PCR技術(shù)及應(yīng)用

1、分子生物學(xué)與臨床 http:/ PCR技術(shù)誕生所依賴的社會(huì)需求和研究需要20kB fragments插入噬菌體載體細(xì)菌擴(kuò)增從基因組文庫(kù)中篩選目的基因從基因組文庫(kù)中篩選目的基因probe引物引物1977年引物引物引物引物1983年XX()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 復(fù)溫 3 PCR管加熱使模板變性, 退火使引物與模板DNA互補(bǔ),延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一

2、般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。 30次 12341234A：無(wú)外顯子8,12,17,19對(duì)應(yīng)條帶,說(shuō)明病人外顯子819缺失B：病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強(qiáng)度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失 PCR的局限：需了解靶基因片段兩測(cè)的序列 對(duì)于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？對(duì)于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？（固定化PCR）錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對(duì)的3錨定引物（帶有

3、限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作 A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCR擴(kuò)增熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記 I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission Taqman探針3端Q熒光分子能夠吸收5端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測(cè)不到5端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測(cè)到3端熒光分子的熒光信號(hào),但當(dāng)溶液中有PCR 產(chǎn)物(模板) 時(shí),探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq

4、酶的5外切酶活性,將探針5端連接的R熒光分子從探針上切割下來(lái),破壞了兩個(gè)熒光分子間的FRET ,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數(shù)與PCR 產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此,根據(jù)PCR 反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer , FRET)Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（熒光共振能量傳遞（FRET Probe）RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標(biāo)記探針（雙

5、標(biāo)記探針（Taqman Probe）RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)分子信標(biāo)（Molecular Beacon Probe）引物特異性探針（引物特異性探針（Amplisenor Probe）535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（引物特異性探針（Amplifluor Probe）全新全新4通道實(shí)時(shí)熒光定量通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀儀 普通梯度普通梯度PCR儀儀+55A正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)APCR-ASO檢測(cè)基因點(diǎn)突變:主是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段,然后用人工