流式細(xì)胞儀操作規(guī)程-SOP

1、流式細(xì)胞儀操作規(guī)程目錄1：淋巴細(xì)胞亞群測定及絕對計數(shù)2：活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T 及純真 T 的檢測3: HLA-B27測定4: CD55/CD59測定5：干細(xì)胞檢測和絕對計數(shù)6:白血病免疫分型測定7:淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子 IFN- 丫 /IL-4 測定8:細(xì)胞周期分析9:活化血小板檢測10:血小板抗體測定11:紅細(xì)胞抗體測定12:粒細(xì)胞抗體測定淋巴細(xì)胞亞群測定流式細(xì)胞儀醫(yī)院檢驗科 操作規(guī)程文件號：200年月日起實施第1版共3頁本規(guī)程每2年復(fù)審一次復(fù)審日期：年月日復(fù)審人：規(guī)程編寫者： 審批者：批準(zhǔn)日期：年_月_日文件分發(fā)部門和/或個人院檔案室保管者：檢驗科 主任：檢驗科實驗室：淋巴細(xì)胞

2、亞群測定方法流式細(xì)胞儀BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特原理：雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體參加到全血中， 與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌和固定等步驟后，在流式 細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，參加Flow-Count即可得出絕對計數(shù)。淋巴細(xì)胞外表抗原分布如下：T淋巴細(xì)胞：CD3+ B淋巴細(xì)胞：CD3-, CDI9+;輔助性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+抑制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+ NK細(xì)胞：CD3-CDI6+56等。根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上 CD分子表達(dá)的不同，流式細(xì)胞 儀可以分辨出淋巴細(xì)胞及其各種不同的亞群， 利用計算機軟件計算出淋

3、巴細(xì)胞 亞群的百分?jǐn)?shù)，參加Flow-Count組會自動得出絕對計數(shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血要求 1 .樣本量1ml。2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。假設(shè) X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；假設(shè)X 109/L ,應(yīng)別離單個核細(xì)胞。劑型 規(guī)格 貯存液體 2 8C(CD45/4/8/3CD4/8/3CD45/56/19/3同型對照 lgG1/lgG1/lgG1CD19-PC5CD3/19CD3/16+56Flow-Count熒光微球2:全血溶血試劑(Q-Pr

4、ep)A:甲酸B:碳酸鈉等(Optilyse C液體3:鞘液液體20L4:清洗液液體5L5:熒光微球液體10MLC:多聚甲醛液體液體70ML室溫液體32ML室溫液體14ML室溫室溫室溫室溫2-8 C Flow-Check試劑品牌貝克曼庫爾特成分1 :單克隆抗體儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1按照要求，分別向已編好號的試管中參加10/20 ul單克隆抗體和同型對照2分別向試管中參加混勻的100u1抗凝血。3混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4溶血：a. OptiLyse C按說明書步驟溶血b. 使用COULTERPREP制備系統(tǒng)開機-顯示R

5、EADYT亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開門-取出試管 -再進(jìn)行下一個樣品測定。*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體5上機測樣可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣6需要做絕對計數(shù)的指標(biāo)，在相應(yīng)管中參加與血樣等量的 Flow-Count務(wù)必做到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count，而且加完即上機報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)和絕對值操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CVHGE5RrL;SOR n PB1- _t富ilrE*: - m-g*mm&bdal FNdnfg79- T*xIAe11L-IIPPRD=i(alnrasave)2畫兩IBzi!總 mo

6、14 I： g 也耳n-BvliiE ;1i*FHJnlIm=r ll1魯一l-lra:n.2 -3-3Hii押九ik“腫8兒ig只你kr-wso 氷邑G二 py二=!c#H7=IPFThlh!5r-Ti濂J,r s滬0卡書霊I矗:J烘- .蓋HI! 9I l 111|i 11 1|llli 1 I 瞇iff如果做絕對計數(shù)，那么Rdmma)。擔(dān)活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T及純真T的測定方法流式細(xì)胞儀BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特原理：雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體參加到全血中，與白 細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌和固定等步驟后，在流式細(xì)胞 儀上進(jìn)行分析，從而

7、得到相應(yīng)各亞群的百分?jǐn)?shù)?；罨馨图?xì)胞外表抗原為CD3+/CD25和 CD3+/HLA-DR。CD3+/CD45RO是記憶型 T 細(xì)胞。CD3+/CD45RA是純真型T細(xì)胞。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑 EDTA 或肝素抗凝血要求 1 .樣本量1ml。2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。假設(shè) X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；假設(shè)X 109/L ,應(yīng)別離單個核細(xì)胞。試劑品牌劑型 規(guī)格 貯存貝克曼庫爾特成分1 :單克隆抗體液體 2 8CCD3/HLA-DR CD25-PC5CD3-FIT

8、C CD45RA-PECD45RO-PE CD4-PC5 2 :全血溶血試劑Q-Prep液體液體70ML室溫液體32ML室溫液體14ML室溫A:甲酸B:碳酸鈉等C:多聚甲醛(Optilyse C液體室溫3:鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML2-8C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1按照要求，分別向已編好號的試管中參加10/20 ul單克隆抗體和同型對照2分別向試管中參加混勻的100u1抗凝血。3混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4溶血：a. OptiLyse C按說明書步驟溶血b. 使

9、用COULTERPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READYT亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開門-取出試管 -再進(jìn)行下一個樣品測定。*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體5上機測樣可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV5-10%提示排斥、持續(xù)增加提示應(yīng)作病理活檢；CD3+/HLA-DR增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常機體內(nèi)各種 T細(xì)胞之間以及與其他免疫細(xì)胞之間在數(shù)量上保持一定比例，如果它們之間比例失調(diào)就會引起免疫功能紊亂，將導(dǎo)致機體免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、腫瘤等疾病的發(fā)生

10、，檢測淋巴細(xì)胞各種亞群有助于疾病的診斷、預(yù)后和治療。CD45RA CD45RO均為T細(xì)胞的輔助分子， CD45RA純真型T細(xì)胞當(dāng)免疫力下降時減少；CD45RO記憶型T細(xì)胞對第二次抗原刺激極其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中減少。方案(Protocol )同淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果(Result)HLA -B27測定方法流式細(xì)胞儀BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特原理：雙色直接免疫熒光法。將HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE單克隆抗體參加到全血中， 與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌和固定等步驟后，在流式 細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，測定HLA-B7陰性而HLA-B

11、27陽性細(xì)胞的平均熒光強度和 所占的百分比。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血要求 1 .樣本量1ml。2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。假設(shè) X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；假設(shè)X 109/L，應(yīng)別離單個核細(xì)胞。4 .溶血樣本不能用。試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫爾特成分1:單克隆抗體液體1ML 28C(HLA-B27/HLA-B7同型對照IgG1 / IgG2a )2:全血溶血試劑液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫3:鞘

12、液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML 2-8C質(zhì)控品BEKAMANCOULTER品，未開瓶的試劑于2-8 C保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8 C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)-一次：遇特殊情況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1按照要求，分別向已編好號的試管中參加20 ul單克隆抗體和同型對照lgG2a-FITC / lgG1-PE2分別向試管中參加混勻的100u1抗凝血。3混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4溶血：a. OptiLyse C按說明書步驟溶血b.使用COULTERPREP制備系統(tǒng)開機

13、-顯示READYT亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開門-取出試管 -再進(jìn)行下一個樣品測定。*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體5洗、離心、上機測樣備注：測B27一定要至少洗一遍方可上機檢測 報告結(jié)果報告陰陽性操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV90%臨床意義HLA復(fù)合體位于第6號染色體的短臂上，該區(qū) DNA片段長度約3000-4000KB, 占人體整個基因的1/3000 , HLA-B27是 HLA-I類基因中B位點上的一個等位基 因，與多種疾病具有相關(guān)性，尤其是強直性脊柱炎。HLA-B27基因?qū)儆?？型MHC 基因，所有有核細(xì)胞上均有表達(dá)，尤其是

14、淋巴細(xì)胞外表含量豐富，人們發(fā)現(xiàn)HLA-B27抗原表達(dá)與強直性脊柱炎有高度的相關(guān)性，超過90%勺強直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表達(dá)陽性，而正常人群中僅 5-10%的認(rèn)為陽性。由于強直性 脊柱炎病癥與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此HLA-B27檢測在疾病的 診斷中具有重要意義，HLA-B27的檢測是該疾病診斷和鑒別診斷中的一個重要 指標(biāo)。方案(Protocol )1. 選參數(shù)9tl PWA17AK3 FRDiaanii冋 UH戸口 旨 呼藝一 山! 口 j ； | | r Ij Jt 2T 13 b II 穌T苗 *W* soumg4 1 j ,叩口b晉寸HP JLC F 2e f ,1

15、Ea MXF jxH,l |FJK MX F 2e H-I |t|- 點1=務(wù)RwmiGiKsIMP叫氏?C i狂 Fw 1 匸下J KXF MlHLiM UxPJAJiPii. 血+甘JWD3MM1QE.珂蹴 L 1B|n|*TSiWi47.僅殲|wf|百iim*華 4 #*:| irrfr4ifliJlff3 pP l MH 叫 d gJmPC廠刑 EPmsd厲)| 目 FMW1S5 MpJ-JLviQ|Tb| 站 | 砂 Jif uOl| H T=5 FdMlv_J rfM F 口乂Lfip*TTJTci j f m id&SCQa hr1: 、l*J ejl* -pBi.Elnl- -

16、R_3Bc.gn 一7-cfsax BHHyLJfhuF7-恥EEI(b T - h H L 4 F昇。- - n =! - Ms?9 一 pnAS-ftHS?&M辛役waSave2畫H3 口 M一-: q llrKUIilLlH 芒嶽右軌V LI*-Jsu *Tris珥iI G e;匸 g 卩！ ihrnVn 1 T T D 5r 越町1 nTTIWFIJrKi* 亞.I當(dāng)寺*KuT Kun HTEUVPE g.-.1T= S T 71-x-15_IEp 闇 R5-s5- E gH-4M* 上衣FJC-詈盛-ba i.JX F 臂?Lf Tr4 fwhs35FE. LsgiTIQw514-単

17、結(jié)果1. positive (+)f l 腳 FvT.LvO Ll 心113205輙哄:3匕加.；B7H3X-Mea n=2. negative(-)Fl |A| 1 fi k MU ! FL1 LCSiJJ 53問醐 114 LfQ FL IW31am?M * 訐由04- 品 JF u 1EZ71STX-Mea n=X-Mea n=CD55/CD5 測定方法流式細(xì)胞儀BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特抗體結(jié)合。用流式細(xì)胞儀檢測CD55或CD59表達(dá)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑 EDTA 或肝素抗凝血 要求 1 .樣本

18、量1ml。2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用3 .溶血樣本不能用。試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫爾特成分1 :單克隆抗體液體1ML2 8C(CD59-FITC CD55-PE2:全血溶血試劑液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫3:鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML2-8C質(zhì)控品BEKAMANCOULTER品，未開瓶的試劑于2-8 C保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)疋，稀釋的試劑于2-8 C可穩(wěn)疋2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情 況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Alt

19、ra樣本制備：一白細(xì)胞CD55/CD59檢測1 準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記。分別向二管中參加樣品100ul2.溶血:a. OptiLyse C按說明書步驟溶血b.使用COULTERPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READYT亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開門-取出試管 -再進(jìn)行下一個樣品測定。*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體3. 離心后分別參加CD55/CD59l0ul和相應(yīng)的同型對照10ul。避光20-30分鐘4 洗滌離心5上機測樣二紅細(xì)胞CD55/CD59檢測1 準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記2 .分別參加 CD55/CD59

20、 10ul和相應(yīng)的同型對照10ul。3 .向二管中參加1: 200稀釋的樣品100ul 可根據(jù)紅細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整，避光20-30分鐘。4 .洗滌離心。5.混勻、上機測樣。報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV97%CD5997%PNH 的臨界值：RBC CD5995% WBC CD5990%PNH 的診斷值：RBC CD5991% 大局部80%中性粒細(xì)胞CD5984%臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH寸CD55和CD59明顯減低和缺如方案(Protocol )(同 HLA-B27)(th W Unff J L*nN LOQCWvftera WC結(jié)果:no rmalInez

21、Y丄D 1UT! urvfl Li.| I 8 I I Il B II.:abno rmalPM PKT3 Uo/PMTO laa干細(xì)胞檢測和絕對計數(shù)方法流式細(xì)胞儀BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特原理：雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體參加到全血中，與干細(xì)胞 膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌和固定等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)，參加 Flow-Count即可得出絕對計數(shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑 EDTA 或肝素抗凝血要求 1 .樣本量1ml。2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能

22、用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。假設(shè) X1O9/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；假設(shè)X 109/L ,應(yīng)別離單個核細(xì)胞。試劑品牌貝克曼庫爾特成分1 :單克隆抗體CD34 No. IM1871Flow-Count熒光微球 :全血溶血試劑Q-Prep液體 A :甲酸液體 70ML 室溫劑型規(guī)格貯存液體 2 8CCD45-PC5M2652B:碳酸鈉等C:多聚甲醛液體 32ML室溫液體 14ML室溫(Optilyse C液體室溫3:鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML2-8C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Alt

23、ra樣本制備：1按照要求，分別向已編好號的試管中參加 10 ul單克隆抗體和同型對照2分別向試管中參加混勻的100u1抗凝血。3混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4溶血：a. OptiLyse C按說明書步驟溶血b. 使用COULTERPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READYT亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開門-取出試管 -再進(jìn)行下一個樣品測定。*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體5需要做絕對計數(shù)時，在相應(yīng)管中參加與血樣等量的 Flow-Count務(wù)必做到三 同：同槍，同人，同種方法加 Flow-Count，而且加完即上機6上機測樣報告結(jié)果報

24、告百分?jǐn)?shù)和絕對值操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CVX1O9/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；假設(shè) X 109/L，應(yīng)別離單個核細(xì)胞。試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫爾特成分1 :單克隆抗體液體28C(CD34No. IM1871CD45-PC5M2652Flow-Count熒光微球2:全血溶血試劑Q-Prep液體A:甲酸液體70ML室溫B:碳酸鈉等液體32ML室溫C:多聚甲醛液體14ML室溫(Optilyse C液體室溫3:鞘液液體20L室溫4:清洗液液體5L室溫5:熒光微球液體10ML2-8C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作

25、-樣本制備：細(xì)胞膜外表抗原1 首先準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲參加的抗體。2 首先每管中參加5ul CD45-PC5抗體。3 然后，按管上的標(biāo)記，參加相應(yīng)抗體各10ul注意：必須是FITC和PE標(biāo)記的抗體搭配4. 各管中參加標(biāo)本骨髓或外周血30100u1根據(jù)細(xì)胞的多少決定，振蕩混勻，室溫避光2030分鐘。5. 溶血：a. OptiLyse C按說明書步驟溶血b. 使用COULTERPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READYT亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY丁亮-開門-取出試管 -再進(jìn)行下一個樣品測定。*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體細(xì)胞漿和核抗原

26、1 準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲參加的抗體，其中一管是同型對照。2 首先每管中參加標(biāo)本骨髓或外周血100ul根據(jù)細(xì)胞的多少決定 ，5ulCD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3每管中參加固定液100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4 各管中參加PBS4m。5. 300g離心5分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。1500r/min*5min6各管中參加透膜劑100ul，輕輕混勻，室溫避光5分鐘。7加抗體，陰性對照管中參加10ul，其余各管參加相應(yīng)抗體各10ul，室溫避 光15分鐘。8. 各管中參加4mlPBS振蕩混勻。9. 300g離心5分鐘后，棄去上清液。10. 各管中參加PBS500ul

27、,振蕩混勻。11. 上機測樣報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV%參考值CD34+5%MPO+V5%粒系20% 淋系X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；假設(shè)X 109/L，應(yīng)別離單個核細(xì)胞。4 .溶血樣本不能用。試劑淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系自配成分：刺激素PMA離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 選白美國SIGMA公司。單克隆抗體BeckmanCoulter公司 CD4-PC5 、IL-4-PE、IFN- 丫 -FITC。質(zhì)控品BEKAMANCOULTER品，未開瓶的試劑于2-8 C保存，可在有效期內(nèi)保 持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8 C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情 況隨時

28、進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作：細(xì)胞培養(yǎng)與染色取200ul抗凝血參加lOul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMII640 洗滌一次，將細(xì)胞參加培養(yǎng)體系中，5% CQ 37 C孵育18小時，取出后以PBS 洗一次。用專用細(xì)胞內(nèi)因子試劑進(jìn)行細(xì)胞固定、透膜。將細(xì)胞分成兩管，其一 為測定管參加lOul抗人IL-4-PE和IFN- 丫 -FITC,另一管參加同型對照，室溫 避光20分鐘，PBS洗滌一次，待測。流式細(xì)胞儀測定翻開流式細(xì)胞儀及氬激光光源488nm預(yù)熱20min，同時儀器自動初始化；用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，然后依

29、次檢測標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測50000以上細(xì)胞，在前向散射光FS和測向散射光SSC散點圖中圈定淋巴細(xì)胞群，然 后分析CD4陽性細(xì)胞中IL-4-PE和IFN- 丫 -FITC的表達(dá)。淋巴細(xì)胞在FS/SSC散點圖中位置，即A門內(nèi)細(xì)胞; A門內(nèi)CD4陽性細(xì)胞，即B門內(nèi)細(xì)胞； B門內(nèi)TH細(xì)胞亞群分布：1 區(qū)數(shù)值-Th 1細(xì)胞(%)4 區(qū)數(shù)值-Th 2細(xì)胞(%)2 區(qū)數(shù)值-Th 0細(xì)胞(%)報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV%正常參考值Thl(IFN- 丫)：土 %Th2(IL-4): %ThO : %臨床意義淋巴細(xì)胞均分泌多種細(xì)胞因子：Thl細(xì)胞主要分泌IL-2 ,IL-12 ,IFN-

30、丫和TNF-b/a等，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4 . IL-5 . IL-6 , IFN- 丫為Thl最特異分泌的細(xì) 胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細(xì)胞因子，所以可根據(jù)分泌的細(xì)胞因子來 區(qū)分Thl與Th2。Thl為IFN- 丫 +，Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)(人的正常生理狀 態(tài)、即未受到任何刺激下Th0分化為Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅 含有極少量的Thl和Th2細(xì)胞，這時我們所能檢測的胞內(nèi)的IFN- 丫和IL-4 也微乎其微。當(dāng)Th細(xì)胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中 Th0 即會向Thl或Th2大量分化，此時我們檢測到的IFN- 丫和IL-4也較多。本實 驗的

31、檢測實際上是檢測Th細(xì)胞對刺激素刺激的反響能力。方案(Protocol )1*L UnUJFL1i LagMA細(xì)胞周期分析方法流式細(xì)胞儀BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特原理：利用特殊的熒光染料PI、EB A0等與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染 色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀 通過測定細(xì)胞的熒光強度推算出細(xì)胞的 DNA含量標(biāo)本采集與處理檢測對象實體腫瘤組織、灌洗液、石蠟塊、培養(yǎng)細(xì)胞要求1 實體腫瘤組織、灌洗液和培養(yǎng)細(xì)胞如果不能立即做應(yīng)用 冷乙醇固定，20C可保存2-3個月，70C可保存半年以 上。2.樣本計數(shù)應(yīng)在X106/ml試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫爾特成分1 : DNA-Prep試劑系統(tǒng)液體28C()(包括 DNA-Prep LPR和DNA-Prep 染料)2:鞘液液體20L室溫3:清洗液液體5L室溫4:熒光微球液體10ML2-8C (Flow-Check)儀器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：灌洗液或培養(yǎng)細(xì)胞1. PBS洗，稀釋為x 106/ml，取100ul,參加 DNA-Prep LPR 10秒后參加 DNA-Prep染料1ml,室溫避光15分鐘。2. 過300目濾網(wǎng)