(hào)，表明其為 OSCS 圖2 CHP 3(a)與 HP(b)的 1H NMF圖譜3.2醋酸纖維素薄膜電泳法檢測(cè)HP中OSCS采用醋酸鋇14、醋酸鋅15、吡啶 甲酸163種電泳緩沖體 系進(jìn)行醋酸纖維素薄膜電泳分析，并對(duì)緩沖液離子強(qiáng)度、電流大小、 電泳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，其最佳電泳條件分別為：0.05 mol/L醋酸鋇(pH5.0)，電流 6 mA,電泳時(shí)間 35 min;0.15 mol/L醋酸鋅(pH 6.3),電流8 mA,電泳時(shí)間35 min;0.1 mol/L 吡啶 0.47 mol

12、/L 甲酸(pH 3.0)，電流7 mA電泳時(shí)間20 min。CHF和HP等糖胺聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在 3種優(yōu)化后電泳條件下的電泳圖見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，在 Ba(Ac)2緩沖液中(圖3a), HP和CHP均分成了兩條帶，一條與 HS遷移率相似，另一條則分布在點(diǎn)樣處， 而OSCS則幾乎全部分布在原點(diǎn)；此外,HP在原點(diǎn)的條帶顏色很淺， 但CHP的條帶顏色比HP深許多。在Zn(Ac)2緩沖液(圖3b)中，CHP 未能分成界線(xiàn)清晰的兩條帶，但是同HP和OSCS相比，在HP的下沿處多出了一條和OSC9目似的條帶。在吡啶 甲酸緩沖液中(圖3c)， CHP也未能分成界線(xiàn)清晰的兩條帶，而且在HP的上沿處可見(jiàn)到一條與OS

13、CS相似的條帶。上述結(jié)果表明，在對(duì)傳統(tǒng)電泳方法優(yōu)化的條件 下，雖然能將6種糖胺聚糖進(jìn)行分離，但均不能實(shí)現(xiàn)HP與OSCS全 分離。在對(duì)類(lèi)肝素樣品的分步電泳研究中，鄧崗等17采用分步電泳法分離尿液中海洋硫酸多糖，即先用0.1 mol/L Zn(Ac)2緩沖溶液(pH6.0)，再用1.0 mol/L Ba(Ac)2 緩沖溶液(pH 5.0)分離，但該方法同 樣不能將HP和OSCS進(jìn)行分離。a. 0.05 mol/L Ba(Ac)2(pH 5.0), 6 mA, 35 min;b. 0.15 mol/LZn(Ac)2(pH 6.3), 8 mA, 35 min; c. 0.1 mol/L pyridi

14、ne Q0.47 mol/L formic acid(pH 3.0),7 mA, 20 min; d. 0.05 mol/L Ba(Ac)2, 6 mA,2 min then 0.15 mol/L Zn(Ac)2, 8 mA, 30 min。1.透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA);2.硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS);3.硫酸皮膚素(dermatan sulfate, DS);4.硫酸軟骨素 A(chondroitinsulfate, CSA);5.硫酸軟骨素 C(chondroitin sulfate, CSC);6. 肝素(heparin, HP);7

15、.污染肝素(contaminated heparin, CHP);8.多硫酸化硫酸軟骨素(oversulfated chondroitin sulfate, OSCS).本研究嘗試了上述各種電泳體系的分步電泳條件，最終確定了將HP與OSCS效分離的分步電泳條件：首先以Ba(Ac)2緩沖液浸泡醋酸纖維素薄膜20 min,點(diǎn)樣后平衡5 min,并在該電泳緩沖液中電泳2 min; 然后將膜取出，更換為Zn(Ac)2緩沖液并平衡5 min，電泳30 min。 在此分步電泳條件下，CHP分成了 3條清晰的條帶(圖3d)，其中有2 條與HP致，而最下方的條帶與OSCS-致，實(shí)現(xiàn)了 OSCSf HP完全 的

16、分離。3.3 OSCS醋酸纖維素薄膜電泳灰度積分曲線(xiàn)的建立為了對(duì)CHP中 OSCS進(jìn)行定量分析，本研究采用灰度積分的方法 對(duì)不同濃度 OSCS(O.O5, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和 5.0 g/L)的灰度值和含量線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行了測(cè)定。將不同濃度OSC豉上述分步電泳方法進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將所有電泳條帶采用Gel ProAnalyzer凝膠定量分析軟件進(jìn)行灰度積分，以O(shè)SCS度(X，g/L)與灰度值(Y)作圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OSCS勺醋酸纖維素薄膜電泳檢出限為0.1 g/L;線(xiàn)性分析范圍為0.15.0 g/L。研究還發(fā)現(xiàn)，不同的濃度范圍 應(yīng)建立不同的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。OSCS

17、i 0.11.0 g/L范圍內(nèi)線(xiàn)性方程和相 關(guān)系數(shù)為 Y=207.61X-12.354 和 r=0.9934，而在 1.0 5.0 g/L 范圍 內(nèi)線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)為 Y=779.97X-689.01和r=0.9917。3.4 OSCS回收率和精密度的測(cè)定配制濃度為0.50, 0.70, 1.60 和2.20 g/L OSCS水溶液，按上 述分步電泳方法進(jìn)行電泳和灰度積分， 平行操作5次。根據(jù)其灰度值 來(lái)確定選用的線(xiàn)性方程，然后以相應(yīng)的線(xiàn)性方程計(jì)算回收率和精密度(表1)。表1回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Sample NO.A1A2A3B1B2B3C1C2 濃 度 Co nee ntrat

18、i on (g/L)-1.411.12-0.411.00含量Percentage(%)-28.222.4-8.220.0“- ” 未檢出(not detected)。由表1可見(jiàn)，不同濃度 OSCS勺回收率在102.1%106.1%之間；RSD 為4.1%6.0%。其回收率和精密度較好，可用于常規(guī) OSCS性與定 量分析。3.5污染樣品中OSCS勺檢測(cè)將來(lái)自不同廠家的8批HP原料和OSC際準(zhǔn)品分別配成5.0和 4.0 g/L水溶液，按上述電泳方法進(jìn)行電泳和灰度積分，以外標(biāo)法定 量，每個(gè)樣品平行測(cè)3次，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)，有4批樣品檢 測(cè)到OSCS其含量為8%28%其中廠家A的2批樣品和廠家C

19、的兩 批樣品均檢出了較高的OSCS尤其A2中OSC洽量高達(dá)28%而廠家 B的3批樣品均未檢出OSCS表明其質(zhì)量較好。綜上可見(jiàn)，醋酸纖維素薄膜分步電泳法不僅快速簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度高(檢出限0.1 g/L)，還可以進(jìn)行定量分析，尤其可以同時(shí)檢測(cè)多 個(gè)樣品，簡(jiǎn)便快速、成本消耗低，可以作為HP生產(chǎn)廠以及國(guó)家藥檢部門(mén)HP原料藥質(zhì)量控制的常規(guī)檢測(cè)方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Capila I, Li nhardt R J. An gew. Chem. I nt. Ed., 2002,41(3): 391 4122 Lin hardt R J. Chem. I nd., 1991: 245 503 Kishimoto

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