3、微生物限度驗(yàn)證

1、微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證主講：柴海毅為什么驗(yàn)證？ 與國際通用要求接軌 促進(jìn)微生物檢驗(yàn)定量化 推進(jìn)微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化 提升藥品質(zhì)量的要求中國藥典2010年版二部： “凡例”-檢驗(yàn)方法和限度 二十三、 本藥典正文收載的所有品種，均應(yīng)按規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)；如采用其他方法，應(yīng)將該方法與規(guī)定的方法做比較試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果掌握使用，但在仲裁時仍以本藥典規(guī)定的方法為準(zhǔn)。 美國FDA分析方法驗(yàn)證指南： “分析方法驗(yàn)證” 分析方法驗(yàn)證是論證某一分析方法適 用于 其用途的過程，分析方法的驗(yàn)證過程是從 申請者有計(jì)劃地系統(tǒng)性收集驗(yàn)證資料以支 持分析方法開始的。 驗(yàn)證目的 - 在于確認(rèn)（尋找）一種有效的檢驗(yàn)方法， 如果樣品

2、（藥品）中有一定數(shù)量的微生物 存在，那么采用此法可以使得樣品（藥品 ）中的微生物得以檢出。 - 充分驗(yàn)證樣品（藥品）本身對微生物生長 的影響。 驗(yàn)證目的 確認(rèn)一種檢驗(yàn)方法。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 檢驗(yàn)條件 檢驗(yàn)方法 檢驗(yàn)規(guī)程樣品量稀釋液種類稀釋液體積中和劑培養(yǎng)基培養(yǎng)時間培養(yǎng)溫度SOP影響微生物檢驗(yàn)的因素 微生物檢驗(yàn)的檢出率很低下 樣品/藥品自身的特殊性 樣品/藥品中添加的防腐劑/抑菌劑 培養(yǎng)基的特性 培養(yǎng)條件 人員因素 實(shí)驗(yàn)器材的選擇恢復(fù)試驗(yàn) 微生物方法驗(yàn)證的實(shí)質(zhì)就是評價和考 察微生物恢復(fù)試驗(yàn)（恢復(fù)生長）的可 信度。 恢復(fù)試驗(yàn)就是確認(rèn)某 一檢驗(yàn)方法， 它可以使加入其中的各種微生物 都能夠恢復(fù)生長。 驗(yàn)證內(nèi)容

3、 （一）計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 （二）控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證（一）計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證供試液制備中國藥典2010年版 表面活性劑、中和劑或滅活劑：應(yīng)證明其有效 性及對微生物的生長和存活無影響。 供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過 1小時。 供試液制備若需用水浴加溫時，溫度不應(yīng)超過 45。 供試液的體積：100ml。稀釋劑中國藥典2010年版1、 0.1%蛋白胨水溶液2、 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液 固體：10g 供試品+稀釋劑至100ml 液體：10ml供試品+稀釋劑至100ml 微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證菌種選擇原則 普遍性 - G+、 G-、 -桿菌（長、短桿菌） -球菌 -真菌（絲狀

4、真菌、酵母菌） 特殊性 - 從環(huán)境中分離出來的常見雜菌 - 從樣品中分離出來的常見雜菌微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌株：中國藥典2010年版 菌株名稱 CMCC編號 培養(yǎng)條件大腸埃希氏菌(Escherichia coli) CMCC(B)44102 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B)26003 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 30-35 18-24h枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） CMCC(B)63501 白色年珠菌(Candida albicans) CMCC(F)98001 改良馬丁培養(yǎng)基 20-25 24-48h黑曲霉菌(Aspergillus ni

5、ger) CMCC(F)98003 改良馬丁斜面培養(yǎng)基 20-25 5-7天微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌株： USP24版 菌株名稱 ATCC編號 培養(yǎng)條件大腸埃希氏菌(Escherichia coli) ATCC 8739 32 +2.5金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538 32 +2.5銅綠假單胞菌(Staphylococcus aureus) ATCC9027 32 +2.5生孢梭菌(Clostridium sporogenes) ATCC11437 32 +2.5枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis) ATCC6633 22 +2.5白

6、色年珠菌(Candida albicans) ATCC10231 22 +2.5黑曲霉菌(Candida albicans) ATCC16404 22 +2.5計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證步驟 選定一個方法 確定檢測限 設(shè)計(jì)驗(yàn)證方案樣品的選擇： 合格的樣品 （1） 按照正常取樣方法取樣的樣品 （2）符合限度標(biāo)準(zhǔn)的樣品 檢測限：樣品中細(xì)菌被檢出的最低量。 細(xì)菌 100 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 100 cfu/ml 細(xì)菌 50 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 50 cfu/ml平板法：薄膜過濾法：檢測限設(shè)定依據(jù)： 微生物計(jì)數(shù)原則 限度 / 標(biāo)準(zhǔn) 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法學(xué)的要求恢復(fù)試驗(yàn) 恢復(fù)生長是指人為地添加的測試菌

7、（污染菌）在供試液中的生長水平 回收率則是測試菌（污染菌）在樣品供試液中的存活率與測試菌污染菌的檢出率的比值 恢復(fù)試驗(yàn)的原則 消除樣品的抑菌性 樣品的處理方法和檢驗(yàn)方法不應(yīng)影響樣 品中微生物的生長 如何消抑菌活性 稀釋法 中和法 離心法 薄膜過濾法 組合運(yùn)用中國藥典2010年版表l 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、吸附物稀釋法醛類稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs ）、對羥基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物卵磷脂碘酒、洗必泰類聚山梨酯鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（EDTA )鎂或

8、鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸-內(nèi)酰胺類抗生素-內(nèi)酰胺酶USP列舉出的部分抑菌劑/中和劑抑菌劑抑菌劑中和劑中和劑戊二醛硫酸氫鹽酚類、乙醇、山梨酸酯稀釋劑醛類稀釋劑、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物、對羥基苯甲酸酯卵磷脂、吐溫汞類制劑硫酸氫鹽、硫乙醇酸鹽、硫代硫酸鹽二重雙胍卵磷脂碘酒、洗必泰類吐溫鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸Mg+2或Ca+2磺胺類對氨基苯甲酸樣品本底含菌量高，怎么處理？樣品本底含菌量高：1、稀釋：供試液梯度稀釋2、過濾：0.45 m濾膜過濾測試菌懸液的要求:中國藥典2010年版：1、 室溫下放置， 2小時內(nèi)使用；2、 保存在2 8，可在24小時內(nèi)使用。 黑曲霉孢子懸液可以保存在 2 8

9、， 在驗(yàn)證的貯存期內(nèi)使用。計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證（平板法） 樣品組： 樣品溶液（1/10）9.9ml 104 cfu/ml菌懸液 0.1 ml 稀釋劑對照組： 蛋白胨稀釋液 9.9ml （陰性對照） 104 cfu/ml菌懸液 0.1 ml 菌種組： 104 102 （陽性對照） 空白樣品組： 計(jì)數(shù)A計(jì)數(shù)B計(jì)數(shù)C計(jì)數(shù)D結(jié)果判斷依據(jù)：1、樣品組和稀釋劑對照組微生物計(jì)數(shù)結(jié)果吻合，表明： - 添加的中和劑完全消除了樣品的抑菌性。2、稀釋劑對照組和菌種組微生物計(jì)數(shù)結(jié)果吻合，表明： - 中和劑沒有毒性，沒有影響測試菌的生長。 - 測試方法和培養(yǎng)條件不影響測試菌的生長。3、空白樣品組測試結(jié)果陰性，表明： - 本次測

10、試樣品合格。 - 無菌操作正確。沒有污染事件發(fā)生。 可以接受的標(biāo)準(zhǔn) 平板法1、重現(xiàn)性良好 - 三批不同批次的樣品/產(chǎn)品 - 三名不同的微生物檢驗(yàn)人員2、驗(yàn)證數(shù)據(jù)合理有效（微生物的回收率） - 陰性對照：無污染事件發(fā)生 - 樣品組（ 回收率）： A = C 30% （ 偏差 30%）3、樣品的處理方法和檢驗(yàn)方法與檢驗(yàn)規(guī)程相符計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證-各國藥典結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)USP：各試驗(yàn)菌的回收率均不低于70% 。EP、BP、JP: 各試驗(yàn)菌的回收率均不低于80% 。中國藥典：各試驗(yàn)菌的回收率（包括供試品組和稀釋劑對照組）均不低于70%。不可以接受的標(biāo)準(zhǔn)（1）：1、陰性對照： 陰性對照(包括蛋白胨組和空白樣品

11、組) 發(fā)生污染事件。 菌落鑒別：- 污染菌是測試菌：檢驗(yàn)員無菌操作培訓(xùn)。 - 污染菌不是測試菌：偏差調(diào)查。2、陽性對照： 樣品組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與檢測限不符。（微生物的回收率過 高或過低）結(jié)論：樣品組的試驗(yàn)結(jié)果無效。 重新開始細(xì)菌的恢復(fù)試驗(yàn)直至與檢測限相符。 不可以接受的標(biāo)準(zhǔn)（2）：3、樣品組： - 三人三次的試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該與檢測限相符。 - 第一次的試驗(yàn)結(jié)果要能夠被第二次和第三次的 試驗(yàn)證實(shí)。 - 任何一次與檢測限不符的結(jié)果都說明試驗(yàn)過程 有缺陷，驗(yàn)證需重新進(jìn)行。優(yōu)化更新步驟： 消除抑菌活性。 稀釋樣品時，應(yīng)確認(rèn)檢測限（檢驗(yàn)限度）低于或等于標(biāo)準(zhǔn)。 不同的細(xì)菌，一個好的結(jié)果可以從不同的稀釋度中檢測出，

12、最高的稀釋度將被用于日常的監(jiān)測中。平板法優(yōu)化更新方法：平板法優(yōu)化更新方法： 稀釋樣品：1/10 1/50 1/100 增加培養(yǎng)基量 延長培養(yǎng)時間 添加抗活性劑計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證（薄膜過濾法） 樣品組： 樣品溶液（1/10）10ml 過濾 5x102 cfu/ml菌懸液 0.1 ml 蛋白胨對照組： 蛋白胨稀釋液 10ml 過濾 （陰性對照） 5x102 cfu/ml菌懸液 0.1 ml 菌種組： 5x102 cfu/ml菌懸液 0.1 ml 過濾 （陽性對照） 過濾 空白樣品組： 計(jì)數(shù)A計(jì)數(shù)B計(jì)數(shù)C計(jì)數(shù)D可以接受的標(biāo)準(zhǔn) 薄膜過濾法1、重現(xiàn)性良好 - 三批不同批次的樣品/產(chǎn)品 - 三名不同的微生物檢驗(yàn)

13、人員2、驗(yàn)證數(shù)據(jù)合理有效（微生物的回收率） - 陰性對照：沒有污染事件發(fā)生。 - 樣品組： A = C 30% （ 偏差 30%） 3、樣品的處理方法和檢驗(yàn)方法與檢 驗(yàn)規(guī)程相符薄膜過濾法優(yōu)化更新方法： 增加沖洗量 增大樣品稀釋倍數(shù)（1/50，1/100） 延長培養(yǎng)時間 添加抗活性劑（沖洗劑里加也可以）2010年版中國藥典（附錄109頁）： 若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用， 那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因 供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品 不能被試驗(yàn)菌污染。然而，供試品也可能僅對 試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有 抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物 限度標(biāo)

14、準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果 判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高 稀釋級的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。若驗(yàn)證試 驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀 釋級的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。2010年版中國藥典（附錄109頁）： 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時，若采用上述計(jì)數(shù)方法總存在 一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么 選擇回收情況最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn) 行供試品的檢測。微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證 （二）控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證菌種選擇原則 樣品的給藥途徑和類型決定了采用何種控制菌檢查驗(yàn)證。 增菌培養(yǎng)基的確定 增菌培養(yǎng)基的實(shí)際用量等同控制菌檢查方法驗(yàn)證時的用量。 驗(yàn)證的開始。 控制菌檢驗(yàn)方法

15、驗(yàn)證 選定一個方法：CP或USP 設(shè)定檢測限：不得檢出 設(shè)計(jì)驗(yàn)證方案控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證（平板法）（以大腸桿菌為例） 增菌 （計(jì)數(shù)）樣品組樣品組蛋白胨蛋白胨對照對照菌懸液菌懸液對照對照樣品樣品100ml增菌液增菌液大腸桿菌懸液大腸桿菌懸液0.1ml、1X102 cfu/ml大腸桿菌懸液大腸桿菌懸液 0.1ml、1X102 cfu/ml 蛋白胨蛋白胨100ml 增菌液增菌液 大腸桿菌懸液大腸桿菌懸液0.1ml、1X102 cfu/ml 培培 養(yǎng)養(yǎng)樣品組樣品組空白樣空白樣品對照品對照控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證（平板法）（以大腸桿菌為例） 確認(rèn)培養(yǎng)結(jié)束后，需檢查大腸桿菌菌落形態(tài)并鏡檢， 必要時要鑒別。 4 組

16、組測試樣品測試樣品觀察CP法USP法18小時24小時結(jié)果判斷依據(jù)： 1、樣品組和蛋白胨對照組測試結(jié)果一致，表明： - 添加的中和劑完全消除了樣品的抑菌性。 2、蛋白胨對照組和菌種組測試結(jié)果一致，表明： - 中和劑沒有毒性，沒有影響測試菌的生長。 - 測試方法和培養(yǎng)條件不影響測試菌的生長。 3、空白樣品組測試結(jié)果陰性，表明： - 本次測試樣品合格。 - 無菌操作正確。沒有污染事件發(fā)生。 可以接受的標(biāo)準(zhǔn) 1、樣品檢驗(yàn) - 增菌液經(jīng)培養(yǎng)后明顯渾濁 - 分離平板上出現(xiàn)大腸桿菌的典型菌落2、陽性對照 - 增菌液經(jīng)培養(yǎng)后必須是渾濁的 - 分離平板上出現(xiàn)大腸桿菌的典型菌落3、陽性菌計(jì)數(shù) - 菌懸液的計(jì)數(shù)結(jié)果

17、應(yīng)該 25 cfu/ml 不可以接受的標(biāo)準(zhǔn) （無效試驗(yàn)）1、樣品檢驗(yàn) - 與可接受的標(biāo)準(zhǔn)不符 結(jié)論：重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)步驟2、陽性對照 - 與可接受的標(biāo)準(zhǔn)不符 結(jié)論：重新試驗(yàn)3、陽性菌計(jì)數(shù) - 與標(biāo)準(zhǔn)不符 結(jié)論：重新開設(shè)大腸桿菌的恢復(fù)試驗(yàn)，制作 新的菌懸液直到符合規(guī)定。優(yōu)化控制菌驗(yàn)證步驟： 擴(kuò)大增菌液的體積 100ml 200ml 300ml 400ml 500ml 延長增菌液的培養(yǎng)時間 采用薄膜過濾法 加入活性試劑控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證（薄膜過濾法）（以大腸桿菌為例） 加10ml 稀釋液到薄膜過濾器中，加濕過濾器。 加100ml 樣品增菌液到薄膜過濾器中。 加0.1ml、5X102 cfu/ml大腸桿

18、菌懸液到薄膜過濾器中并用稀釋液沖洗，這樣，薄膜上就應(yīng)該有50 cfu個菌落出現(xiàn)。失敗的驗(yàn)證 （無效試驗(yàn)）1、樣品中有些成分是固有的抑菌成分2、參考防腐劑的實(shí)驗(yàn)/驗(yàn)證數(shù)據(jù)3、參考樣品中各成分的理化性質(zhì) 驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，判斷是否符合驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)。 - 符合： 按驗(yàn)證的方法和條件繼續(xù)進(jìn)行藥品的微生物 限度檢查； - 不符合： 重新設(shè)計(jì)驗(yàn)證方案，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證 結(jié)果全部符合驗(yàn)證方案。驗(yàn)證報(bào)告的形成1、全部驗(yàn)證工作必須按照批準(zhǔn)的驗(yàn)證方 案進(jìn)行。2、驗(yàn)證方案批準(zhǔn)后，可以進(jìn)一步再修訂， 但必須在驗(yàn)證報(bào)告上注明。3、驗(yàn)證結(jié)束后，應(yīng)該同時出具驗(yàn)證數(shù)據(jù) 記錄和驗(yàn)證報(bào)告。4、最終樣品稀釋度及方法必須在S

19、OP中 說明。 采用薄膜過濾法的供試品 （1）水溶液 （2）可溶于水的固體制劑 （3）-內(nèi)酰胺類抗生素 非水溶性制劑 （1）可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑 （2）無菌氣（噴）霧劑 裝有藥物的注射器 （3）具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具(輸血、輸液袋等)方法驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)（1） 對于同一份培養(yǎng)物，采用相同的測定方法，不同的實(shí)驗(yàn)人員的測定結(jié)果的可能有很大的 誤差，甚至達(dá)到50%。所以，在操作過程中，應(yīng)特別注意能造成誤差的各個環(huán)節(jié)。 方法驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)（2） 當(dāng)采用固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物制備菌懸液時，應(yīng)盡量使菌苔成單個菌體充分分散于稀釋液中，一般將菌苔與微量稀釋液先在管壁上混勻。對于那些不易制成均勻菌懸液的菌苔（如枯草芽孢桿菌），一般采用液體培養(yǎng)物制備菌懸液。若液體培養(yǎng)物產(chǎn)生菌膜，取菌液時應(yīng)避免取出菌膜，一般應(yīng)取培養(yǎng)管中部的均勻菌懸液。 方法