分子生物學常用技術PCR

1、分子生物學常用技術分子生物學常用技術 u 凝膠電泳凝膠電泳 u 分子雜交技分子雜交技 術術 u PCR PCR 技術技術 DNA DNA 物理圖譜物理圖譜 DNADNA序列測定序列測定 生物芯片生物芯片 “基因靶向基因靶向”技術技術 RNA干擾干擾技術技術 PCR 內(nèi)容包括內(nèi)容包括: PCR 技術的技術的發(fā)發(fā)明明 PCR 擴增產(chǎn)物的分析擴增產(chǎn)物的分析 PCR 技術基本原理技術基本原理 PCR 條件優(yōu)化條件優(yōu)化 PCR 反應體系反應體系 PCR 技術的發(fā)展史技術的發(fā)展史 PCR 反應條件反應條件 PCR 技術的應用技術的應用 (請自學) u PCR PCR 技術技術 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(P

2、olymerase Chain Reaction ,PCR)(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 體外體外核酸擴增技術將目的基因或某一核酸擴增技術將目的基因或某一DNADNA片段于數(shù)小時片段于數(shù)小時 內(nèi)內(nèi)體外體外擴增至百萬倍擴增至百萬倍, ,千萬倍。千萬倍。 PCR PCR技術是生物醫(yī)學領域技術是生物醫(yī)學領域: : 革命性創(chuàng)舉革命性創(chuàng)舉和和里程碑。里程碑。 迅速滲透到各個領域迅速滲透到各個領域: : 分子克隆、分子克隆、 目的基礎檢測目的基礎檢測 、基因診斷、基因表達調控、基因診斷、基因表達調控, ,、 法醫(yī)學鑒定、食品衛(wèi)生法醫(yī)學鑒定、食品衛(wèi)生 , ,、環(huán)境監(jiān)測考古

3、學等。、環(huán)境監(jiān)測考古學等。 簡便、特異、快速、靈敏、產(chǎn)率高、簡便、特異、快速、靈敏、產(chǎn)率高、 重復重復 性好、易自動化等性好、易自動化等 可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴 增出足量的增出足量的DNADNA供分析研究和檢測鑒定，用供分析研究和檢測鑒定，用PCRPCR幾幾 小時便可完成。小時便可完成。 DNA DNA克隆重組克隆重組, PCR, DNA, PCR, DNA序列分析序列分析構成了整構成了整 個分子生物學實驗工作的基礎。個分子生物學實驗工作的基礎。 PCR PCR 特點特點: : RT-PCR RAPD-PCRRandom Amplifica

4、tion of Polymorphic DNA. DDRT-PCR差異顯示反轉錄PCR LAM-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Multiplex PCR Anchored PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR Recombinant PCR SSCP In situ PCR Flow chip PCR 技術 請自學 ( (一一): PCR): PCR技術的發(fā)明技術的發(fā)明 19711971年年: : Korana Korana 設想設想 本世紀本世紀6060年代末、年代末、7070年代

5、初人們致力于研究基因年代初人們致力于研究基因 的體外分離技術，的體外分離技術，KoranaKorana于于19711971年最早提出核酸體外擴年最早提出核酸體外擴 增的設想：增的設想： “經(jīng)過經(jīng)過DNADNA變性，與合適的引物雜交，用變性，與合適的引物雜交，用DNADNA聚合聚合 酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNAtRNA基因基因”。 1983年年: Kary B. Mullis (1944 -) 在在CetusCetus公司工作期間，公司工作期間， 他原本是要合成他原本是要合成DNADNA引物來進行引物來進行 測序工作，測序工作， 常為沒有足夠多

6、的模板常為沒有足夠多的模板DNADNA而煩惱。一天晚上，他而煩惱。一天晚上，他 開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用引物去擴增模板引物去擴增模板DNA DNA 的想的想 法法. MullisMullis開車的時候開車的時候, , 瞬間感覺兩排路燈就是瞬間感覺兩排路燈就是DNADNA的兩條鏈，自己的兩條鏈，自己 的車和對面開來的車象是的車和對面開來的車象是DNADNA聚合酶，面對面地合聚合酶，面對面地合DNADNA， 19851985年年: Mullis PCR: Mullis PCR設想的實現(xiàn)設想的實現(xiàn) 原理類似于原理類似于DNADNA的體內(nèi)復制，只是在試管中給的體內(nèi)復制，

7、只是在試管中給DNADNA的體的體 外合成提供外合成提供: : 摸板摸板DNA DNA 、寡核苷酸引物、寡核苷酸引物、DNADNA聚合酶、合聚合酶、合 適的緩沖體系、適的緩沖體系、DNADNA變性、復性及延伸的溫度與時間。變性、復性及延伸的溫度與時間。 MullisMullis使用是大腸桿菌使用是大腸桿菌 DNA DNA 聚合酶聚合酶 I I 的的KlenowKlenow片片 段段. . 缺點是：缺點是： 1): 1): KlenowKlenow酶酶不耐高溫不耐高溫， 9090會變性失活，每次循會變性失活，每次循 環(huán)都要重新加。環(huán)都要重新加。 2): 2): 特異性差特異性差: : 引物鏈延伸

8、反應在引物鏈延伸反應在3737下進行，模板下進行，模板 和引物之間的堿基錯配，合成的和引物之間的堿基錯配，合成的DNADNA片段不均一。片段不均一。 19881988年年: : KeohanogKeohanog 改用改用T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶進行進行PCRPCR，擴增的，擴增的DNADNA片段均一，片段均一， 特異性高特異性高。但。但不耐高溫不耐高溫, , 每循環(huán)一次，仍需加入新酶。每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 19881988年年Saiki Saiki 等等: : 從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌( (t thermushermus aqaquatic

9、usuaticus) ) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNADNA聚合酶聚合酶: : 耐高溫耐高溫， 9393下反應下反應2h2h后其殘留活性是原來的后其殘留活性是原來的60%60%，在，在952h952h后后 殘留活性殘留活性: 40%. 1): 40%. 1):不必在每次擴增反應后再加新酶不必在每次擴增反應后再加新酶; ; 2):2):大大提高了大大提高了特異性特異性, , 擴增效率和靈敏性擴增效率和靈敏性，增加了擴，增加了擴 增長度增長度(2.0Kb)(2.0Kb)。 此酶命名為此酶命名為TaqTaq DNA DNA多聚酶多聚酶( (TaqTaq DNA Polymerase) DN

10、A Polymerase)。 TaqTaq DNA DNA多聚酶的發(fā)現(xiàn)使多聚酶的發(fā)現(xiàn)使PCRPCR得以廣泛應用。得以廣泛應用。 19931993年年: : MulisMulis 眾望所歸地獲得了眾望所歸地獲得了諾貝爾化學獎諾貝爾化學獎， 他所取得的成就是發(fā)明了他所取得的成就是發(fā)明了PCRPCR技術。技術。 1998-1999年年: Bill Clinton 唯一一個在全美國人面前就自己的唯一一個在全美國人面前就自己的性丑聞事性丑聞事 件件道歉的美國總統(tǒng)道歉的美國總統(tǒng), , 因為因為 1): 1): 有了有了 PCRPCR技術技術, 2):, 2): 不懂不懂PCRPCR技術。技術。 1998

11、1998年，美國總統(tǒng)比爾年，美國總統(tǒng)比爾克林頓曾當眾宣稱，克林頓曾當眾宣稱， 他與白宮實習生萊溫斯基他與白宮實習生萊溫斯基“沒有發(fā)生任何性關系沒有發(fā)生任何性關系”， 但萊溫斯基隨后出示了一條沾有克林頓精液的藍裙但萊溫斯基隨后出示了一條沾有克林頓精液的藍裙 子。子。8 8個月后，克林頓不得不被迫承認錯誤個月后，克林頓不得不被迫承認錯誤 一樣的一樣的PCR、一樣的美國人、一樣的美國人 ( (二二): PCR): PCR技術基本原理技術基本原理 PCRPCR由由變性變性-退火退火-延伸延伸三個基本反應步驟構成：三個基本反應步驟構成： 1): 1): 模板模板DNADNA的的變性變性：模板：模板DNA

12、DNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至9494左右后，雙鏈左右后，雙鏈 DNADNA變性為單鏈變性為單鏈DNA DNA ； 2): 2): 模板模板DNADNA與引物的與引物的退火退火( (復性復性) )：溫度降至：溫度降至5555左右，引左右，引 物與模板物與模板DNADNA單鏈的互補序列配對結合；單鏈的互補序列配對結合； 3): 3): 引物的引物的延伸延伸：DNADNA模板模板-引物結合物在引物結合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的聚合酶的 作用下，以作用下，以dNTPdNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保 留復制原理，合成一條新的與模板留復制原理

13、，合成一條新的與模板DNA DNA 鏈互補的鏈互補的半保留復制鏈半保留復制鏈 重復循環(huán)變性重復循環(huán)變性-退火退火-延伸三過程延伸三過程，就可獲得更多的，就可獲得更多的“半保半保 留復制鏈留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一 個循環(huán)需個循環(huán)需2 24 4分鐘，分鐘， 2 23 3小時就能將目的基因擴增放大幾百萬小時就能將目的基因擴增放大幾百萬 倍。倍。 PCRPCR的反應動力學的反應動力學 PCRPCR的三個反應步驟反復進行，使的三個反應步驟反復進行，使DNADNA擴增量呈指數(shù)擴增量呈指數(shù) 上升。最終的上升。最終的DNA DNA

14、擴增量可用下列公式計算擴增量可用下列公式計算 Y Y(1(1X)X)n n Y Y代表代表DNADNA片段擴增后的拷貝數(shù)，片段擴增后的拷貝數(shù)，X X表示平表示平(Y)(Y)均每次均每次 的擴增效率，的擴增效率，n n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值 為為100%100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。，但在實際反應中平均效率達不到理論值。 產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺期產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺期 Theoretical increase Log Target DNA Cycle # Reality Y(1X)n 反應初期，靶序列反應初期，靶序列DNADNA片段的增

15、片段的增 加呈指數(shù)形式，隨著加呈指數(shù)形式，隨著PCRPCR產(chǎn)物的逐漸產(chǎn)物的逐漸 積累，被擴增的積累，被擴增的DNA DNA 片段而進入線性片段而進入線性 增長期或靜止期，增長期或靜止期， 即出現(xiàn)即出現(xiàn)“停滯效停滯效 應應” ” ，這種效應稱平臺期，這種效應稱平臺期(Plateau).(Plateau). ( (引物、引物、 dNTPdNTP反應原料消耗、反應原料消耗、 PCR PCR 擴增效率及擴增效率及DNADNA聚合酶種類和活聚合酶種類和活 性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素) )。 大多數(shù)情況下，平臺期的到來是大多數(shù)情況下，平臺期的到來是 不可避免的。到達平臺期所需

16、循環(huán)次不可避免的。到達平臺期所需循環(huán)次 數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCRPCR擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物 長片段產(chǎn)物長片段產(chǎn)物 短片段產(chǎn)物短片段產(chǎn)物 長片段產(chǎn)物和短片段產(chǎn)物是由于引物所結合的模板不一長片段產(chǎn)物和短片段產(chǎn)物是由于引物所結合的模板不一 樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中， 以兩條互補的以兩條互補的DNADNA為模板，引物是向為模板，引物是向33端開始延伸，端開始延伸， 其其55端端 是固定的，是固定的，3 3 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長長 產(chǎn)物片段

17、產(chǎn)物片段”。 進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新 合成的鏈合成的鏈( (即即“長產(chǎn)物片段長產(chǎn)物片段”) )結合。引物在與新鏈結合時，結合。引物在與新鏈結合時， 由于新鏈模板的由于新鏈模板的55端序列是固定的，端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片這就等于這次延伸的片 段段33端被固定了止點，端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限定于保證了新片段的起點和止點都限定于 引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段短產(chǎn)物片段”。 短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個

18、引物鏈55端之間，端之間， 是需要擴增的特定片段。是需要擴增的特定片段。 “ “短產(chǎn)物片段短產(chǎn)物片段”按按指數(shù)倍數(shù)增加指數(shù)倍數(shù)增加 “ “長產(chǎn)物片段長產(chǎn)物片段”以以算術倍數(shù)增加（原始模板算術倍數(shù)增加（原始模板 拷貝拷貝X X 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)， 幾乎可以忽略不計，幾乎可以忽略不計， 這使這使 得得PCRPCR的反應產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠的反應產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠 純純DNADNA片段供分析與檢測用。片段供分析與檢測用。 Y(1X)n PCR 原理原理 演示演示 : (三三): PCR反應體系反應體系 標準的標準的PCR反應體系：反應體系： Total volume 100ul

19、(20-100ul) 10擴增緩沖液擴增緩沖液 10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 各各10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul PCRPCR反應五要素：反應五要素： 引物、引物、TaqTaq酶、酶、dNTPdNTP、模板、模板、 MgMg2+ 2+ 1: 1: 引物：引物： 引物是引物是PCRPCR特異性反應的關鍵特異性反應的關鍵 PCR PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNADNA互補的互補的 程度。理論上

20、，只要知道任何一段模板程度。理論上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，序列， 就就 能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCRPCR就可就可 將模板將模板DNADNA在體外大量擴增在體外大量擴增. . 引物量：引物量： 每條引物的濃度每條引物的濃度1010100pmol100pmol，以最低，以最低 引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起 錯配錯配, , 非特異性擴增和二聚體的機會。非特異性擴增和二聚體的機會。 設計引物應遵循以下原則：設計引物應遵循以下原則： 1): 1): 引物長度：引物長度：

21、 15-30bp15-30bp，常用為，常用為20bp20bp左右。左右。 2): PCR2): PCR產(chǎn)物：產(chǎn)物： 200-500bp200-500bp，可擴增長至，可擴增長至30kb30kb的片段。的片段。 3): 3): 引物堿基：引物堿基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%，G+CG+C太少擴增效果不佳，太少擴增效果不佳， G+CG+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGCATGC最好隨機分布，避免最好隨機分布，避免4 4個個 單一堿基的連續(xù)出現(xiàn)。單一堿基的連續(xù)出現(xiàn)。 4): 4): 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構

22、，避免兩條引物間互補，特別 是是33端的互補，否則會形成引物端的互補，否則會形成引物二聚體二聚體。 3 5 3 5 3 5 3 5 Stable Interaction Amplification Primer Dimers 5): 5): 引物引物33端的堿基應嚴格要求配對端的堿基應嚴格要求配對，以避免因末端堿基，以避免因末端堿基 不配對而導致不配對而導致PCRPCR失敗。失敗。 6): 6): 引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無 明顯同源性明顯同源性. . 7): 7): 引物引物55端加上合適的酶切位點，這對被擴增的靶序列端加

23、上合適的酶切位點，這對被擴增的靶序列 的酶切分析或分子克隆很有好處。在算的酶切分析或分子克隆很有好處。在算TmTm值時不算值時不算, , 但但 在檢測互補和二級結構是要加上它們在檢測互補和二級結構是要加上它們 8): 8): 使用兼并引物時使用兼并引物時, , 要參考密碼子使用表要參考密碼子使用表, ,注意生物的注意生物的 偏好性偏好性, ,不要在不要在33端使用兼并引物端使用兼并引物, ,并使用并使用 較高的引物較高的引物 濃度濃度(1uM-3uM) (1uM-3uM) 9): 9): 最好學會使用一種最好學會使用一種design software. PP5, Oligo6, design

24、software. PP5, Oligo6, DNAstarDNAstar, Vector NTI, Online, Vector NTI, Online desgindesgin et al. et al. 設計引物應遵循以下原則設計引物應遵循以下原則續(xù)： 2: 2: 酶及其濃度酶及其濃度 兩種兩種TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶: : 1): 1):一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶 2): 2): 基因工程酶基因工程酶 催化一典型的催化一典型的PCRPCR反應約需酶量反應約需酶量: 2.5U(: 2.5U(總反應體積為總反應體積為 100ul)1

25、00ul) 濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物 量減少。量減少。 3: 3: dNTPdNTP的質量與濃度的質量與濃度 dNTPdNTP的質量與濃度和的質量與濃度和PCRPCR擴增效率有密切關系，擴增效率有密切關系， dNTPdNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性 。用。用1M 1M Tris.HCLTris.HCL的緩沖液的緩沖液7.07.07.57.5配成高濃度后，小配成高濃度后，小 量分裝，量分裝， -20-20冰凍保存。多次凍融會使冰凍保存。多次凍融會使dNTPdNTP降解。

26、降解。 在在PCRPCR反應中，反應中，dNTPdNTP應為應為5050200umol/L200umol/L，4 4種種dNTPdNTP 的濃度要相等，如其中任何一種濃度偏高或偏低，就的濃度要相等，如其中任何一種濃度偏高或偏低，就 會引起錯配。濃度過低又會降低會引起錯配。濃度過低又會降低PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTPdNTP 能與能與MgMg2+ 2+結合，使游離的 結合，使游離的MgMg2+ 2+濃度降低。 濃度降低。 4: 4: 模板核酸模板核酸 DNA DNA 粗制品及總粗制品及總RNARNA均可作為擴增模板均可作為擴增模板 模板核酸的量與純化程度，是模板核酸的量與純化程度

27、，是PCRPCR成敗與否的關成敗與否的關 鍵環(huán)節(jié)之一。鍵環(huán)節(jié)之一。 一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解 細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基 因游離，直接用于因游離，直接用于PCRPCR擴增。擴增。 RNA RNA模板提取一般采用模板提取一般采用KitKit提取，要防止提取，要防止RNaseRNase降降 解解RNARNA，。，。 5: Mg5: Mg2+ 2+濃度 濃度 Mg Mg2+ 2+對 對PCRPCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在 一般的一般

28、的PCRPCR反應中，各種反應中，各種dNTPdNTP濃度為濃度為200umol/L200umol/L時，時， MgMg2+ 2+濃度為 濃度為1.51.52.0mmol/L2.0mmol/L為宜。為宜。 Mg2+ Mg2+濃度濃度過高過高，反應，反應特異性降低特異性降低，出現(xiàn)非特異擴，出現(xiàn)非特異擴 增。增。 Mg2+濃度濃度過低過低會會降低降低TaqTaq DNA DNA聚合酶的活性聚合酶的活性，使，使 反應產(chǎn)物減少。反應產(chǎn)物減少。 ( (四四): PCR): PCR反應條件反應條件: : 1.1.溫度溫度 ( (變性變性- -退火退火- -延伸延伸) ) 2.2.時間時間 ( (變性變性-

29、 -退火退火- -延伸延伸) ) 3.3.循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 1: 1: 變性溫度與時間：變性溫度與時間： 94 30-60 sec94 30-60 sec 變性溫度低，解鏈不完全。變性溫度低，解鏈不完全。 一般情況下，一般情況下，9393941min941min足以使模板足以使模板DNADNA變性變性 溫度過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影響。溫度過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影響。 不完全變性，就會導致不完全變性，就會導致PCRPCR失敗。失敗。 2: 2: 退火溫度與時間退火溫度與時間： 40 4060 3060 3060sec60sec 退火溫度是影響退火溫度是影響PCRPCR特異性的特異性的較重

30、要因素較重要因素 退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還 有靶基序列的長度。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適有靶基序列的長度。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適 的溫度：的溫度： Tm Tm值值( (解鏈溫度解鏈溫度)=4(G+C)=4(G+C)2(A+T)2(A+T) 復性溫度復性溫度=Tm=Tm值值-(5-(510)10) 在在TmTm值允許范圍內(nèi)，值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和選擇較高的復性溫度可大大減少引物和 模板間的非特異性結合，模板間的非特異性結合， 提高提高PCRPCR反應的特

31、異性。復性時間一般為反應的特異性。復性時間一般為 303060sec60sec，足以使引物與模板之間完全結合。，足以使引物與模板之間完全結合。 3: 3: 延伸溫度與時間：延伸溫度與時間：常用溫度為常用溫度為7272 TaqTaq DNA DNA聚合酶的生物學活性：聚合酶的生物學活性： 707080 15080 150核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 70 6070 60核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 55 2455 24核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 PCRPCR反應的延伸常用溫度為反應的延伸常用溫度為7272，過高的延伸溫度不利于引，過高的延伸溫度不利于引 物和模板的結合。物和模

32、板的結合。PCRPCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長 度而定，一般度而定，一般1Kb1Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNADNA片段，延伸時間片段，延伸時間1min1min是足夠是足夠 的。的。3 3 4kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min；擴增；擴增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15min。延伸進間過。延伸進間過 長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。 低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 4: 4: 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù): :25254040次次 循環(huán)次數(shù)決定循環(huán)次數(shù)決定PCRPC

33、R擴增程度。擴增程度。PCRPCR循環(huán)次數(shù)主要取決循環(huán)次數(shù)主要取決 于模板于模板DNADNA的濃度。模板的濃度。模板DNADNA少少 , ,酶質量活性差酶質量活性差, , 適當適當 增加循環(huán)次數(shù)增加循環(huán)次數(shù). . 一般的循環(huán)次數(shù)選在一般的循環(huán)次數(shù)選在25254040次之間，次之間， 循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 ( (五五): PCR): PCR擴增產(chǎn)物的分析擴增產(chǎn)物的分析 PCR PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增產(chǎn)物是否為特異性擴增 ，其結果是否準確可靠，必須對，其結果是否準確可靠，必須對 其進行嚴格的分析與鑒定。其進行嚴格的分析與鑒定。 1

34、. 1. 凝膠電泳分析：凝膠電泳分析：PCRPCR產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物電泳，EBEB溴乙錠染色紫外儀下觀溴乙錠染色紫外儀下觀 察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCRPCR產(chǎn)物片段的大小應與預產(chǎn)物片段的大小應與預 計的一致。計的一致。 2. 2. 酶切分析：根據(jù)酶切分析：根據(jù)PCRPCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應 的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒 定，還能進行變異性研究。定，還能進行變異性研究。 3. 3. 分子雜交：分子雜交是檢測分子雜交：分子雜交是檢測PCRPCR產(chǎn)物特異性的有

35、力證據(jù)，產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)， 也是檢測也是檢測PCR PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。產(chǎn)物堿基突變的有效方法。 4. 4. 核酸序列分析：是檢測核酸序列分析：是檢測PCRPCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。產(chǎn)物特異性的最可靠方法。 ( (六六): PCR ): PCR 條件優(yōu)化條件優(yōu)化 1: 1: 理想的理想的primers: primers: 特異地特異地與目的序列兩側的單一與目的序列兩側的單一 DNA DNA序列而非其他序列而非其他DNADNA序列退火的引物序列退火的引物 2: 2: 優(yōu)化反應試劑濃度優(yōu)化反應試劑濃度: : a): Mg a): Mg離子的作用主要是離子的作用主要是 dNTPd

36、NTP-Mg -Mg 與核酸骨架相與核酸骨架相 互作用互作用 并能影響并能影響PolymerasePolymerase的活性，一般的的活性，一般的 情況下情況下 Mg Mg的濃度在的濃度在0.5-5mM0.5-5mM之間調整，調整了之間調整，調整了 dNTPsdNTPs的濃度后要相應的調整的濃度后要相應的調整MgMg離子的濃度離子的濃度; ; b): NH4+ K+ b): NH4+ K+都會影響都會影響PCRPCR，增加，增加K+K+的濃度后的濃度后, , 會會 因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的 溫度溫度, ,從而降低了從而降低

37、了PCRPCR的的 嚴謹性嚴謹性(stringency)(stringency)，NH4+NH4+也也 有相同的作用有相同的作用; ; c): polymerase c): polymerase ：不同公司的酶質量活性有所不：不同公司的酶質量活性有所不 同同, ,需要自己摸索適合的酶的濃度需要自己摸索適合的酶的濃度; ; d): template d): template 50ul PCR SYSTEM 50ul PCR SYSTEM = = human DNA 0.1ug-1ug human DNA 0.1ug-1ug E.ColiE.Coli 10ng-100ng 10ng-100ng L

38、amadaDNALamadaDNA 0.5ng-5ng 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng = = 3: 3: 溫度溫度: : a. a. denaturationdenaturation 常規(guī)是先常規(guī)是先9494度變性度變性5 5分鐘分鐘, GC Rich, GC Rich的摸板是的摸板是9595度度5 5分鐘分鐘 ; ; 然后然后9494度度30-60S.30-60S. b. annealing b. annealing 重點：重點：一般情況下一般情況下, , 是從是從Tm - 5CTm - 5C度根據(jù)情況配合以度

39、根據(jù)情況配合以MgMg 離子濃度進行調整離子濃度進行調整. . 有條件的可以做有條件的可以做gradient gradient pcrpcr. . 退退 火的時間在火的時間在30-60S, 30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果時間短一些可以得到更好的效果. . 因為因為, polymerase , polymerase 在在 annealing temp. annealing temp.時也會有一些時也會有一些 活性活性. . 所以在所以在annealingannealing的時間過長的時間過長, , 會極大的增加非會極大的增加非 特異性擴增，如從特異性擴增，如從gDNAgDNA里擴增

40、大片段里擴增大片段, , 還可使用還可使用two two step PCR. step PCR. 4: touchdown PCR 4: touchdown PCR 原理很簡單原理很簡單, ,連續(xù)降低連續(xù)降低annealing tempannealing temp從從Tm+5 - Tm-10Tm+5 - Tm-10 度度C C 。ANNEALING TEMP. 55ANNEALING TEMP. 55度度 94 5min 94 30s 94 5min 94 30s 6060 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 59 59

41、30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5858 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5151 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5050 30s 72 1min 20cycles 30s 72 1min 20cycles 72 5min 72 5min 5: hot start PCR 5: hot start PCR 熱啟動熱啟動PCRPCR是除了好的引物設計之外，是除了好的引物

42、設計之外，提高提高PCRPCR特特 異性最重要的方法之一。異性最重要的方法之一。 TaqTaq DNA DNA聚合酶的最佳延伸溫度在聚合酶的最佳延伸溫度在7272，聚合酶，聚合酶 在室溫仍然有活性。因此，在進行在室溫仍然有活性。因此，在進行PCRPCR反應配制過程反應配制過程 中，以及在熱循環(huán)剛開始，溫度低于退火溫度時會產(chǎn)中，以及在熱循環(huán)剛開始，溫度低于退火溫度時會產(chǎn) 生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就 會被有效擴增。會被有效擴增。 hot start polymerase 激活：激活：94度度 10-15min 限制限制TaqTaq

43、DNA DNA聚合酶活性的常用方法是聚合酶活性的常用方法是: : a): a): 在冰上配制在冰上配制PCRPCR反應液，并將其置于預熱的反應液，并將其置于預熱的PCRPCR 儀。方法儀。方法 簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性. . b): b): 在反應體系達到在反應體系達到9090度時，度時，PAUSEPAUSE，將溫度保持在，將溫度保持在 7070度以上，手工加入度以上，手工加入polymerasepolymerase，但這個方法，但這個方法 過于煩瑣，過于煩瑣， 尤其是對高通量應用，并容易造成污染。尤其是對高通量應用，并容易造成污染。 c): c):

44、 其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本 成成 分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模 板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時， 因蠟熔化而因蠟熔化而 把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這 樣的酶。樣的酶。 d): hot start polymerase 94 d): hot start polymerase 94度度 10-15min10-15min 6: Booster PCR (6: Booste

45、r PCR ( 熱心的擁護者熱心的擁護者, , 后推的人后推的人, , 支持者支持者, , 后援者后援者, , 調壓器調壓器) ) 開始幾個開始幾個cyclescycles保持保持primerprimer的低濃度的低濃度 1ug human genomic DNA 1ug human genomic DNA 大約在大約在3X100,0003X100,000個模板分子個模板分子, ,這這 樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結合樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結合. . 當模板的濃度過低當模板的濃度過低, ,比如低于比如低于100100個分子時個分子時, , 引物和模板之引物和模板之 間

46、就很難發(fā)生反應間就很難發(fā)生反應. . 引物容易自身進行反應形成二聚體引物容易自身進行反應形成二聚體. .這樣這樣 就有來具體是這樣的就有來具體是這樣的. .開始幾個開始幾個cyclescycles保持保持primerprimer的低濃度的低濃度, ,保保 證證primer:templateprimer:template的的molar ratiomolar ratio在在10, 000,000 10 10, 000,000 10 0,000,000:1. 0,000,000:1. 以確保開始擴增的準確性以確保開始擴增的準確性. .然后然后boostebooste Primer Primer 的濃

47、度到正常的水平的濃度到正常的水平 7: 7: 循環(huán)數(shù)和長度循環(huán)數(shù)和長度 確定循環(huán)數(shù)的基本原理是確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: : 產(chǎn)物能夠保證你進一步分產(chǎn)物能夠保證你進一步分 析操作的最小循環(huán)數(shù)析操作的最小循環(huán)數(shù). . 產(chǎn)物的量不夠產(chǎn)物的量不夠, , 優(yōu)化的方法有優(yōu)化的方法有: : 1): 1): 增加增加TEMPLATE TEMPLATE 2): 2): 增加循環(huán)數(shù)增加循環(huán)數(shù) 如何確定循環(huán)數(shù)：做一個如何確定循環(huán)數(shù)：做一個PCRPCR體系體系,40,40循環(huán)循環(huán),50ul, ,50ul, 分分 別在別在20,25,30,3520,25,30,35循環(huán)時從體系中取循環(huán)時從體系中取5ul,5ul,一起跑

48、電泳分析一起跑電泳分析. . 從而確定最佳的循環(huán)數(shù)從而確定最佳的循環(huán)數(shù) 另一個會影響另一個會影響PCRPCR特異性的是特異性的是PCR cyclingPCR cycling時在兩個溫時在兩個溫 度間變化的速率度間變化的速率(ramping rate).(ramping rate).當然是越高當然是越高 越好越好. . 8: thermal cycler 8: thermal cycler PCRPCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視儀的因素我們經(jīng)常容易忽視. .長時間的使用后需要調整長時間的使用后需要調整 PCRPCR儀儀, ,以保證其能夠到達正確的溫度以保證其能夠到達正確的溫度. . 現(xiàn)在的現(xiàn)在的P

49、CRPCR儀基本上儀基本上 都有自檢功能都有自檢功能(self-diagnosis). (self-diagnosis). 9: PCR 9: PCR增強劑增強劑 enhancerenhancer實在是多種多樣實在是多種多樣. .基本的原理不外是增加引物退火基本的原理不外是增加引物退火 特異性特異性, ,減少錯配減少錯配, , 增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量: : dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%, formamide at 5%, trimethylammonium chloride 10-100uM, detergents such as Tw

50、een 20 0.1-2.5% , polyethylene glycol (PEG)6000 5- 15% ，glycerol 10-15% , single stranded DNA binding proteins ，Gene 32 protein 1nM , E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM ，7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP , Taq Extender (stratagene) ， Perfect Match PCR Enhancer(stratagene) ,

51、Q- solution(Qiagen) 10: Template DNA preparation10: Template DNA preparation 提取提取DNADNA時的試劑會抑制時的試劑會抑制PCRPCR反應的順利進行反應的順利進行. .因此因此 需要對需要對TEMPLATE DNATEMPLATE DNA進行純化進行純化. .特別是特別是SDS(0.01%) SDS(0.01%) 的的 情況下就能強烈抑制情況下就能強烈抑制PCRPCR的進行的進行. . 可以加入一些可以加入一些 nonionicnonionic試劑試劑, ,如如TweenTween, , NonidNonid, ,

52、 TritionTrition之類的反過來之類的反過來 抑制抑制SDS. SDS. 還有還有proteinaseproteinase K K也要除干凈也要除干凈, , 不然會降解不然會降解 polymerase. polymerase. 11: Nested PCR 11: Nested PCR 簡單點說簡單點說 設計設計兩對引物兩對引物, , 一對是長的一對是長的, , 一對是包一對是包 含在長引物內(nèi)的含在長引物內(nèi)的, , 用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增 的模板的模板, ,這樣可以增加產(chǎn)物的量這樣可以增加產(chǎn)物的量. . 而且可以減少非特異而且可以減少非特異

53、性帶和錯配的情況性帶和錯配的情況. . Use Clean Bench (Hood) Use Nuclease free tubes Use Aerosol Resistant Tips Use Calibrated Micropipettor Use Large Volumes (5uL and up) Pipette Into Each Reaction Vessel Only Once (七): PCR儀技術的發(fā)展史 聚合酶鏈式反應自從1993年到現(xiàn)在很快經(jīng)歷了四代產(chǎn)品： 第一代：手動/機械手式水浴基因擴增 用三個恒溫水浴箱，分別將三個水浴溫度恒定在三個溫度：PCR 的高溫變性溫度（如9

54、4）低溫復性溫度（如58），適溫延 伸溫度（如72）。用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴， 標本在每個水浴箱中恒溫的時間用秒表計時。 特點是：勞動強度大，容易因疲勞引起差錯；而優(yōu)點是:設備簡 單，它無須升降溫過程，實驗時間短，液體污染等。 機械手裝置，替代上述手工移動標本過程，形成了機械手 水浴式基因擴增儀，該改進解決了實驗人員的高強度勞動問題， 但又帶來了一個機械手部件大行程頻繁相對運動而引起的高故 障。 第二代：自動化控制型定性基因擴增儀第二代：自動化控制型定性基因擴增儀 也有人稱該種擴增儀為干式基因擴增儀，它是最具也有人稱該種擴增儀為干式基因擴增儀，它是最具 代表性的擴增儀，包括后續(xù)介紹

55、的第三代、第四代都代表性的擴增儀，包括后續(xù)介紹的第三代、第四代都 是以第二代為基礎集成了定量檢測部分。第二代的定是以第二代為基礎集成了定量檢測部分。第二代的定 性性PCRPCR只能判斷陰性陽性，而無法評價特定核酸的濃度只能判斷陰性陽性，而無法評價特定核酸的濃度 及定量分析及定量分析 第三代：終點定量第三代：終點定量/ /半定量半定量 自從自從19961996年美國年美國ABIABI公司發(fā)明第一臺熒光定量公司發(fā)明第一臺熒光定量 PCRPCR儀以來，儀以來，PCRPCR技術和應用從定性向定量快速發(fā)展技術和應用從定性向定量快速發(fā)展. .終終 點定量點定量PCRPCR的優(yōu)點是設備投資少。終點定量的優(yōu)點

56、是設備投資少。終點定量PCRPCR技術是技術是 從定性向實時定量過渡的一個中間產(chǎn)品從定性向實時定量過渡的一個中間產(chǎn)品. . 第三代：終點定量第三代：終點定量/ /半定量半定量(Terminal detection(Terminal detection） 終點檢測法就是終點檢測法就是PCRPCR擴增反應結束后，對其產(chǎn)物進行分析和定擴增反應結束后，對其產(chǎn)物進行分析和定 量檢測的一種方法。為了實現(xiàn)對量檢測的一種方法。為了實現(xiàn)對PCRPCR終產(chǎn)物的定量檢測，必須對終產(chǎn)物的定量檢測，必須對 PCRPCR產(chǎn)物進行預先標志。產(chǎn)物進行預先標志。 目前標志物有：放射性同位素和非放射性標志物。后者包括目前標志物有

57、：放射性同位素和非放射性標志物。后者包括 螺旋結構染料（如溴化乙錠等）、地高辛、生物素以及熒光素螺旋結構染料（如溴化乙錠等）、地高辛、生物素以及熒光素 （包括普通熒光素如（包括普通熒光素如FamFam、TRAMATRAMA和鑭系螯合物等），地高辛、生和鑭系螯合物等），地高辛、生 物素以及熒光素可以通過標志物素以及熒光素可以通過標志dNTPdNTP或引物的或引物的55端從而摻入端從而摻入PCRPCR擴擴 增產(chǎn)物中，除熒光素標志產(chǎn)物可直接發(fā)光外，其余可與增產(chǎn)物中，除熒光素標志產(chǎn)物可直接發(fā)光外，其余可與HRPHRP或或AKPAKP 標志的抗地高辛標志的抗地高辛抗體抗體或親和素反應，加入底物后產(chǎn)生顏色

58、、發(fā)光或親和素反應，加入底物后產(chǎn)生顏色、發(fā)光 或熒光信號，從而進行檢測。這些標志物進行標志的是檢測時的或熒光信號，從而進行檢測。這些標志物進行標志的是檢測時的 捕獲劑或是作為定量檢測的指示劑捕獲劑或是作為定量檢測的指示劑. . 終點法檢測要特別注意終點法檢測要特別注意“平臺效應平臺效應”對實驗結果的影響對實驗結果的影響 第四代：實時定量第四代：實時定量PCR (real-time PCR)PCR (real-time PCR) 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR技術于技術于19961996年由美國年由美國Applied Applied BiosystemsBiosystems公司推出，由于該

59、技術不僅實現(xiàn)了公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCRPCR從定從定 性到定量的飛躍，而且與常規(guī)性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCRPCR相比，它具有特異性相比，它具有特異性 更強、有效解決更強、有效解決PCRPCR污染問題、自動化程度高等特點，污染問題、自動化程度高等特點， 目前已得到廣泛應用。目前已得到廣泛應用。 實時熒光定量檢測系統(tǒng)：實時熒光定量檢測系統(tǒng)： PCRPCR儀儀實時熒光定量試劑實時熒光定量試劑+ +電腦電腦+ +自動分析軟件，自動分析軟件，。 常規(guī)常規(guī)PCR基于產(chǎn)物擴增終點分析基于產(chǎn)物擴增終點分析 凝膠電泳分析 5 Template Cycle 1 5 2X Template 4X

60、Template 30-40 cycles Cycle 2 5 5 5 5 對目的基因的有無進行定性分析對目的基因的有無進行定性分析 適用定性分析，不適適用定性分析，不適 合定量分析；合定量分析； PCR PCR 產(chǎn)物的長度從產(chǎn)物的長度從 100bp 100bp 數(shù)數(shù)kbkb 實時檢測實時檢測: :每個循環(huán)都每個循環(huán)都 產(chǎn)出熒光信號產(chǎn)出熒光信號 絕對定量，靈敏度更高絕對定量，靈敏度更高 PCRPCR產(chǎn)物的長度一般在產(chǎn)物的長度一般在 60-150 bps60-150 bps 產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺期 Real-time PCR 在指數(shù)期線性范圍內(nèi)進行熒光檢測. Theoretical increa