方法驗證(131025)

1、分析測試中心 陳曉麗2013.10.25分析方法驗證分析方法驗證一、概述1、分析方法驗證的定義： 分析方法驗證是證明一個分析方法適合于特定產(chǎn)品的某種分析需要的過程。2、驗證的目的： 為了得到準確、精密、可靠的數(shù)據(jù)。分析方法驗證分析方法驗證3、分析方法驗證相關(guān)的常用指導原則 各國藥典附錄： 如USP1225方法驗證，中國藥典 2010 年版二部附錄 XIX A藥品質(zhì)量標準分析方法 驗證指導原則。 FDA：分析方法驗證指南 SFDA：化學藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù) 指導原則 ICH：Q2（R1）分析方法驗證4、適用范圍： 新建立的分析方法； 分析方法出現(xiàn)變更時； 采用藥典及其它法定標準未收載的分

2、析方法； 藥品生產(chǎn)工藝變更，可能引入新的雜質(zhì)時。5、不適用范圍： 對于僅需按照實驗室日常測試操作步驟即可測定的分析項目不需要進行驗證，如外觀、崩解時限、密度、重量、pH值、干燥失重、灰分、裝量等等。 二、分析方法驗證過程1、準備工作： 人： 有可以運用該分析方法，經(jīng)過培訓的人員。 儀器： 有符合要求的、經(jīng)過校準的、穩(wěn)定的儀器。 驗證方案： 有經(jīng)過批準的該待驗證分析方法的驗證方案，其中有明確的職責規(guī)定，對于每一個步驟都有詳細的描述，對于每一個驗證項目都有明確的可接受標準等等 樣品 有質(zhì)量合格的樣品，經(jīng)過準用的合適的各種對照 品。（包括工作對照品、各雜質(zhì)對照品）2、嚴格按照批準的驗證方案進行驗證工

3、作。如 出現(xiàn)異常或需進行適當調(diào)整時，應先經(jīng)過批準。3、驗證結(jié)束后： 對所得圖譜和數(shù)據(jù)進行分析評價； 得出驗證結(jié)論，出具驗證報告。 三、分析方法驗證的內(nèi)容 根據(jù)不同的分析方法的特性及用途確定不同的 驗證項目和內(nèi)容。 下表所列是通常情況下不同類型分析方法應該 進行驗證的項目： 1、專屬性 專屬性是指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔 料等）可能存在的情況下，采用的分析方法能 夠正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性。 一般方法都應該證明它的專屬性。如果一個方 法的專屬性不強，應該用其它方法進行補充。 證明專屬性的方式有3種：（1）在雜質(zhì)可以得到的情況下，向樣品中加入 一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與樣品能夠得到分 離

4、和檢出。（2）將樣品用強光照射，高溫，高濕，酸、堿 水解及氧化的方法進行破壞，比較破壞前后 檢出的雜質(zhì)個數(shù)和量。 （3）在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可 以通過與另一種已證明合理但分離或檢測原 理不同、或具較強分辨能力的方法進行結(jié)果 比較來確定。2、系統(tǒng)精密度 系統(tǒng)精密度是指同一個樣品溶液在連續(xù)進樣的 情況下獲得的結(jié)果之間的接近程度。 目的：證明在該分析方法的運用上當天儀器的 性能。（這也常是系統(tǒng)適應性的要求之一） 一般情況下，本項驗證采用的樣品溶液會是 100%的雜質(zhì)加標樣品溶液。 采用連續(xù)進樣6針后得到的各雜質(zhì)及樣品的峰 面積的RSD作為評價標準。3、方法精密度 方法精密度是指在同樣的

5、操作條件下，在較短 的時間間隔內(nèi)，對同一批樣品，由同一分析人員稱取數(shù)份樣品，平行測定所得結(jié)果之間的接近程度。 證明方法精密度的方式有兩種： （1）制備6份100濃度的試樣，用各自測得的結(jié)果進行評價； （2）制備3個不同濃度的試樣，用各測定3次的 結(jié)果進行評價 。 我們常用的是第1種方式。 對測得的各份結(jié)果用RSD來評價。雜質(zhì)一般可 接受標準為10.0%，含量一般可接受標準為 2.0%（基本上和系統(tǒng)適應性中要求一致）4、中間精密度 中間精密度是指在同一實驗室，由于實驗室內(nèi) 部條件改變時測定結(jié)果的接近程度。 驗證設計方案中的變動因素一般為日期、分析 人員、設備。 中間精密度的驗證方式及評價標準和方

6、法精密 度完全相同。 方法精密度和中間精密度的結(jié)果之間也要有一 個評價標準： （1）各自測得結(jié)果之間的絕對差值應符合要求，比如:含量差值1.0%，雜質(zhì)差值0.05%，殘留溶劑差值（濃度的25%）等。 （2）所有結(jié)果的RSD應符合要求（與方法精密度的要求基本一致）。5、檢測限和定量限 檢測限是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準確定量。檢測限是為了考察分析方法是否具備靈敏的檢測能力。 定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應具有一定的準確度和精密度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。 當用 GC 和 HPLC 法時 ，一般以信噪比為3： 1時的

7、相應濃度作為檢測限，以信噪比為10：1 時的相應濃度作為定量限。 其它方法：也可以用工作曲線的斜率和響應的 標準偏差進行計算的方法得到檢測限和定量限。 6、線性和范圍 線性是指在設計的測定范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與樣 品中被分析物的濃度（量）直接呈線性關(guān)系的 程度。 范圍是指能達到一定精密度、準確度和線性， 測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。 線性是定量測定的基礎，涉及定量測定的項 目，如雜質(zhì)定量試驗和含量測定均需驗證線性。 驗證方式：可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別 精密稱樣，制備一系列被測物質(zhì)濃度系列進行 測定，至少制備5個濃度。以測得的響應信號 （如峰面積、吸光值等）作為被測物濃度的函數(shù) 作圖，

8、觀察是否呈線性，計算線性回歸方程。 線性驗證范圍： 含量：80120% 雜質(zhì)：LOQ 150% 評價標準：相關(guān)系數(shù)R。 如HPLC、GC色譜法： 含量線性，R0.999 雜質(zhì)線性，R0.9957、準確度 準確度是指用該分析方法測得的結(jié)果與真實值 或認可的參考值之間接近的程度。 用于定量測定的分析方法均需做準確度驗證。 證明方式： 制備3個不同濃度的樣品溶液，各測定3次，即 測定9次。 （ 也可以3個濃度，每個濃度配制3份樣品） 一般用已知加入量的被分析物的回收率 ( ) 作為評價標準 。 含量的回收率要求：98102%； 雜質(zhì)的回收率要求：80120%； 各份樣品測得回收率的RSD10.0%

9、準確度和精密度的作用不同。8、耐用性 耐用性是指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié) 果不受影響的承受程度。 耐用性主要考察方法本身對于可變試驗因素的 抗干擾能力，為使方法用于常規(guī)檢測提供依據(jù)。 經(jīng)耐用性試驗證明，如果測試條件要求苛刻， 則應在方法中寫明。 典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性等。液相色譜法：流動相的組成比例或 pH 值，不 同廠牌或不同批號的同類型色譜柱，柱溫，流 速及檢測波長等。氣相色譜法：不同廠牌或批號的色譜柱、柱溫， 進樣口和檢測器溫度等。薄層色譜法：不同廠牌的薄層板，薄層展開時 溫度及相對濕度的變化等 溶液穩(wěn)定性 （1）用來證明根據(jù)相應方法制備的樣品溶液和標準品溶液在規(guī)定的儲

10、存條件下在一定時間內(nèi)保持穩(wěn)定。 （2）驗證方式： 在規(guī)定條件下儲存適當?shù)臅r間間隔后檢測。 含量測定：用新鮮配制的標準品溶液測定樣品溶液的含量，各時間點測得的RSD應符合要求。 雜質(zhì)測定：不同時間點測得的峰面積與0時相比較，偏差不得大于5%。（根據(jù)雜質(zhì)大小設定） 以上是一般定量的分析方法在驗證過程中都需 要的驗證項目。 如果是HPLC、GC方法，則都還應該有系統(tǒng)適 應性要求。 當在兩個不同實驗室之間已經(jīng)驗證了方法的重 現(xiàn)性時，可以不驗證中間精密度。一、概述1、分析方法確認的目的： 證明該分析方法在本實驗室條件下的適用性。2、分析方法確認的范圍： （1）藥典方法； （2)其他法定方法。分析方法確認

11、分析方法確認3、不適用范圍 實驗室日常測試操作步驟不需要進行方法確認，如干燥失重、熾灼殘渣、pH值等等。4、需確認的因素： 人； 設備； 試劑； 其它因素。5、確認方式: 分析方法確認沒有固定的方案，需要根據(jù)不同的方法來確定需要確認的內(nèi)容。 如雜質(zhì)的定量測定方法： 國外：專屬性、方法精密度、中間精密度、定量 限、檢測限、溶液穩(wěn)定性。 國內(nèi)：方式1，由兩名實驗人員分別對同一批 產(chǎn)品進行檢測，比較兩人的檢測結(jié)果。 方式2，確認專屬性、精密度、定量限。 強降解試驗是指將原料藥置于比較強烈的試驗條件 下，考察其穩(wěn)定性的一系列試驗。 一般包括酸降解、堿降解、氧化、高溫、高濕、光照 六個條件。 在國外，這

12、六個條件都稱為強降解試驗。 在國內(nèi)，前三個條件稱為強降解試驗，后三個則稱為影 響因素試驗。強降解試驗 強降解試驗的目的： （1）通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩(wěn) 定性，了解該藥品內(nèi)在的穩(wěn)定特性及其降解途 徑與降解產(chǎn)物。為初步確定貯存條件提供依 據(jù)。 （2）對有關(guān)物質(zhì)分析方法用于檢查降解產(chǎn)物 的專屬性進行驗證。 國內(nèi)外相關(guān)的指導原則，均未對破壞性試驗的 具體項目與試驗條件作明確的規(guī)定。 具體的降解條件： 酸降解： 一般選擇0.1N的鹽酸 。酸液的濃度、降解的時 間均可根據(jù)具體品種，在前期預試驗的基礎上 靈活確定。 堿降解： 一般選擇0.1N的氫氧化鈉溶液 。堿液的濃度、 降解的時間均可根據(jù)具體

13、品種，在前期預試驗 的基礎上靈活確定。 氧化降解： 一般采用市售的雙氧水 。雙氧水的濃度、降解 的時間均可根據(jù)具體品種，在前期預試驗的基 礎上靈活確定。 高溫降解： 根據(jù)ICH規(guī)定，結(jié)合中國藥典附錄要求，我們 一般確定高溫條件為：60，放置10天。 高濕降解： 一般采用25 ，RH905%的條件。放置10 天。 一般用飽和硝酸鉀溶液制備濕度條件 （ RH92.5% ）。 高濕降解研究時，需要考察樣品的吸濕增重， 以確定樣品是否具有引濕性，這對于樣品包裝 的選擇非常重要。當吸濕增重5%時，樣品具 有一定的吸濕性，需要繼續(xù)研究。 光照降解： 國內(nèi)注冊要求：4500LX500LX條件下放置 10天。 國外注冊要求：放置過程的總照度不得少于 120萬LX。 為了同時符合國內(nèi)外注冊的要求，實際操作中將光線照度定為4500LX500LX，放置時間延長到15天。 取樣時間點： 酸降解、堿降解、氧化降解根據(jù)預試驗確定的 時間取樣檢測。 高溫、高濕、光照降解分別于第5、10天取樣 檢測。（光照降解增加第15天的