組織培養(yǎng)基本技術(shù)

1、 體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。 即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。 為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 v v .動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程（）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。傳代。白色念珠菌污染細(xì)菌污染支原體污染 干細(xì)胞（干細(xì)胞（stem cell）是具有自我更新、高是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些度增殖

2、和多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可通過分裂維持自身細(xì)胞的特性和大小，細(xì)胞可通過分裂維持自身細(xì)胞的特性和大小，又可進(jìn)一步分化為各種組織細(xì)胞，從而在組又可進(jìn)一步分化為各種組織細(xì)胞，從而在組織修復(fù)等方面發(fā)揮積極作用?？椥迯?fù)等方面發(fā)揮積極作用。概 念 干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測(cè)序之后最具活力、干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測(cè)序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命學(xué)科研究領(lǐng)域。最有影響和最有應(yīng)用前景的生命學(xué)科研究領(lǐng)域。 1999年干細(xì)胞研究被美國(guó)年干細(xì)胞研究被美國(guó)科學(xué)科學(xué)雜志評(píng)為雜志評(píng)為1999年度世年度世界十大科學(xué)之冠，界十大科學(xué)之冠，2000年干細(xì)胞研究再次被年干細(xì)胞研究再次被科

3、學(xué)科學(xué)雜志評(píng)雜志評(píng)為該年度世界十大科學(xué)成就之一。為該年度世界十大科學(xué)成就之一。 組織工程是以干細(xì)胞研究為基礎(chǔ)發(fā)展起來，它有望解決組織工程是以干細(xì)胞研究為基礎(chǔ)發(fā)展起來，它有望解決臨床上急需的人工組織與器官問題，進(jìn)展極為迅速，已經(jīng)成臨床上急需的人工組織與器官問題，進(jìn)展極為迅速，已經(jīng)成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。（一）概述（一）概述干細(xì)胞有幾個(gè)主要特征干細(xì)胞有幾個(gè)主要特征干細(xì)胞的分類干細(xì)胞的分類v全能干細(xì)胞全能干細(xì)胞v多能干細(xì)胞多能干細(xì)胞v單能干細(xì)胞單能干細(xì)胞按分化潛能按分化潛能按發(fā)育狀態(tài)按發(fā)育狀態(tài)胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞根據(jù)干細(xì)胞組織發(fā)生的名稱進(jìn)行分類根據(jù)干細(xì)胞

4、組織發(fā)生的名稱進(jìn)行分類胎胎干細(xì)胞胎胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞成骨干細(xì)胞成骨干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞v全能干細(xì)胞：全能干細(xì)胞：具有形成完整個(gè)體的分化具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞（潛能。如胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）。細(xì)胞）。v多能干細(xì)胞：多能干細(xì)胞：具有分化出多種細(xì)胞組織具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能。如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞。的潛能。如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞。v單能干細(xì)胞：?jiǎn)文芨杉?xì)胞：只能向一種或兩種密切相只能向一種或兩種密切相關(guān)的細(xì)胞類型分化。如上皮組織基底層關(guān)的細(xì)胞類型分化。如上皮組織基

5、底層的干細(xì)胞，肌肉中的成肌細(xì)胞。的干細(xì)胞，肌肉中的成肌細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞 ES細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞。它具有細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞。它具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。組織和器官，包括生殖細(xì)胞。 研究和利用研究和利用ES細(xì)胞是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域細(xì)胞是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的核心問題之一。的核心問題之一。 在未來幾年，在未來幾年，ES細(xì)胞移植和其它先進(jìn)生細(xì)胞移植和其它先進(jìn)生物技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用很可能在移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域物技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用很可能在移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)革命性進(jìn)步。引發(fā)革命性進(jìn)步。成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞 成年動(dòng)物的許多組織和器官，比

6、如表成年動(dòng)物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力。皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力。成體干細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵的作用。成體干細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵的作用。 在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，形新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持生長(zhǎng)和衰退的動(dòng)態(tài)平衡生長(zhǎng)和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。 1981年年Evans和和Kaufrnan及及Martin首次由小鼠中分離得首次由小鼠中分離得到鼠的胚胎干細(xì)胞。到鼠的胚胎干細(xì)胞。 至今已分離得到的胚胎干細(xì)胞物種有：至今已分

7、離得到的胚胎干細(xì)胞物種有：金黃地鼠（金黃地鼠（1988）、貂（）、貂（1993）、豬（）、豬（1994，1997）、雞）、雞（1996）、恒河猴（）、恒河猴（1995）、絨猴（）、絨猴（1996）。）。 分離得到人的胚胎干細(xì)胞（分離得到人的胚胎干細(xì)胞（1998），）， 分離得到人的胚胎生殖細(xì)胞（分離得到人的胚胎生殖細(xì)胞（1998），）， 目前不斷報(bào)道成年組織來源的的干細(xì)胞。目前不斷報(bào)道成年組織來源的的干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞研究簡(jiǎn)史胚胎干細(xì)胞研究簡(jiǎn)史人類生命形成的過程人類生命形成的過程ES細(xì)胞的特點(diǎn)：細(xì)胞的特點(diǎn)：ES細(xì)胞具有胚胎細(xì)胞的特性細(xì)胞具有胚胎細(xì)胞的特性，在，在形態(tài)上形態(tài)上表現(xiàn)為表現(xiàn)為體積小、

8、核大，核仁突出，培養(yǎng)時(shí)呈克隆狀生體積小、核大，核仁突出，培養(yǎng)時(shí)呈克隆狀生長(zhǎng)；在長(zhǎng)；在功能上功能上，ES細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，即細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，即具有分化為成年動(dòng)物體內(nèi)任何一種細(xì)胞類型的具有分化為成年動(dòng)物體內(nèi)任何一種細(xì)胞類型的能力。能力。ES細(xì)胞具有細(xì)胞系的特征細(xì)胞具有細(xì)胞系的特征，在飼養(yǎng)層上能維持，在飼養(yǎng)層上能維持未分化狀態(tài)并實(shí)現(xiàn)自我更新。因?yàn)榭蔁o限增殖，未分化狀態(tài)并實(shí)現(xiàn)自我更新。因?yàn)榭蔁o限增殖，也可冷凍保存。也可冷凍保存。二、胚胎干細(xì)胞研究的意義二、胚胎干細(xì)胞研究的意義ES細(xì)胞在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究細(xì)胞在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價(jià)值的工具；中極有價(jià)值的工具；ES細(xì)

9、胞是研究細(xì)胞是研究細(xì)胞分化細(xì)胞分化的理想手段；的理想手段；ES細(xì)胞是研究基因功能的首選細(xì)胞；細(xì)胞是研究基因功能的首選細(xì)胞；Es細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要途徑之一；細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要途徑之一；ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命；細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命；ES細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選。篩選。ES細(xì)胞GFPLacZ 遺傳標(biāo)記陽性ES細(xì)胞組織化學(xué)染色嵌合體胎兒追蹤觀察胚胎移植v胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本程序胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本程序v(一一)選擇抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系選擇抑制細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系v1、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系v2

10、、條件培養(yǎng)體系、條件培養(yǎng)體系v3、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系v胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本程序胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本程序v（二）早期胚胎的選擇（二）早期胚胎的選擇v（三）胚胎干細(xì)胞的分離（三）胚胎干細(xì)胞的分離v（四）胚胎干細(xì)胞的保持（四）胚胎干細(xì)胞的保持v（五）胚胎干細(xì)胞的鑒定（五）胚胎干細(xì)胞的鑒定v（六）胚胎干細(xì)胞的分化潛力驗(yàn)證（六）胚胎干細(xì)胞的分化潛力驗(yàn)證源于干細(xì)胞的細(xì)胞已能或可能治療源于干細(xì)胞的細(xì)胞已能或可能治療許多疾病許多疾病神經(jīng)細(xì)胞心肌細(xì)胞B型胰島細(xì)胞軟骨細(xì)胞白細(xì)胞皮膚細(xì)胞肝細(xì)胞骨細(xì)胞視細(xì)胞骨骼肌細(xì)胞帕金森病心肌梗死糖尿病骨關(guān)節(jié)炎白血病燒傷和創(chuàng)傷肝炎骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)膜退化肌營(yíng)養(yǎng)不良治療88成體干細(xì)胞中，造血干細(xì)胞（包括成體干細(xì)胞中，造血干細(xì)胞（包括骨髓、臍血和外周血中的干細(xì)胞）已骨髓、臍血和外周血中的干細(xì)胞）已用于治療重度白血病和某些遺傳性血用于治療重度白血病和某些遺傳性血液病。液病。 v體外培養(yǎng)主要包括那些類型？體外培養(yǎng)主要包括那些類型？v細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用到哪些領(lǐng)域？請(qǐng)舉例說細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用到哪些領(lǐng)域？請(qǐng)