生物固氮的15N2同位素示蹤直接測定方法ppt課件

1、生物固氮的15N2同位素示蹤直接測定方法齊孟文中國農(nóng)業(yè)大學(xué); 用15N同位素測定生物固氮的方法可分為間接和直接兩種方法，間接測定又包括15N富集同位素示蹤法和用15N自然豐度變異法，該兩種方法均需求參比作物或知參比值以確定生物的固氮量，因此普通有很大的不確定性，固氮量確實(shí)定只能是半定量的；直接測定法是將結(jié)合固氮系統(tǒng)暴露在15N2氣氣氛中，經(jīng)過直接測定15N吸收同化而確定其固氮的方法，這種方法是一種定量測定生物固氮的方法，但需求將固氮系統(tǒng)封鎖在一個(gè)氣密的固氮暴露箱內(nèi)，操作比較復(fù)雜，另外標(biāo)志同位素破費(fèi)較高，因此長期以來在研討運(yùn)用并不非常廣泛，然而隨著DNA或RNA探針技術(shù)的開展，直接固氮測定法在測

2、定固氮和確定固氮微生物的根底研討方面將展現(xiàn)寬廣的運(yùn)用前景。; 1.15N2的制備、純化和存儲(chǔ) 15N2可由15N標(biāo)志銨鹽在堿性條件下和次溴酸鹽反響制得，即 試劑 用Bremner法制備次溴酸鹽一碘溶液。將400克NaOH溶解到60毫升水中，將此NaOH溶液的一半?yún)⑴c帶有溫度計(jì)并以碎冰冷卻的一公升Ernlemeyer燒瓶中，將120毫升Br2緩慢地、逐滴地參與, 猛烈攪拌, 使溫度堅(jiān)持在5 以下，再參與另一半NaOH溶液，將此混合液攪拌幾分鐘，在冰箱中儲(chǔ)存一個(gè)星期之后, 將沉淀的NaBr結(jié)晶與上清液分開，用等體積的KI溶液0.2%，w/v稀釋上清液。1 毫升這種溶液可以使5-6毫克NH3+氧化成

3、N2。 100毫升水中依次溶解5克KMn4和2.5克KOH, 制成KMNO4-KOH溶液，100毫升硫酸溶液 5%，v/v 中溶解20克NaSO4, 得到NaSO4H2SO4溶液。O2HBrN2OBrNH22215-415; 安裝 制備安裝如下圖。各玻璃部分間是經(jīng)過涂抹硅油的磨口接合并用耐壓管道連結(jié)。圖中Y和Z分別為KMnO4-KOH和Na2SO4-H2SO4吸存器，15N2氣儲(chǔ)存瓶V與另一只瓶子W連結(jié), 可以防止空氣回流到V。選用大小不同的圓底燒瓶, 可以使X、Y 和Z部分的容積, 比試劑在一個(gè)大氣壓下產(chǎn)生的15N2 的總體積略微大一些，這時(shí)安裝內(nèi)部的氣壓應(yīng)該小于大氣壓。; 步驟 在燒瓶X中

4、放入(15NH4)2SO4，分液漏斗中參與相應(yīng)數(shù)量的次嗅酸鹽一碘溶液。在Y和Z中分別參與KMnO4-KOH溶液和Na2SO4-H2SO4溶液, 約到其容積的1/10即可。用真空泵從處抽氣, 使X的真空度到達(dá)大約10-2-10-3托，封鎖活栓a ，然后翻開分液漏斗的活栓, 將次嗅酸鹽一碘溶液滴入X中, 產(chǎn)生15N2氣，在產(chǎn)氣過程終了后， 將蒸餾水參與分液漏斗, 并使蒸餾水滴入燒瓶X中，當(dāng)瓶中 15N2的壓力稍大于大氣壓力時(shí), 滴漏過程便自動(dòng)停頓。; 翻開活塞b、c 、d、e 和f, 封鎖活塞g, 從活塞f處對(duì)Y和Z抽真空, 封鎖活塞c , 翻開活塞a , 小心地翻開活塞b 使X瓶中15N2的進(jìn)入

5、Y,待分液漏斗中的水完全置換出X瓶中的15N2 氣體后, 封鎖活塞b。封鎖活塞e并翻開活塞c, 從處放水進(jìn)入Y中， 置換15N2氣體使其轉(zhuǎn)至燒瓶Z , 關(guān)緊活塞d, 由活栓f連通Z和V, 并翻開活塞c和g，從處加水至Z中。這樣純化后的15N2氣體就被轉(zhuǎn)移至事先裝滿水的儲(chǔ)存瓶V中, 從V 排水至W瓶, 這種布置可阻止空氣從活栓h 處回流 15N2氣完全轉(zhuǎn)移到瓶V中之后, 將它和瓶W一同, 從活栓f和g之間, 與整個(gè)安裝系統(tǒng)開。;圖.制備15N2的安裝。X， 15N2發(fā)生器；Y，KMnO45%，w/v-KOH2.5%吸存器；Z，Na2SO420%-H2SO45%,v/v吸存器；V， 15N2 存儲(chǔ)

6、瓶；W，排水存儲(chǔ)瓶。1.蒸餾水，2.次溴酸鹽-碘溶液；315NH42SO4；4. KMnO4 - KOH溶液;5. Na2SO4-H2SO4 。; 2.固氮測定安裝和流程 固氮生長箱的室C與A和B經(jīng)過涂抹硅油的磨砂平邊接合在一同，在D、E、F、G和H管口有聚四氟乙烯栓塞閥，整個(gè)容器堅(jiān)持氣密形狀。15N2依次經(jīng)過堿性高錳酸鉀溶液和酸性硫酸鈉溶液并F口引入玻璃容器。在15N2 引入前，氣密容器先用真空泵抽真空，當(dāng)水下的泥土中由于負(fù)壓冒出氣泡時(shí)，繼續(xù)且堅(jiān)持幾分鐘后，然后引入15N2 使容器中的壓力到達(dá)大氣壓。為了堅(jiān)持作物的生理?xiàng)l件，運(yùn)用空氣泵經(jīng)過二氧化碳緩沖溶液循環(huán)密封室上端的進(jìn)口D和出口E的大氣相

7、。緩沖溶液由混合物組成K2CO31/20M-KHCO31/10M，緩沖液的構(gòu)成比例可以調(diào)理，以便頂部的CO2濃度維持在800ppm。;圖.15N2暴露氣密性生長室。A莖室；B，中間室；C，根室；D大氣循環(huán)進(jìn)口；E，大氣循環(huán)出口；F， 15N2 氣體入口；G，氣體采樣器附件；H，排水孔。; 3.同位素化學(xué)計(jì)量關(guān)系 設(shè)樣品中N來自大氣標(biāo)志Natm和非大氣非標(biāo)志Nnon兩部分組成，其15N原子百分超為Esample，且大氣標(biāo)志15N的原子百分超為Eatomsphere，那么由同位素質(zhì)量平衡，有 那么，樣品中的N來自大氣標(biāo)志N的比例為 atomsphereasamplenonaENENN）（atoms

8、heresamplenonaaatmEENNNP; 固氮的N量為 在整個(gè)固氮暴露過程中，也許由于系統(tǒng)外大氣的泄入或土壤N2的發(fā)射對(duì)氣相標(biāo)志15N2的稀釋作用，使得Eatomshere并不恒定，而是隨時(shí)間減少的，因此計(jì)算時(shí)應(yīng)取算術(shù)或積分平均值。atomsheresampletotalaEENN; 4.舉例 參見：Atmospheric dinitrogen fixation in the flooded rice rhizosphere as determined by the N-15 isotope technique. Soil Sci. Plant Nutr., 16 (4), 551-

9、559, 1980 表.在原位條件下水稻根際大氣固氮與固定氮的植物吸收樣品材料樣品材料干重（干重（g） N N含量（含量（%）1515N N原子百原子百分超（分超（%）固固N(yùn)量量（ g g）植物穗4.011.1600.00727莖和葉8.380.4100.01440根2.860.4120.04544土壤根區(qū)4000.1820.008481; 注：15N2被引入到固氮室上端的大氣相，在水稻生長室繼續(xù)固氮7天，期間上端大大氣中二氧化碳的濃度一直維持在800ppm左右。實(shí)驗(yàn)最初和最終測定得到的氣相標(biāo)志N2的15N原子百分超分別為為14.1%和10%。 計(jì)算：對(duì)于莖和葉，有 參考文獻(xiàn) 15N2 as a tracer of biological N2 fixation: A 75-year