化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則(最終 Microsoft W

1、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 GB#-2004前言本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：國家環(huán)境保護(hù)總局南京環(huán)境科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：目 錄1適用范圍.32化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗方法.32.1環(huán)境行為特性試驗.32.1.1土壤降解.32.1.2水解.42.1.3光解.62.1.4土壤吸附作用.82.1.5土壤淋溶作用.112.1.6揮發(fā)性.142.1.7生物富集作用.162.2對非靶生物毒性試驗.182.2.1鳥類毒性試驗.182.2.2蜜蜂毒性試驗.202.2.3家蠶毒性試驗.222.2.4魚類毒性試驗.242.2.5溞類毒性試驗

2、.262.2.6藻類毒性試驗.292.2.7蚯蚓毒性試驗.312.2.8土壤微生物毒性試驗.332.2.9天敵赤眼蜂毒性試驗.352.2.10天敵兩棲類毒性試驗.362.2.11作物的敏感性試驗.38參考文獻(xiàn).411 適用范圍本準(zhǔn)則規(guī)定了化學(xué)農(nóng)藥登記環(huán)境生態(tài)學(xué)試驗的方法、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)處理、評價標(biāo)準(zhǔn)及評價結(jié)論編寫等基本要求。本準(zhǔn)則適用于為化學(xué)農(nóng)藥登記環(huán)境管理所需進(jìn)行的環(huán)境生態(tài)學(xué)試驗。2 化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗方法2.1環(huán)境行為特性試驗2.1.1土壤降解土壤降解指在土壤中殘留農(nóng)藥逐漸由大分子分解成小分子，直至失去毒性和生物活性的全過程，農(nóng)藥在土壤中的降解特性是評價農(nóng)藥對整個生態(tài)環(huán)境影響的一個重

3、要指標(biāo)，農(nóng)藥在土壤中的降解速率通常用降解半衰期t0.5表示。（1）試驗材料供試土壤：采集3種有代表性的新鮮農(nóng)田耕層土壤，經(jīng)風(fēng)干、過2mm篩，貯于5冰箱內(nèi)備用，并測定土壤pH、有機(jī)質(zhì)、陽離子代換量和機(jī)械組成。供試農(nóng)藥：將農(nóng)藥純品（或原藥）溶于水中，難溶于水的農(nóng)藥，可用少量對農(nóng)藥降解無干擾影響的有機(jī)溶劑助溶(如乙醇、丙酮等)，加量不超過1%。主要儀器設(shè)備：培養(yǎng)箱、氣相色譜、液相色譜等分析儀器。（2）試驗方法稱20g土壤于三角瓶中，先加入一定量的農(nóng)藥拌勻后，加水將土壤含水量調(diào)節(jié)到田間持水量的60%，塞上棉塞，不同土壤均重復(fù)處理10份樣品，置于251黑暗的恒溫箱中培養(yǎng)，定期取樣，分別測定土壤中農(nóng)藥殘留

4、量，至土壤中農(nóng)藥的降解率達(dá)90%以上時終止。培養(yǎng)過程中及時調(diào)節(jié)三角瓶內(nèi)水分含量，以保持原有持水狀態(tài)。用于水田的農(nóng)藥，須增加漬水條件下的降解試驗，即在上述試驗處理基礎(chǔ)上，三角瓶中的持水量加大到土壤表面有1cm水層，其它條件相同。（3）數(shù)據(jù)處理試驗結(jié)果采用指數(shù)回歸方程，求農(nóng)藥在土壤中的降解半衰期，最常用的計算公式如下：Ct=C0e-k t C0：土壤中農(nóng)藥初始濃度(mg/kg) Ct：t時土壤中農(nóng)藥殘留濃度(mg/kg) k：降解速率常數(shù) t：培養(yǎng)時間t0.5：降解半衰期（4）質(zhì)量要求 土壤中農(nóng)藥殘留量分析方法回收率為70110%，最低檢測濃度滿足檢測要求。 初始濃度110mg/kg。 降解動態(tài)曲

5、線至少7個點，其中5個點濃度為初始濃度的2070%。 試驗時間至農(nóng)藥降解率90%以上；對難降解農(nóng)藥，試驗時間至少180天。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)農(nóng)藥在土壤中降解(或消解)半衰期的長短，及其可能對生態(tài)環(huán)境造成的影響，將農(nóng)藥在土壤中的殘留性劃分成五個等級，見表1。表1 農(nóng)藥在土壤中的殘留性等級劃分等級半衰期t 0.5(月)降解性I12難降解（6）試驗報告試驗報告須包括下列內(nèi)容： 供試農(nóng)藥：通用名、化學(xué)名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號、純度、基本理化性質(zhì)。 供試土壤：pH、有機(jī)質(zhì)含量、陽離子代換量、機(jī)械組成。 主要儀器設(shè)備：培養(yǎng)箱、分析儀器等。 試驗條件：溫度、持水量、初始濃度、取樣時間。 土壤中農(nóng)藥殘留量分析：

6、樣品前處理、測定條件、線性范圍、添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、最小檢測量、譜圖等。 試驗結(jié)果：降解曲線、半衰期、相關(guān)系數(shù)及土壤降解性評價。2.1.2水解水解是指物質(zhì)在水中引起的化學(xué)分解現(xiàn)象，是農(nóng)藥非生物降解的主要形式之一。農(nóng)藥的水解速率，通常用水解半衰期t0.5表示。（1）試驗材料供試農(nóng)藥：采用農(nóng)藥純品（或原藥）溶于水中，難溶于水的農(nóng)藥，可加少量對農(nóng)藥降解無干擾影響的有機(jī)溶劑助溶(如乙醇、乙腈和丙酮等)，加量不超過1%（V/V）。主要儀器設(shè)備：培養(yǎng)箱、pH計、滅菌鍋、氣相色譜、液相色譜等分析儀器。不同酸堿度的緩沖溶液：pH5.0：500 mL 0.10 mol/L 苯二甲酸氫鉀溶液加239 mL

7、0.1mol/L氫氧化鈉溶液，再加蒸餾水定容至1000mL。 pH7.0：500 mL 0.10 mol/L 磷酸二氫鉀溶液加296 mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，再加蒸餾水定容至1000mL。 pH9.0：500 mL 1:1的 0.10 mol/L 硼砂與0.10 mol/L氯化鉀溶液中，加 213mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，再加蒸餾水定容至1000mL。（2）試驗方法 預(yù)試驗分別用pH 5.0、7.0和9.0的緩沖溶液配制濃度 0.01mol/L或50%飽和濃度的農(nóng)藥水溶液于具塞三角瓶中，難溶于水的農(nóng)藥助溶劑加量不超過1%。置于501恒溫條件下培養(yǎng)5d測定農(nóng)藥含量，如水解率

8、小于10%，可認(rèn)為該農(nóng)藥具有化學(xué)穩(wěn)定性，無須進(jìn)一步做水解試驗；如水解率大于等于10%，則須進(jìn)一步進(jìn)行25與50時的水解試驗。 正式試驗配制2組pH 5.0、7.0和9.0的農(nóng)藥水溶液系列，分別置于251及501的培養(yǎng)箱中，從開始培養(yǎng)起，定期采集水樣7次以上，測定水樣中農(nóng)藥含量，確定其水解動態(tài)，至水解率達(dá)90%以上終止。上述緩沖溶液與供水解試驗用的容器均須經(jīng)高溫高壓滅菌。滅菌后的溶液需重新校正pH，整個試驗過程中須避光及避免氧化作用等的影響。（3）數(shù)據(jù)處理大多數(shù)農(nóng)藥的水解規(guī)律遵循一級動力學(xué)方程，試驗結(jié)果可按下列公式求得水解半衰期t0.5。Ct=C0e-k t C0：農(nóng)藥的起始濃度(mg/L)Ct

9、：t時的農(nóng)藥濃度(mg/L)k：水解速率常數(shù)t：反應(yīng)時間t0.5：水解半衰期（4）質(zhì)量要求 水中農(nóng)藥殘留量測定方法回收率為70110%，最低檢測濃度滿足檢測要求。 試驗溫度誤差要求1。 降解動態(tài)曲線至少7個點，其中5點濃度值為初始濃度的2070%。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)農(nóng)藥水解半衰期的大小，及其可能對生態(tài)環(huán)境造成的影響，將農(nóng)藥的水解特性劃分成五個等級（表2）。 表2 農(nóng)藥水解特性等級劃分等級半衰期t 0.5(月)降解性I12難水解（6）試驗報告試驗報告須包括下列內(nèi)容： 供試農(nóng)藥：通用名、化學(xué)名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號、純度、基本理化性質(zhì)。 緩沖溶液：pH5.0、7.0和9.0緩沖溶液的制備。 主要儀器

10、設(shè)備：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、氣相色譜、液相色譜等分析儀器。 試驗條件：農(nóng)藥水溶液配制方法、初始濃度、滅菌條件、酸度、溫度、采樣時間。 水中農(nóng)藥殘留量分析：測定條件、線性范圍、添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、最小檢測量。 試驗結(jié)果：水解曲線、水解半衰期、相關(guān)系數(shù)、水解特性評價。2.1.3光解光解系指農(nóng)藥在光誘導(dǎo)下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，它是農(nóng)藥非生物降解的重要途徑。（1）試驗材料供試農(nóng)藥：純品農(nóng)藥（或原藥）用蒸餾水溶解制得農(nóng)藥水溶液，對難溶于水的農(nóng)藥可加少量乙腈助溶，不能用光敏性有機(jī)溶劑。主要儀器設(shè)備：光化學(xué)反應(yīng)裝置、光源（氙燈）、氣相色譜、液相色譜等分析儀器、紫外強(qiáng)度計、照度計等。（2）試驗方法配制一定濃度的農(nóng)藥

11、水溶液系列，于石英光解反應(yīng)管中，蓋緊，然后將光解管置于光化學(xué)反應(yīng)裝置中進(jìn)行光解試驗。光源采用人工光源氙燈，反應(yīng)器內(nèi)溫度為252C。試驗過程中定期取水樣7次以上，測定水樣中農(nóng)藥濃度的變化，記錄光照強(qiáng)度和紫外強(qiáng)度，至光解率達(dá)90%以上時終止。同時設(shè)黑暗條件下的對照試驗。整個光解試驗期內(nèi)隔離其它光源，以減少對試驗結(jié)果的影響。（3）數(shù)據(jù)處理大多數(shù)農(nóng)藥的光解遵循一級動力學(xué)方程，試驗結(jié)果可按下列公式求得光解半衰期t0.5。Ct=C0e-k t C0：農(nóng)藥起始濃度(mg/L)Ct：t時農(nóng)藥濃度(mg/L)k：光解速率常數(shù)t：反應(yīng)時間t0.5：光解半衰期（4）質(zhì)量要求 水中農(nóng)藥殘留量測定方法回收率為70110

12、%，最低檢測濃度滿足檢測要求。 光解動態(tài)曲線至少7個點，其中5點濃度值為初始濃度的2070%。 試驗用蒸餾水pH為6.07.5，對于有離子化或質(zhì)子化反應(yīng)的物質(zhì)，須用兩級pH溶液作試驗。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)農(nóng)藥光解半衰期的大小，及其可能對生態(tài)環(huán)境造成的影響，將農(nóng)藥的光解特性劃分成五個等級（表3）。表3 農(nóng)藥光解特性等級劃分等級半衰期t 0.5降解性I24易光解II較易光解III中等光解IV較難光解V難光解氙燈：受體接受光強(qiáng)4000Lux，紫外強(qiáng)度25w/cm2。（6）試驗報告試驗報告須包括下列內(nèi)容： 供試農(nóng)藥：通用名、化學(xué)名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號、純度、水溶解度及其它理化性質(zhì)。 主要儀器設(shè)備：光解裝

13、置、氣相色譜、液相色譜等分析儀器。 試驗條件：光源、光強(qiáng)和紫外強(qiáng)度、試驗溫度、取樣時間。 水中農(nóng)藥殘留量分析：測定條件、線性范圍、添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、最小檢測量。 試驗結(jié)果：光解曲線、半衰期、相關(guān)系數(shù)、光解特性評價。2.1.4土壤吸附作用農(nóng)藥在土壤中的吸附作用，是物質(zhì)在固液兩相間的分配達(dá)到平衡時的比值，通常用吸附常數(shù)Kd表示。農(nóng)藥在土壤中的吸附性能，是評價農(nóng)藥在環(huán)境中的移動性、持留性，以及農(nóng)藥進(jìn)入環(huán)境后的生物活性與毒性的重要指標(biāo)。 （1）試驗材料供試農(nóng)藥：農(nóng)藥純品（或原藥），溶于0.01mol/L CaCl2溶液中，配成不同濃度的藥液，對難溶于水的農(nóng)藥，可用少量有機(jī)溶劑助溶(如乙腈、丙酮

14、)。 供試土壤：選擇質(zhì)地為砂土、壤土和粘土，其它性質(zhì)相似的三種土壤，風(fēng)干、過2mm篩待用。主要儀器設(shè)備：恒溫振蕩器、高速離心機(jī)、氣相色譜、液相色譜等分析儀器等。（2）試驗方法 預(yù)試驗分別稱取一定量的三種供試土壤于具塞三角瓶中，加入一定體積濃度小于5mg/L的農(nóng)藥水溶液（0.01mol/L CaCl2 介質(zhì)），以保持水土比為5:1、10:1、20:1或100:1（視Kd值大小而定）。塞緊瓶塞，置于恒溫振蕩器中，于252C 下，振搖24h達(dá)到平衡后，將土壤懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管中，高速離心，吸取上清液，測定清液農(nóng)藥含量。若吸附率大于25%，則需進(jìn)行解析試驗和正式吸附試驗。同時設(shè)置未加土壤的農(nóng)藥水溶液（

15、0.01mol/L CaCl2介質(zhì)）空白處理。 解析試驗分離出上清液后，在土壤固相中加入一定體積的0.01mol/L CaCl2溶液，振搖24h后離心分離，測定上清液中農(nóng)藥含量。重復(fù)操作1次，合計2次清液中農(nóng)藥含量，求得農(nóng)藥解析率。若解析率小于75%，需進(jìn)行質(zhì)量平衡試驗。 質(zhì)量平衡試驗選擇適當(dāng)?shù)奶崛?，提?。?次）測定吸附在土壤中的農(nóng)藥含量，以驗證吸附試驗過程中農(nóng)藥質(zhì)量的平衡。 正式試驗配制推薦濃度分別為0.04、0.20、1.00和5.00mg/L的農(nóng)藥水溶液系列（對低溶解度農(nóng)藥，可適當(dāng)降低試驗濃度），同預(yù)試驗操作，進(jìn)行土壤吸附正式試驗，求出吸附常數(shù)。（3）數(shù)據(jù)處理 吸附率（A）吸附率可由下

16、式計算：式中，M未加土壤的農(nóng)藥水溶液平衡時農(nóng)藥含量（mg）Ce經(jīng)土壤吸附平衡時水相中農(nóng)藥濃度（mg/L）V0水溶液體積（mL）x吸附于土壤中的農(nóng)藥量（mg） 解析率（D）其中，C1第1次解析濃度（mg/L）C2第2次解析濃度（mg/L）V吸附試驗后水相體積（mL） 吸附常數(shù)（Kd）分子型有機(jī)農(nóng)藥的土壤吸附規(guī)律，可用弗侖德利奇（FreundLich）方程來描述： Cs=Kd Ce1/n Cs=x/m其中，Cs土壤對農(nóng)藥的吸附濃度（mg/kg） Kd土壤吸附系數(shù) 1/nCs與Ce關(guān)系曲線斜率 m土壤重量kg 將測定結(jié)果代入FruendLich吸附公式，可求得Kd值。LnKd=LnCs1/nLnCe

17、土壤有機(jī)質(zhì)對農(nóng)藥吸附作用影響很大，農(nóng)藥在土壤中的吸附作用，也可用土壤的吸附系數(shù)Koc表示，計算公式如下：（4）質(zhì)量要求 土壤、水中農(nóng)藥殘留量測定方法回收率為70110%，最低檢測濃度滿足檢測要求。 助溶劑(如乙腈、丙酮)加量小于0.2%(V/V)。 質(zhì)量平衡試驗回收率大于75%；對回收率小于75%農(nóng)藥，該方法不適用。 （5）評價標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)農(nóng)藥土壤吸附常數(shù)Kd的大小，可將農(nóng)藥的吸附性劃分成五個等級（表4）。表4 農(nóng)藥土壤吸附性等級劃分等級Kd吸附性I200易吸附II50200較易吸附III2050中等吸附IV520較難吸附V50易淋溶IIR3+ R450可淋溶IIIR2 +R3+R450較難淋溶

18、IVR150難淋溶（6）試驗報告試驗報告須包括下列內(nèi)容： 供試農(nóng)藥：純度、水溶解度、吸附系數(shù)、正辛醇/水分配系數(shù)等。 供試土壤：pH、有機(jī)質(zhì)含量、陽離子代換量、機(jī)械組成。 主要儀器設(shè)備：層析槽、氣相色譜、液相色譜等分析儀器。 試驗條件：土壤薄層制備及參數(shù)、點樣量、展開時間；土柱內(nèi)徑與長度、加藥量、加水量、淋出水量、淋溶時間等。 土壤和水中農(nóng)藥殘留量分析：測定條件、線性范圍、添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、最小檢測量。 試驗結(jié)果：農(nóng)藥在不同土壤薄層中的分布曲線和Rf值、移動性評價；農(nóng)藥在不同土柱中的分布和移動性評價。2.1.6揮發(fā)性揮發(fā)性是指農(nóng)藥在自然條件下以分子擴(kuò)散形式逸入大氣中的現(xiàn)象。農(nóng)藥揮發(fā)作用

19、的大小與農(nóng)藥蒸氣壓及環(huán)境條件有關(guān)。農(nóng)藥揮發(fā)性的大小，會影響農(nóng)藥在土壤中的持留性及其在環(huán)境中的再分配，揮發(fā)性大的農(nóng)藥一般持留時間較短，而在環(huán)境中的影響范圍較大。（1）試驗材料供試農(nóng)藥：農(nóng)藥純品或原藥。供試土壤：選擇一種有代表性的土壤。試驗裝置：氣流式密閉模擬裝置。（2）試驗方法農(nóng)藥揮發(fā)性的測定分兩步進(jìn)行，即估測法和吸收法。 估測法根據(jù)農(nóng)藥的水溶性（S）、蒸氣壓（P）和土壤吸附常數(shù)（Kd），通過下列公式可計算求得不同介質(zhì)中農(nóng)藥的揮發(fā)性。農(nóng)藥在空氣中的揮發(fā)性式中，V是農(nóng)藥的揮發(fā)速率；P是蒸氣壓(Pa)；M是農(nóng)藥的分子量。即農(nóng)藥的揮發(fā)作用與農(nóng)藥的蒸氣壓與分子量的大小成正比。 農(nóng)藥在水中的揮發(fā)性 式中

20、Vw/a是農(nóng)藥在水中的揮發(fā)速率；S是農(nóng)藥在水中的溶解度(mg/L)；T為絕對溫度(K)；Cw為農(nóng)藥在水中的濃度(mg/L)；Ca為農(nóng)藥在空氣中的濃度(mg/L)。 農(nóng)藥在土壤中的揮發(fā)性（Vsw/a） 式中 Vsw/a是農(nóng)藥在土壤中的揮發(fā)速率；Kd為農(nóng)藥在土壤中的吸附常數(shù)；r為土壤中土/水的重量比。若Vw/a106，則需進(jìn)一步采用吸收法，分別測定農(nóng)藥在空氣、水和土壤中的揮發(fā)性。 吸收法農(nóng)藥在空氣中的揮發(fā)性：取一定量的供試農(nóng)藥于10cm直徑培養(yǎng)皿中，置于一個由真空干燥器組成的氣流式密閉系統(tǒng)（如圖1所示）中，在2025C條件下起動空氣泵，以500mL/min的流速通過密閉裝置中的培養(yǎng)皿表面，使揮發(fā)出

21、來的農(nóng)藥隨氣流通過二級吸收管，截留在吸收液中，24h后測定吸收液中的農(nóng)藥含量，即為農(nóng)藥的揮發(fā)量。同時測定培養(yǎng)皿中殘留的農(nóng)藥含量。農(nóng)藥在水中的揮發(fā)性：配制一定量的農(nóng)藥水溶液于10cm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，置于氣流式密閉系統(tǒng)運(yùn)行24h后，分別測定吸收液及水中農(nóng)藥含量。農(nóng)藥在土壤表面的揮發(fā)性：稱50g土壤平鋪于10cm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，加10mL蒸餾水，使土壤持水量約為飽和持水量的60%。然后均勻加入一定量的供試農(nóng)藥，置于氣流式密閉系統(tǒng)運(yùn)行24h后，分別測定吸收液及土壤中農(nóng)藥含量。進(jìn)入吸收系統(tǒng)的空氣須經(jīng)過活性炭凈化，以免外來污染物進(jìn)入系統(tǒng)。整個測定過程須避光，以防光解作用的影響。（3）數(shù)據(jù)處理根據(jù)測

22、定結(jié)果，分別求得揮發(fā)量、揮發(fā)率和揮發(fā)試驗回收率。Rv(%)= 100 R(%)= 100式中：Rv揮發(fā)率(%)，mv揮發(fā)量(mg)，m0加入量(mg)；R揮發(fā)試驗回收率(%)，mR殘留量(mg)。（4）質(zhì)量要求 農(nóng)藥殘留測定方法回收率為70110%，最低檢測濃度滿足測定要求。 揮發(fā)試驗回收率70110%。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Vw/a的大小，可將農(nóng)藥揮發(fā)性能分為四級（表6）。表6 農(nóng)藥揮發(fā)性等級劃分等級估算法實測法揮發(fā)性Vw/aRv（%）I20易揮發(fā)II1041051020中等揮發(fā)性III105106110微揮發(fā)性IV1061難揮發(fā)（6）試驗報告試驗報告須包括下列內(nèi)容： 供試農(nóng)藥：通用名、化學(xué)名稱

23、、結(jié)構(gòu)式、CAS號、純度、水溶解度及其它理化性質(zhì)。 供試土壤：pH、有機(jī)質(zhì)含量、陽離子代換量、機(jī)械組成。 主要儀器設(shè)備：氣流式密閉裝置、氣相色譜、液相色譜等分析儀器。 試驗條件：試驗溫度、氣體流速、試驗時間、避光條件。 不同介質(zhì)中農(nóng)藥殘留量分析：提取方法、測定條件、線性范圍、添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、最小檢測量。 試驗結(jié)果：估算結(jié)果、農(nóng)藥在空氣、水、土壤介質(zhì)中的揮發(fā)性測定結(jié)果與評價。2.1.7生物富集作用生物富集作用是評價環(huán)境中的殘留農(nóng)藥對生物體及整個生態(tài)系統(tǒng)危害性的一個重要指標(biāo)。生物富集作用通常用生物富集系數(shù)BCF表示，它是在穩(wěn)定平衡狀態(tài)下生物體受試物含量與試驗水體中受試物濃度之比。測定生物

24、富集系數(shù)的方法有靜態(tài)法、半靜態(tài)法與動態(tài)法三種，對一般農(nóng)藥，通常采用靜態(tài)法或半靜態(tài)法；對易降解與強(qiáng)揮發(fā)的農(nóng)藥，采用動態(tài)法。（1）試驗材料供試魚種：建議用鯉魚、斑馬魚作試驗材料。試驗魚健康，大小均勻，體長約3cm，試驗前在室內(nèi)馴養(yǎng)一周，預(yù)養(yǎng)期間生長正常，死亡率5%。供試農(nóng)藥：試驗農(nóng)藥用純品（或原藥），難溶于水的可用少量低毒、不易降解的有機(jī)溶劑（如叔丁醇或二甲亞砜）助溶，加量0.1mL/L。（2）試驗方法試驗用水為經(jīng)曝氣去氯處理24h的自來水，配制藥液濃度分別為急性毒性LC50(96h)的1/10和1/100兩個處理。每一處理不得小于20升試液，設(shè)置3個平行。每組投放20尾魚，在2220C的恒溫條件

25、下飼養(yǎng)，試驗過程中定期測定水中溶解氧的含量，于0、6、24、48、96、144、192h分別從各處理中取水樣測定農(nóng)藥含量的變化，并喂給適量飼料，至第8天時取出全部魚樣，稱體重后每組分成兩份測魚體內(nèi)農(nóng)藥含量。同時設(shè)置對照處理試液（不加入試驗魚）。（3）數(shù)據(jù)處理用對照組水體中農(nóng)藥的含量，來校正養(yǎng)魚組水體中的農(nóng)藥含量，求出被魚體攝入農(nóng)藥的真實值。在試驗結(jié)束時水體及魚體中農(nóng)藥含量變化已達(dá)到平衡，則此時魚體對農(nóng)藥的富集系數(shù)為：BCF=Cfs / Cws式中，Cfs已達(dá)到平衡時魚體內(nèi)農(nóng)藥含量(mg/kg)Cws已達(dá)到平衡時水體中農(nóng)藥含量(mg/L)如果在試驗結(jié)束時，水體中農(nóng)藥濃度尚未達(dá)到平衡，則用上述公式

26、求出的富集系數(shù)值應(yīng)注明是8天的結(jié)果，即用BCF8d表示。（4）質(zhì)量要求 水和魚體中農(nóng)藥殘留量測定方法回收率為70110%，最低檢測濃度滿足測定要求。 試驗結(jié)束時，試驗液農(nóng)藥含量不低于規(guī)定濃度的80%，空白對照供試農(nóng)藥損失量不顯著。 試驗期間水中溶解氧不得低于5mg/L。 試驗魚在試驗期間不應(yīng)有異常反應(yīng)或健康狀況惡化。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)BCF值的大小，可將農(nóng)藥生物富集性分為三級（表7）。表7 農(nóng)藥生物富集等級劃分等級BCF富集等級I103高富集（6）試驗報告試驗報告須包括下列內(nèi)容： 供試農(nóng)藥：通用名、化學(xué)名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號、純度、水溶解度、物化性質(zhì)、吸附性、正辛醇/水分配系數(shù)。 供試魚種：種

27、名、來源、馴化時間、馴化條件、食物種類與數(shù)量、魚齡和規(guī)格。 試驗條件：試驗時間、周期、溫度、試驗容器、農(nóng)藥濃度、pH、溶解氧、助溶劑及濃度、試驗魚數(shù)量、投食時間和數(shù)量等。 水和魚體中農(nóng)藥殘留量分析方法：樣品提取、測定條件、線性范圍、添加回收率、最小檢測量。 試驗結(jié)果：試驗期間魚死亡率、異常反應(yīng)、表征變化；富集系數(shù)對時間的曲線、生物富集系數(shù)BCF值及生物富集性評價。2.2對非靶生物毒性試驗2.2.1鳥類毒性試驗通過測定農(nóng)藥對鳥類的LC50或LD50，評價農(nóng)藥對鳥類的急性毒性，提供農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境影響的資料。國際上常用的試驗鳥類有鴿、鵪鶉、雉、野鴨等。鵪鶉飼養(yǎng)方便，是理想的試驗生物。（1）試驗材料試

28、驗生物：供試鵪鶉（Coturnix coturnix japonica）用同一批大小均勻的鵪鶉蛋孵化，飼養(yǎng)約30天，體重約90110克，健康、活潑、雌雄各半的鵪鶉用于試驗。試驗前一天停止喂食，僅供清水。試驗藥品：供試藥品用制劑或純品，溶于水或植物油中，配制成一定濃度供試驗用。試驗條件：室溫在252C，光照采用自然光照。主要儀器設(shè)備：試驗用鳥籠（大小約為300cm2/鵪鶉）、注射器、移液管、容量瓶、燒杯等玻璃器皿。（2）試驗方法經(jīng)口一次性染毒法：供試鵪鶉以經(jīng)口灌注法一次性給藥0.51.0 mL /鵪鶉，連續(xù)7 d觀察受試鵪鶉的死亡情況與中毒癥狀。正式試驗前先做預(yù)試，以較大的間距設(shè)置45個濃度組，

29、求出受試物質(zhì)對受試鳥的最低全致死劑量和最高全存活劑量。正式試驗時，在此劑量范圍內(nèi)按一定間距設(shè)置57個劑量組，每組10只鵪鶉（雌雄各半），并設(shè)空白對照組，使用溶劑助溶的還需增設(shè)溶劑對照組。試驗在252C與正常的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行，記錄試驗鵪鶉的死亡數(shù)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計，求出LD50值及95%置信限。喂飼法：將農(nóng)藥定量拌入飼料中進(jìn)行喂飼，試驗時間為8天。前5天喂含藥飼料，后3天喂正常飼料。正式試驗前先做預(yù)試，可設(shè)置45個濃度組，求出受試物質(zhì)對受試鳥的最低全致死濃度和最高全存活濃度。正式試驗時，在此濃度范圍內(nèi)按一定間距設(shè)置57個濃度組，每個處理10只鵪鶉（雌雄各半）。對照組喂正常飼料。試驗在252

30、C與正常的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行，定期觀察記錄鵪鶉的中毒癥狀和死亡情況。試驗觀察期為8天，死亡數(shù)字8天累計。計算并求出LC50值及95%置信限。（3） 數(shù)據(jù)處理 鳥類半數(shù)致死劑量LD50或半數(shù)效應(yīng)濃度LC50的計算可采用寇氏法、直線內(nèi)插法或概率單位圖解法估算，也可應(yīng)用有關(guān)毒性數(shù)據(jù)計算軟件進(jìn)行分析和計算?？苁戏ǎ河每苁戏汕蟪鲽B類在24、48、72、96、120、144及168 h的LD50或LC50值及95%置信限。 ：計算公式 式中，Xm最高濃度的對數(shù)；i相鄰濃度比值的對數(shù)；P各組死亡率的總和（以小數(shù)表示）。 ：95%置信限的計算 先求標(biāo)準(zhǔn)誤：式中，p1個組的死亡率； q1-p；i相鄰濃度比值的對數(shù)

31、；n各濃度組鳥的數(shù)量。 直線內(nèi)插法 采用線性刻度坐標(biāo)，繪制死亡百分率對試驗物質(zhì)濃度的曲線，求出50%死亡時的LD50（LC50）值。概率單位圖解法用半對數(shù)紙，以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，死亡百分率對應(yīng)的概率單位為縱坐標(biāo)繪圖。將各實測值在圖上用目測法畫一條相關(guān)直線，從直線中讀出致死50%的濃度對數(shù)，估算出LD50（LC50）值。（4）質(zhì)量控制 投喂藥品期間，農(nóng)藥含量不能低于規(guī)定含量的80%。 試驗結(jié)束時，對照組死亡率不超過10%。 試驗鳥類的生理和行為，應(yīng)適應(yīng)試驗環(huán)境條件和基本食物。 對鳥類低毒農(nóng)藥，設(shè)計試驗劑量LD50值達(dá)1000mg/kg，可不再提高試驗劑量。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)毒性測定結(jié)果，將農(nóng)藥對

32、鳥類的急性毒性劃分為四個等級（見表8）。表8 農(nóng)藥對鳥類的等級劃分毒性等級急性經(jīng)口（mg/kg）喂飼（mg/kg）劇毒LD5010LC5050高毒10LD505050LC50500中毒50LD50500500LC501000低毒LD50500LC501000（6） 試驗報告 受試樣品名稱、來源、純度。 試驗生物的名稱、來源、大小及飼養(yǎng)情況。 試驗條件：試驗溫度、方法等。 24、48、72h及7d的LD50或24、48、72、96、120h及8d的LC50值和95%置信限，并給出所采用的計算方法。 對照組及處理組是否出現(xiàn)死亡及異常反應(yīng)。 試驗結(jié)果及毒性評價。2.2.2蜜蜂毒性試驗蜜蜂是一類重要的

33、環(huán)境生物，它既采花釀蜜，又傳授花粉，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。通過測定農(nóng)藥對蜜蜂的LC50或LD50，評價農(nóng)藥對蜜蜂的急性毒性。采用養(yǎng)殖最普遍的意大利成年工蜂作試驗蜂種。（1） 試驗材料試驗生物：意大利成年工蜂（Apis meLLifera L），要求供試蜜蜂健康、大小一致。試驗藥品：供試藥品用制劑或純品。攝入毒性試驗用藥以蒸餾水配制成母液供試驗用，易溶于水的物質(zhì)直接用蒸餾水配制，難溶于水或不溶于水的可用少量毒性小的有機(jī)溶劑助溶，并在試驗時設(shè)置溶劑對照組。觸殺毒性試驗用藥以丙酮配制成一定濃度的溶液供試驗用。主要儀器設(shè)備：試驗蜂籠、生化培養(yǎng)箱、微量注射器、燒杯等玻璃器皿。試驗條件：試驗在溫度25-30

34、C，相對濕度70-80%，微光條件下進(jìn)行。（2）試驗方法攝入毒性：將貯蜂籠內(nèi)的蜜蜂引入試驗籠中，每籠20只。不同濃度藥液與蜂蜜以2:1混勻，制成藥蜜，裝入10 mL小燒杯中，杯內(nèi)浸漬0.3g脫脂棉，杯口向下倒置于試驗籠紗網(wǎng)上，通過網(wǎng)眼供蜜蜂攝食。正式試驗前先做預(yù)試，可以較大的間距設(shè)置45個濃度組，求出受試蜜蜂最高全存活濃度與最低全致死濃度。正式試驗時在此濃度范圍內(nèi)按一定間距設(shè)置57個濃度組，每組20只蜜蜂，并設(shè)空白對照組，使用有機(jī)溶劑助溶的還需設(shè)置溶劑對照組。對照組及每一處理組均設(shè)3個平行。記錄處理24h、48h死亡數(shù)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計，求出LC50值及95%置信限。觸殺毒性：供試農(nóng)藥用

35、丙酮溶解，配制成不同濃度的藥液。將蜜蜂移入塑料網(wǎng)袋中，輕輕拉緊固定于點滴框上，蜜蜂被夾在兩層紗網(wǎng)中。通過網(wǎng)孔對準(zhǔn)蜜蜂前胸背板處，用微量注射器分別點滴規(guī)定濃度供試藥液1.01.5L，待蜂身晾干后轉(zhuǎn)入試驗籠中，用脫脂棉浸泡適量蜜和水飼喂。正式試驗前先做預(yù)試，可以較大的間距設(shè)置45個濃度組，求出受試蜜蜂的最高全存活濃度和最低全致死濃度。正式試驗時在此濃度范圍內(nèi)按一定間距設(shè)置57個濃度組，每籠20只蜜蜂。同時設(shè)立空白對照組及溶劑對照組，對照組及每一濃度組均設(shè)3個平行。觀察24和48 h受試蜜蜂有無中毒癥狀及死亡現(xiàn)象，記錄死亡數(shù)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計，計算LD50值及95%置信限。（3） 數(shù)據(jù)處理蜜蜂

36、攝入毒性的半數(shù)致死濃度LC50和觸殺毒性的半數(shù)致死劑量LD50的計算可采用寇氏法、直線內(nèi)插法或概率單位圖解法估算（具體計算方法參見2.2.1數(shù)據(jù)處理），也可應(yīng)用有關(guān)毒性數(shù)據(jù)計算軟件進(jìn)行分析和計算。（4）質(zhì)量控制 投喂藥品及飼養(yǎng)期間，農(nóng)藥含量不能低于規(guī)定含量的80%。 試驗結(jié)束時，對照組死亡率不超過10%。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)毒性測定結(jié)果將農(nóng)藥對蜜蜂的毒性分為四個等級（見表9）。表9 農(nóng)藥對蜜蜂的毒性等級劃分毒性等級觸殺法（g/蜂）攝入法（mg/L）劇毒LD500.001LC500.5高毒0.001LD502.00.5LC5020中毒2.0LD5011.020LC50200低毒LD5011.0LC

37、50200（6） 試驗報告 受試樣品名稱、來源、純度。 試驗生物的名稱、來源、大小及飼養(yǎng)情況。 試驗條件：試驗溫度、試驗方法等。 試驗液的濃度，24、48h-LC50或24、48h-LD50值和95%置信限，并給出所采用的計算方法。 對照組蜜蜂是否出現(xiàn)死亡及異常反應(yīng)。 觀察到的效應(yīng)，如受試蜜蜂的任何不正常的行為、中毒癥狀等。 試驗結(jié)果及毒性評價。2.2.3家蠶毒性試驗通過測定農(nóng)藥對家蠶的LC50，評價農(nóng)藥對家蠶的急性毒性，提供農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境影響的資料。家蠶品種較多，選擇有代表性的家蠶品種作試驗材料。（1）試驗材料試驗生物：選擇有代表性的家蠶品種，以二齡蠶為毒性試驗材料。試驗藥品：供試藥品用制劑

38、或純品。易溶于水的用蒸餾水配制成一定濃度供試驗用，難溶于水的可用少量毒性小的有機(jī)溶劑助溶，并在試驗時設(shè)置溶劑對照組。主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、直徑9 cm玻璃培養(yǎng)皿及燒杯等玻璃器皿。試驗條件：蟻蠶飼養(yǎng)溫度為251C，相對濕度為8085%。（2）試驗方法食下毒葉法：在直徑9 cm的玻璃皿內(nèi)飼養(yǎng)二齡起蠶，用不同濃度的藥液定量浸漬桑葉，以5 mL藥液浸漬5g桑葉，涼干供蠶食用。正式試驗前先做預(yù)試，可以較大的間距設(shè)置45個濃度組，求出受試家蠶最高全存活濃度和最低全致死濃度。正式試驗時，在此濃度范圍內(nèi)按一定間距設(shè)置57個濃度組，每組20頭蠶，并設(shè)空白對照，加溶劑助溶的還需設(shè)溶劑對照。對照組和每一濃度組均

39、設(shè)3個平行。整個試驗期間飼喂處理桑葉，觀察24 h、48 h、96 h、至三齡起，受試家蠶的中毒癥狀及死亡情況。試驗結(jié)束后對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計，計算半致死濃度LC50值及95%置信限。熏蒸法：在熏蒸箱內(nèi)進(jìn)行試驗，熏蒸箱由燃燒室和熏蒸室兩部分組成。試驗蠶置于熏蒸室內(nèi)，供試蚊香定量地在燃燒室內(nèi)燃燒（或電熱片加熱），燃燒煙氣通過循環(huán)泵送入熏蒸室內(nèi)。從熏蒸開始，按0.5、2、4、6、8 h觀察記錄熏蒸試驗裝置內(nèi)家蠶的毒性反應(yīng)癥狀，8h后，將熏蒸試驗裝置內(nèi)放置的培養(yǎng)皿取出，放置于家蠶常規(guī)飼養(yǎng)室作進(jìn)一步觀察，繼續(xù)觀察 24h及48h的家蠶死亡率。每個試驗箱內(nèi)設(shè)置九個重復(fù)，同時設(shè)置空白對照，設(shè)三個重復(fù)。試驗觀

40、察要求：觀察記錄項目主要包括攝食情況（減少或拒食）、不適癥狀（逃避、昂頭、晃頭、甩頭、扭曲掙扎、吐水等）及死亡率。（3）數(shù)據(jù)處理家蠶的半致死濃度LC50的計算可采用寇氏法、直線內(nèi)插法或概率單位圖解法估算（具體計算方法參見2.2.1數(shù)據(jù)處理），也可應(yīng)用有關(guān)毒性數(shù)據(jù)計算軟件進(jìn)行分析和計算。（4）質(zhì)量控制 空白對照組死亡率不超過10%。 試驗期間，應(yīng)保持試驗室條件正常，如出現(xiàn)各種原因的故障，須重做試驗。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥對家蠶的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)分為四級，并可根據(jù)田間施藥濃度/ LC50值，進(jìn)行風(fēng)險性分析（見表10）:表10 農(nóng)藥對家蠶的毒性與風(fēng)險性等級劃分毒性等級LC50（mg/kg桑葉）風(fēng)險性等級

41、田間施藥濃度/ LC50劇毒LC500.5極高風(fēng)險性10高毒0.5LC5020高風(fēng)險性1.010中毒20LC50200中等風(fēng)險性0.11.0低毒LC50200低風(fēng)險性0.1熏蒸試驗是針對衛(wèi)生用藥模擬室內(nèi)滅蚊條件下進(jìn)行的試驗，如果家蠶的死亡率大于10%以上時，即可視對家蠶有危害風(fēng)險性，應(yīng)在蠶室內(nèi)及附近禁止使用。（6）試驗報告 受試樣品名稱、來源、純度。 試驗生物的名稱、來源、大小及飼養(yǎng)情況。 試驗條件：試驗溫度、試驗方法等。 試驗液的濃度、24h、48h、96 h的LC50值和95%置信限，并給出所采用的計算方法。 對照組家蠶是否出現(xiàn)死亡及異常反應(yīng)。 觀察到的效應(yīng)，如受試家蠶的任何不正常的行為、

42、中毒癥狀等。 試驗結(jié)果及毒性評價。2.2.4魚類毒性試驗通過測定農(nóng)藥對魚類的LC50，評價農(nóng)藥對魚類的急性毒性，提供農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境影響的資料。魚類的急性毒性測定方法有靜態(tài)法、半靜態(tài)法與流動法三種。最常用的是半靜態(tài)法，即在試驗期間每隔12h或24h更換一次藥液，以保持試驗藥液的濃度不低于初始濃度的80。（1）試驗材料試驗生物：試驗魚種可選用斑馬魚（Brachydonio rerio）（體長30.5 cm，體重0.30.1 g）、鯉魚（Cyprinus carpio）的幼魚（體長34 cm）等作材料。 試驗用魚健壯無病，大小一致。試驗前在與試驗時相同的環(huán)境條件下馴養(yǎng)714 d，馴養(yǎng)期間每天喂食12

43、次，曝氣充氧，每日光照1216 h，及時清除糞便及食物殘渣。試驗前24 h停止喂食。稀釋水：試驗用稀釋水為經(jīng)活性碳處理并曝氣處理24h以上的自來水。水質(zhì)硬度在150300mg/L之間（以CaCO3計），pH值在68.5之間，溶解氧保持在5.8mg/L以上。試驗溶液的制備：易溶于水的農(nóng)藥用蒸餾水配制成母液；難溶于水的用超聲波粉碎法制備，也可加入低毒的有機(jī)溶劑或乳化劑（如丙酮或吐溫-80）助溶，用量小于0.1 mL/L，并在試驗時設(shè)置溶劑對照組。母液每日配制一次，比較穩(wěn)定的物質(zhì)二日配制一次，配好后低溫存放。試驗時用母液稀釋配制成不同濃度的試驗溶液。試驗條件：室溫保持在2025C，光照采用自然光照。

44、參比物質(zhì)：重鉻酸鉀（K2Cr2O7），分析純。主要儀器設(shè)備：溶解氧測定儀、溫度計、15L玻璃缸、量筒等玻璃器皿及尼龍紗網(wǎng)等。（2）試驗方法 預(yù)試驗預(yù)試驗按正式試驗的條件，以較大的間距設(shè)若干組濃度。每處理組放入10尾魚，觀察并記錄受試魚96h的死亡情況和中毒癥狀。通過預(yù)試求出受試魚最高全存活濃度及最低全致死濃度，為正式試驗確定濃度范圍。 正式試驗 在預(yù)試驗確定的濃度范圍內(nèi)以一定級差間距設(shè)置57個濃度組，并設(shè)一個稀釋水對照組，使用有機(jī)溶劑助溶的增設(shè)溶劑對照組，每個濃度組重復(fù)三次。每缸放入魚10尾，試驗開始后6h內(nèi)隨時觀察并記錄受試魚的中毒癥狀及死亡率，其后于24 h、48 h、72h、96h觀察并

45、記錄受試魚的中毒癥狀及死亡率，及時清除死魚。每天測定并記錄試液溫度、pH及溶解氧。 為檢驗本實驗室的設(shè)備、條件、方法及試驗魚的質(zhì)量是否合乎要求，設(shè)置“參比毒物”作方法學(xué)上的可靠性檢驗。在相同的試驗條件下，以重鉻酸鉀為參比毒物，斑馬魚作試驗材料，其24h-LC50必須處于200400 mg/L之間。對照組魚的死亡率不得超過10%，否則試驗無效，須換一批魚重做。（3）數(shù)據(jù)處理魚類96h-LC50的計算可采用寇氏法、直線內(nèi)插法或概率單位圖解法估算（具體計算方法參見2.2.1數(shù)據(jù)處理），也可應(yīng)用有關(guān)毒性數(shù)據(jù)計算軟件進(jìn)行分析和計算。（4）質(zhì)量控制 馴養(yǎng)期間死亡率不得超過5%；空白對照組死亡率不超過10%

46、。 以重鉻酸鉀為參比物質(zhì)，斑馬魚為試驗材料，24h-LC50必須處于200400 mg/L之間。 試驗期間，試驗溶液的溶解氧含量不低于5.8 mg/L。（5）評價標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥對魚類毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)分為四級（見表11）： 表11 農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)毒性等級96h-LC50 (mg/L)劇毒LC500.10.1LC501.01.0LC5010LC5010高毒中毒低毒（6）試驗報告 受試樣品名稱、來源、純度和理化性狀。 試驗魚名稱、來源、大小及馴養(yǎng)情況。 試驗條件：水溫、光照、溶解氧、pH值、水質(zhì)等。 試驗液濃度及試驗開始后24、48、72、96h的LC50值和95%置信限、中毒癥狀及所采用的

47、計算方法。 對照組魚的死亡率、行為反應(yīng)異常的比例。 試驗結(jié)果及毒性評價。2.2.5溞類毒性試驗溞類是重要的浮游動物，對毒物非常敏感，是評價化學(xué)物質(zhì)環(huán)境生態(tài)毒性的重要的指示生物。測定農(nóng)藥對溞類的EC50或LC50，來評價農(nóng)藥對溞類的急性毒性。水溞活動受抑制的判斷標(biāo)準(zhǔn)是緩慢搖動試驗容器，15s內(nèi)受試溞失去游動能力；水溞死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)是其心臟停止跳動。（1）試驗材料試驗生物：大型溞（Daphnia magna straus）或其它的繁殖參數(shù)與大型溞可比的溞類。保持良好的培養(yǎng)條件，使大型溞的繁殖處于孤雌生殖狀態(tài)。選用實驗室條件下培養(yǎng)3代以上、出生624 h的幼溞，幼溞必須健康、活潑。主要儀器設(shè)備：溶解氧測定儀、數(shù)字式酸度計、玻璃器皿等。試驗用稀釋水：自來水經(jīng)活性碳柱過濾，去除水中余氯及雜質(zhì)，再用充氣泵曝氣至少24 h后使用。稀釋水的理化參數(shù)為：pH 6.58.5，水質(zhì)硬度在