實驗十二離子交換柱層析法分離蛋白質(zhì)

1、實驗十二 離子交換柱層析法分離蛋白質(zhì)實驗原理1離子交換與洗脫所謂離子交換， 是指溶液中的某一種離子與另一種靠靜電力結(jié)合在惰性載體上的離子進(jìn) 行可逆交換的過程， 即溶液中的離子結(jié)合到載體上而載體上的離子被替換下來。 若惰性載體 上以共價鍵結(jié)合著帶正電荷的活性基團(tuán)， 則可交換陰離子， 叫陰離子交換劑； 若以共價鍵結(jié) 合著帶負(fù)電荷的活性基團(tuán)，則可交換陽離子，叫陽離子交換劑。在一定的條件下，混合物中 不同蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)及電荷多少不同， 有的能與特定離子交換劑結(jié)合， 有的不能結(jié)合； 能與離子交換劑結(jié)合的蛋白質(zhì)中， 結(jié)合力的大小也不一定相同， 所以，采用適當(dāng)?shù)南疵摋l件， 可以對它們進(jìn)行有效的分離。離

2、子交換過程可以表示如下：+ 一 一 + 一 一- RY +x t一 R X +Y（陰離子交換） + + + +- R Y +x t一 R X +Y （陽離子交換）上式中， 代表惰性載體； R 代表惰性載體上的活性基團(tuán)； Y 代表平衡離子 （可替換離子 ）； x 代表蛋白質(zhì)分子。樣品進(jìn)入離子交換柱之前，共價結(jié)合于惰性載體上的活性基團(tuán)大部分處于溶劑化狀態(tài)， 并吸附著平衡緩沖液中帶相反電荷的離子。 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入離子交換柱后， 由于分子表面一 些基團(tuán)的電荷性質(zhì)與交換劑上活性基團(tuán)的電荷性質(zhì)相反， 因而會通過靜電引力結(jié)合于交換劑 上，并把其原來吸附的平衡離子取代下來。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)， 它與離子交換劑

3、的結(jié)合力取決于分子表面能夠與離子交換劑形成 靜電鍵的數(shù)目， 而后者首先與分子所攜帶的電荷的數(shù)目有關(guān)， 其次與蛋白質(zhì)分子的大小及電 荷排列也有一定關(guān)系， 因為它們與蛋白質(zhì)分子是否易于在離子交換劑上的適當(dāng)部位形成靜電 鍵有關(guān)。 總的來說， 蛋白質(zhì)分子與交換劑之間存在三種不同的結(jié)合狀態(tài)： 蛋白質(zhì)分子與交 換劑之間的靜電鍵數(shù)目很多， 以致它們同時解離的機率等于零。 洗脫時， 這部分蛋白質(zhì)由于 結(jié)合緊密而停留在柱頂端。 蛋白質(zhì)分子與交換劑之間的靜電鍵數(shù)目相對較少， 它們同時解 離的機率達(dá)到某一有限值 （01之間）。洗脫時，某一種蛋白質(zhì)分子的靜電鍵在某一時間里同 時解離， 隨洗脫液向下移動。 蛋白質(zhì)分子與

4、交換劑之間的靜電鍵數(shù)目極少， 完全不與交換 劑結(jié)合。 處于這種狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子隨洗脫液的前峰移動， 呈現(xiàn)一個高而窄的 “穿過峰 不（ 交換峰 ”。）如果混合物中有幾種蛋白質(zhì)同時處于這種狀態(tài)，那么它們會同時被洗脫下來，達(dá) 不到分離目的。 采用陽離子交換劑時， 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子不能結(jié)合而呈 “穿過峰 ”洗脫下 來。蛋白質(zhì)分子在離子交換劑上的結(jié)合狀態(tài)是隨著環(huán)境條件的變化而改變的。洗脫就是通過改變緩沖液離子強度或和 pH 來改變蛋白質(zhì)與交換劑的結(jié)合狀態(tài)， 降低其與交換劑的結(jié)合 力， 使交換上去的不同蛋白質(zhì)分子以不同速度洗脫下來， 達(dá)到分離純化的目的。 增加緩沖液 的離子強度時， 由于洗脫液中高離子

5、強度競爭性離子的存在， 與交換劑結(jié)合的蛋白質(zhì)分子被 取代下來進(jìn)入洗脫液中。 洗脫液中離子種類不同時， 取代能力不一樣。 改變緩沖液的 pH 時， 蛋白質(zhì)分子的解離度降低， 電荷減少， 從而減弱其與交換劑的結(jié)合力。 應(yīng)用陰離子交換劑時 要降低pH;應(yīng)用陽離子交換劑時要升高 pH。有時，同時改變兩個方面的條件，有利于分離 復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。 在恒定的洗脫條件下， 往往難以將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合樣品有效地分離。 通常采用不斷改變洗脫條件的方法，即用梯度洗脫的方法來分離蛋白質(zhì)混合樣品。雖然離子交換層析法分離蛋白質(zhì)時，主要通過離子交換的作用，但實際上也可能存在 一些疏水吸附和分子篩作用。2離子交換劑人工合

6、成的離子交換劑由高分子的不溶性基質(zhì)和許多與其共價結(jié)合的帶電荷的活性基 團(tuán)組成。由于活性基團(tuán)的電離性質(zhì)不同，而有強酸性、強堿性、弱酸性和弱堿性之分。不溶 性基質(zhì)主要有樹脂、纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和硅膠等。離子交換樹脂一般只適合分離小分子物質(zhì)如氨基酸等，不適合分離蛋白質(zhì)等大分子物 質(zhì)，一方面是因為大分子不易進(jìn)入樹脂緊密交聯(lián)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部， 另一方面是因為交聯(lián)聚苯乙烯 骨架疏水性很強，用于蛋白質(zhì)分離時，會出現(xiàn)疏水性的不可逆吸附。此外，離子交換樹脂的 機械強度較差，而且樹脂的體積常隨著溶劑離子強度的變化發(fā)生溶脹和收縮。離子交換纖維素的種類很多， 可分為陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素兩大類。

7、 由 于這些材料是纖維狀的， 大部分活性基團(tuán)分布在表面， 所以， 適合于分離蛋白質(zhì)等生物大分 子。二乙基氨乙基纖維素 （DEAE 一纖維素 ）和羧甲基纖維素 （CM 一纖維素 ）分別是應(yīng)用得最 廣泛的陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素。 另外， 根據(jù)纖維素顆粒的物理結(jié)構(gòu)不同， 可 分為“纖維型，和“微晶型”兩大類。 微晶型”因顆粒細(xì)、比重大，能制成緊密的柱，交換容 量大，分辨率高。離子交換葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠具有許多優(yōu)點： 不會引起被分離物質(zhì)的變性或失 活；非特異性吸附很低；交換容量大（為離子交換纖維素的 34倍）；容易制成微球型，因此裝柱和層析時的流速都較易控制。它的缺點是隨著洗脫液的

8、離子強度和pH 的變化，床體積變化大，明顯影響流速；另外，由于它的凝膠性質(zhì)，有時會把大分子物質(zhì)排阻在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 之外。目前，用于蛋白質(zhì)和多肽離子交換 HPLC 的多為以硅膠為載體的離子交換劑。以硅膠 為載體的離子交換劑的主要優(yōu)點是有很好的機械強度，能耐受較高的層析柱壓， 可適應(yīng)廣泛種類的流動相， 在含有變性劑、 有機溶劑和高離子強度的洗脫液中均能使用， 不會發(fā)生明顯 的溶脹與收縮，而且可以制成各種孔徑51 000 nm 的剛性填料。根據(jù)硅膠載體上鍵合的活性基團(tuán)的不同，可分為強酸性、強堿性、弱酸性和弱堿性的離子交換劑。通常用于蛋白質(zhì)與 多肽分離的強酸性陽離子交換劑聯(lián)有磺酸基（一 S03H） ；強堿

9、性陰離子交換劑聯(lián)有季胺堿基一 CH2N+（CH3）3;弱酸性陽離子交換劑聯(lián)有羧甲基（一 CH2 C00 ，CM）;弱堿性陰離子交換劑聯(lián)有二乙基氨乙基 一 CH2CH2N（CH 2CH2）2， DEAE 。強酸性和強堿性離子交換劑 的優(yōu)點是流動相較大范圍內(nèi)的 pH 不會改變載體活性基團(tuán)的帶電性質(zhì)，因而在酸性、中性和 堿性的流動相中均能使用。弱酸性 （CM 型）的離子交換劑宜在 pH40 的環(huán)境中使用，弱堿 性（DEAE型）的離子交換劑宜在 pH9 . 6的環(huán)境中使用。弱酸性和弱堿性離子交換劑由于對 H+和0H 一有較大的親和力，為洗脫和再生帶來了方便，對于一些吸附性能較強的蛋白質(zhì)與 多肽樣品采用

10、弱堿性和弱酸性的交換劑， 可以在較溫和的條件下， 即較低的鹽濃度和較小的 pH 改變的情況下把樣品洗脫下來。這對于某些蛋白質(zhì)的活性保持通常是很有意義的。以硅 膠為載體的離子交換劑可有不同顆?？讖焦┻x擇， 大孔徑的填料為相對分子質(zhì)量 Mr 大的蛋 白質(zhì)提供更多可交換的基團(tuán)， 使每克交換劑的交換容量增大。 一般蛋白質(zhì)樣品應(yīng)選擇孔徑為 30 nm的交換劑，對于相對分子質(zhì)量Mr150000以上的蛋白質(zhì)，應(yīng)當(dāng)選擇孔徑100nm的交換劑。3離子交換柱層析條件的選擇 對于分離一個特定的蛋白質(zhì)， 選擇什么樣的柱子、 離子交換劑和流動相等需根據(jù)具體情 況統(tǒng)籌考慮， 主要是根據(jù)待分離蛋白質(zhì)本身的理化性質(zhì)和生物學(xué)性

11、質(zhì)確定。因此， 在采用離子交換層析法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離之前，應(yīng)當(dāng)對待分離的蛋白質(zhì)的性質(zhì)有所了解，如等電點、 相對分子質(zhì)量、疏水性、生物活性及測定方法、溶解性、濃度、發(fā)生聚合的可能性、穩(wěn)定性 以及微觀不均一性等。 由于多數(shù)情況下離子交換柱層析采用梯度洗脫， 因而柱子都不需很長。 了解樣品的等電點決定選用陽離子還是陰離子交換劑以及流動相的pH ;樣品的相對分子質(zhì)量 Mr 將決定選用多大孔徑的柱填料； 疏水性強的樣品則要求選用疏水吸附較小或親水性載體的交換劑， 以防止非特異性疏水吸附； 活性測定方法可用來鑒定分離到的樣品及測定回收 率；樣品的溶解性在選用流動相的種類時是必須考慮的， 并依此決定是否要在

12、流動相中添加 促溶劑；根據(jù)樣品的穩(wěn)定性決定層析溫度、流動相 pH 以及是否要在流動相中添加穩(wěn)定劑； 樣品的濃度和含量是選擇柱體積大小和每次進(jìn)樣量的依據(jù)；對于那些存在微觀不均一的樣 品，由于它們在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上極其相似，所以在分離時要采用分辨率盡可能高的條件(如等梯度洗脫 )；對某些樣品還要選用適當(dāng)?shù)臉悠窛舛取H 和鹽濃度以防止其發(fā)生聚合。(1) 離子交換劑的選擇在等電點已知的前提下，若所用緩沖液的 pH 高于等電點， 則用陰離子交換劑；反之，若所用緩沖液的 pH 低于等電點，則用陽離子交換劑；若先確定了所用 離子交換劑的類型，那么，就必須對緩沖液的 pH 作相應(yīng)的調(diào)整。但在實際應(yīng)用中，為了避

13、免樣品處于過酸或過堿的環(huán)境，對于酸性蛋白質(zhì)和多肽樣品(pI8) ，通常是使其帶有正電荷而采用陽 離子交換劑。 等電點未知時， 可參照電泳分析的結(jié)果。 在中性和偏堿性條件下電泳時向陽極 移動較快的物質(zhì)， 同樣條件下可被陰離子交換劑吸附； 向陰極移動或向陽極移動較慢的物質(zhì)， 同樣條件下可被陽離子交換劑吸附。 但有時有例外， 因為某一物質(zhì)的層析行為， 除與分子的 凈電荷有關(guān)外， 還與它的分子大小、 分子結(jié)構(gòu)和電荷排列等有關(guān)。 對于等電點未知的蛋白質(zhì)， 還可用陰離子交換劑和陽離子交換劑分別在較高pH(如pH 8 . 6)和較低pH(如pH 5 . 5)條件下進(jìn)行離子交換實驗， 觀察交換吸附的情況。 如

14、果待分離的物質(zhì)能被兩種交換劑吸附， 則兩 種離子交換劑都可用于分離，而且待分離物質(zhì)與其他成分分離的機會更多。如果都不吸附， 則盡量降低樣品和起始緩沖液的鹽濃度， 直至幾乎為零。 若發(fā)現(xiàn)被吸附的物質(zhì)由于吸附太牢 而不易洗脫，則應(yīng)選用交換當(dāng)量較小或具有弱解離活性基團(tuán)的離子交換劑。(2) 緩沖液的選擇緩沖液離子應(yīng)不影響被分離物質(zhì)的活性并不干擾其測定，不影響樣品 的溶解度和穩(wěn)定性。如洗脫液要用 280 nm 波長檢測時，緩沖液內(nèi)就不能有芳香族化合物； 如要用215225 nm波長檢測肽鍵的含量，則不能用含羧基的緩沖液。采用陽離子交換劑時， 應(yīng)選用陰離子型緩沖液，如磷酸、醋酸緩沖液等。采用陰離子交換劑時

15、，應(yīng)選用陽離子型緩 沖液，如 Tris 、吡啶緩沖液等。緩沖液 pH 的確定首先取決于被分離物質(zhì)的等電點， 采用陽離子交換劑時應(yīng)低于物質(zhì)的 等電點，采用陰離子交換劑時應(yīng)高于物質(zhì)的等電點。同時要結(jié)合考慮被分離物質(zhì)的溶解度、 穩(wěn)定性和離子交換劑的活性基團(tuán)的PK。用陰離子交換劑時 pH應(yīng)低于其pK,用陽離子交換劑時pH應(yīng)高于其pK,且應(yīng)使緩沖液pH介于樣品等電點和 pK之間。為了降低鹽離子的競爭，起始緩沖液的濃度要盡可能的低(如 001 molL 左右)。這就需要選用其pK接近所需pH的緩沖離子，以使緩沖液具有較強的緩沖能力，避免緩沖離 子與離子交換劑作用而引起 pH 的改變。當(dāng)確信樣品易被吸附后，

16、可適當(dāng)提高起始緩沖液的 濃度以保證一定的緩沖能力。實驗材料與設(shè)備1用品與儀器 玻璃層析柱 (20 mL) ，梯度混合器，核酸蛋白檢測儀，記錄儀，部分收集器，接收試管、天 平，酸度計等。2試劑( 1 )蛋白質(zhì)樣品液：雞卵清蛋白，pI=4 6；核糖核酸酶， pI=7 8；細(xì)胞色素 c， pI=106；胰島素， pI=53。洗脫液 A : 0. 05 mol/L Tris H緩沖液，pH : 7. 5;洗脫液 B: 0. 05 mol /L Tris HCl 緩沖液，pH=7.5，含有 1.0mol/LNaCI.(3) DEAE 一纖維素 :0. 5 molL HCl; 0. 5 molL NaOH

17、 ;雙蒸水。實驗操作程序1離子交換劑的預(yù)處理稱取1. 8 g DEAE 纖維素（DE52 , Whatman公司生產(chǎn)，6.3 mL /g）置于小砂芯漏斗中. 先在20mL 0.5 mol / LNaOH中浸泡30 min，然后用雙蒸水洗至 pH=8。再用20 mL0.5 mol /L HCl 浸泡 30 min，然后水洗至 pH=4 . 0。最后用 20 mL 0 . 5 mol / L NaOH 浸泡 30 min 后水洗至 pH=8.O 。2 裝柱將玻璃層析柱洗凈后垂直安裝于支架上，裝入約 10 mL 洗脫液 A ，打開下嘴閥讓緩沖 液慢慢滴出，同時，將懸浮于適量洗脫液 A 中的處理好的

18、DEAE 一纖維素一邊攪動一邊倒 入層析柱中， 讓其自然沉降到全部加入為止。 裝柱時交換劑的懸浮液最好一次倒人， 若分次 倒入，則須在再次添加之前將界面處的交換劑攪起，以保證柱床不分節(jié)。柱面要平整，柱中 無氣泡。待液面離纖維素沉降面約 l cm 后，關(guān)閉下嘴閥。3 平衡連接梯度混合器，用起始緩沖液 （洗脫液A）以1. 0 mL /min的流速平衡柱子，直到流 出液 pH 與起始緩沖液的完全相同為止。4 上樣揭開層析柱上蓋。 打開下嘴閥， 待液面降至纖維素柱面時又關(guān)閉之。 用滴管小心將 05 mL 樣品均勻地加到纖維素柱面上，打開下嘴閥，待樣品液面降至與柱面平齊時又關(guān)閉之。用同樣的方法加入 05 mL 起始緩沖液，讓其