雙向電泳技術(shù)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù)2第1頁/共67頁3第2頁/共67頁4 在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶鲋杏緞?dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。第3頁/共67頁5第4頁/共67頁6第5頁/共67頁7按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，

2、主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。第6頁/共67頁8第7頁/共67頁9第8頁/共67頁10聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegel electrophoresispolyacrylamidegel electrophoresis，簡稱PAGEPAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。PAGEPAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點(diǎn)等。第9頁/共67頁111、丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：幾乎無電滲作用?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對(duì)pHpH和溫度變化較穩(wěn)定。在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無色透明，有彈性，機(jī)械性能

3、好，易觀察。凝膠孔徑可調(diào)。分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。第10頁/共67頁122、聚丙烯酰胺凝膠的聚合第11頁/共67頁13催化劑和加速劑的種類AP-TEMEDAP-TEMED：化學(xué)聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過硫酸銨( (簡稱AP)AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活A(yù)crAcr單體，形成單體長鏈，在交聯(lián)劑BisBis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。核黃素-TEMED-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因?yàn)楹它S素在TEMEDTEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形

4、成自由基，從而引發(fā)聚合作用。第12頁/共67頁14第13頁/共67頁15丙烯酰胺會(huì)產(chǎn)生如下幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)：高濃度酸和堿會(huì)促進(jìn)其水解形成丙烯酸和NH3NH3。與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應(yīng)，生成- -芳氧基或烷氧基丙酰胺。在2020能NH3NH3反應(yīng)，生成、- -氮川三丙酰胺。與一些硫醇反應(yīng)，生成- -烷基丙酰胺。也會(huì)由于超聲、- -射線和自然光線引起聚合作用。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會(huì)受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。第14頁/共67頁16凝膠的孔徑可調(diào)性及其他性質(zhì)每100100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，用T%T%表示； T% = (a+b)/mT% = (

5、a+b)/ma a：丙烯酰胺克數(shù)；b b：N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)；m m：緩沖液體積( (毫升) )。3、聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑：第15頁/共67頁17第16頁/共67頁18濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)第17頁/共67頁19聚丙烯酰胺凝膠電泳的異常現(xiàn)象及解決辦法1.1.凝膠未聚合2.2.未加水層時(shí)凝膠聚合3.3.電泳后未能檢測出樣品4.4.樣品分離區(qū)帶寬或拖尾5.5.只顯一條區(qū)帶6.6.分離區(qū)帶呈條紋狀第18頁/共67頁20第19頁/共67頁21第20頁/共67頁22第21頁/共67頁232、聚焦效應(yīng)3、等電聚焦的分辨率第22頁/共67頁24第23頁/共67頁252、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的

6、形成有兩種方法產(chǎn)生pH梯度：用兩種不同的pH的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成pH梯度。這種方法形成的pH梯度很不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不使用。人工pH梯度。利用載體兩性電解質(zhì)在電場作用下自然形成pH梯度，常用該方法。天然pH梯度。第24頁/共67頁26第25頁/共67頁27 固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。第26頁/共67頁281、固相pH梯度的介質(zhì) 其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，它們與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有相似的聚合

7、行為。第27頁/共67頁292、固相pH梯度的建立 固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要?dú)w功于Immobilines試劑（Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基礎(chǔ)上開發(fā)的固相pH梯度（IPG）技術(shù)。Immobilines（固相試劑）是一系列性質(zhì)穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類的聚合行為。每個(gè)分子都有一個(gè)單一的酸性或堿性緩沖基團(tuán)與丙烯酰胺單連，其結(jié)構(gòu)式為： 其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價(jià)鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中。所以它是固相的，即使是在電場中也不會(huì)漂移。分子另一端的R基團(tuán)為弱酸或弱堿性的緩沖基團(tuán)，利用

8、緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH310范圍的緩沖體系。 所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時(shí)候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點(diǎn)后才形成pH梯度。第28頁/共67頁30固相固相pHpH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán)梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán)第29頁/共67頁314、固相pH梯度的優(yōu)點(diǎn)和注意事項(xiàng)3、固相pH梯度等電聚焦原理 蛋白質(zhì)分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，知道達(dá)到自己的等電點(diǎn)，停止遷移。 固相pH梯度可窄至pH0.1的范圍，因此分辨率極

9、高，可達(dá)0.001pH；pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇pH梯度和斜率；重復(fù)性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾小；對(duì)堿性蛋白質(zhì)也能很好的分離，無邊緣效應(yīng)，故可用很窄的膠條（如5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相 pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時(shí)候需要高電壓，電泳時(shí)間長，窄范圍pH測定困難，只能計(jì)算。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：溫度：20-30；電壓：梯度上升。第30頁/共67頁32加樣方式第31頁/共67頁33等等電電聚聚焦焦電電泳泳進(jìn)進(jìn)行行過過程程中中等等電電聚聚焦焦電電泳泳結(jié)結(jié)束束后后（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH第32頁/共67頁34第33頁

10、/共67頁35連續(xù)電泳不連續(xù)電泳濃縮效應(yīng)凝膠層緩沖液離子成分pH電位梯度濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)第34頁/共67頁362、影響凝膠聚合的因素 形成凝膠試劑的純度 凝膠濃度 溫度和氧氣的影響：23-253、聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)第35頁/共67頁37第36頁/共67頁382、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響因素 溶液中SDS單體的濃度 二硫鍵是否完全還原 緩沖系統(tǒng)的選擇 凝膠濃度的選擇第37頁/共67頁39凝膠電泳的操作要點(diǎn)1.1.凝膠制備2.2.電極緩沖液3.3.樣品處理及加樣4.4.電泳5.5.染色與固定6.6.脫色7.7.分析第38頁/共67頁40？

11、pH值不對(duì)=第39頁/共67頁41第40頁/共67頁42第41頁/共67頁43二、流程（一）樣品制備（二）第一向：等電聚焦 1、加樣 2、運(yùn)行（三）膠條的平衡（四）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（五）膠上蛋白的檢測 1、考馬斯亮藍(lán)染色 2、銀染 3、負(fù)染 4、熒光染色第42頁/共67頁44（六）雙向電泳凝膠的檢測 1、目測 2、自動(dòng)化檢測 3、雙向電泳的數(shù)據(jù)庫（七）雙向凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)： 1、低拷貝蛋白的檢測受限； 2、極酸或極堿蛋白的分離較難； 3、分子質(zhì)量極大或極小蛋白的分離較難； 4、難溶蛋白的檢測較困難； 5、得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)第43頁/共67頁45第

12、44頁/共67頁46第45頁/共67頁47第46頁/共67頁48IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g /125 l200500ug/125 l11cm50200 g /185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 l第47頁/共67頁49第48頁/共67頁50預(yù)分步預(yù)分步收集收集細(xì)胞漿細(xì)胞漿細(xì)胞核細(xì)胞核 細(xì)胞膜細(xì)胞膜核糖體及其核糖體及其他特定細(xì)胞他特定細(xì)胞成

13、份成份細(xì)胞分細(xì)胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范圍陣列分離范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋低豐度或交叉覆蓋蛋白白陣列那些亞細(xì)胞定位陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì)位置的功能蛋白質(zhì)3倍3倍亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖第49頁/共67頁51第50頁/共67頁52IEF的基本條件的基本條件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt

14、-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min 2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinear LinearLinear LinearRapidRapid第51頁/共67頁53第52頁/共67頁54第53頁/共67頁55

15、第54頁/共67頁56第55頁/共67頁57第56頁/共67頁58第57頁/共67頁59第58頁/共67頁60第59頁/共67頁61第60頁/共67頁62第61頁/共67頁63第62頁/共67頁64第63頁/共67頁65質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程 樣品制備樣品制備 與與IPG膠條水膠條水化化 IPG電泳電泳 與上樣緩沖液浸潤與上樣緩沖液浸潤 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)PVDF膜膜 膠內(nèi)直接染色膠內(nèi)直接染色 染色染色 取出蛋白點(diǎn)取出蛋白點(diǎn) 胰酶等消化胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上濃縮于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指紋肽指紋圖圖 數(shù)據(jù)庫查詢數(shù)據(jù)庫查詢 蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定 已知已知 反向反向HPLC分離分離 MALDI-MS，PSD片段分片段分析析示知示知 ESI-MS-MS、微測序、微測序 第64頁/共67頁66實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)）色譜純化蛋白質(zhì)）肽混合物肽混合物質(zhì)譜測定肽質(zhì)量質(zhì)譜測定肽質(zhì)量（MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)計(jì)算方法計(jì)算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫