[農(nóng)業(yè)]常見疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1、常見疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法常見疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法 目錄常見疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法1目錄1常見elisa操作方法2亞洲 1 型口蹄疫抗體液相阻斷 elisa 檢測(cè)試劑盒2豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒5口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)方法（ 3abc-i-elisa）11犬細(xì)小病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書13犬瘟熱病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書15常見pcr操作方法17豬偽狂犬病毒pcr診斷試劑劑盒17豬圓環(huán)病毒pcr診斷試劑盒20常見rt-pcr操作方法23口蹄疫病毒分子檢測(cè)診斷試劑盒23h5亞型禽流感病毒rt-pcr檢測(cè)試劑盒說明書(20次)25新城疫病毒rt-pcr 檢測(cè)試劑盒27豬瘟病毒rt-pcr診斷試劑盒30凝集、血凝

2、實(shí)驗(yàn)操作方法33弓形蟲間接血凝試驗(yàn)(lha)試劑使用說明書33偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)試劑盒34豬細(xì)小病毒病乳膠凝集試驗(yàn)lat診斷試劑盒使用說明書35豬傳染性萎縮性鼻炎乳膠凝集試驗(yàn)lat操作程序36豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)試劑使用說明書及實(shí)驗(yàn)操作程序37高致病性禽流感血凝（ha）和血凝抑制（hi）試驗(yàn)程序40瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)42雞馬立克氏病42禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)44熒光抗體檢測(cè)46豬瘟熒光抗體試驗(yàn)操作程序46對(duì)狂犬病疑似動(dòng)物腦組織的直接免疫熒光(dfa)檢測(cè)47血清學(xué)診斷檢測(cè)常用試劑配方49禽流感ha和hi試驗(yàn)用溶液的配制49補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)52豬流感病毒h1亞型hl試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清說明書52豬流感

3、病毒rt-pcr檢測(cè)55豬瘟病毒rt-pcr診斷試劑盒豬繁殖與呼吸綜合癥（nsp2 15941680變異株）rt-pcr檢測(cè)實(shí)驗(yàn)57布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清60常見elisa操作方法亞洲 1 型口蹄疫抗體液相阻斷 elisa 檢測(cè)試劑盒一 試劑盒內(nèi)含物.說明書 亞洲 1 型口蹄疫陽(yáng)性對(duì)照血清( 己稀釋濃度為 1:8).96 孔 elisa 板 亞洲 1 型口蹄疫陰性對(duì)照血清.液體稀釋槽 3% 雙氧水.u 型96孔抗原抗體反應(yīng)板 25pbst洗滌液(稀釋時(shí)準(zhǔn)確量取).封板膜 豚鼠抗血清稀釋液.滅活亞洲型口蹄疾病毒抗原 (用冰決包裹 ) 終止液.亞洲型口蹄疫病毒兔抗血清 包被緩沖液

4、(碳酸鹽)膠囊.亞洲型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物 (檸檬酸 -磷酸鹽)緩沖液片劑.兔抗豚鼠血清igg-辣根過氧化物酶結(jié)合物 opd 片劑二 器材準(zhǔn)備 ( 需用戶自備 )1.移液器:5-50l移液器、0.210l移液器、50200l移液器、50300l 12道移液器各一把。2.移液槍尖 (若干)。3.抗原抗體反應(yīng)板:微量血凝板(u型、v型均可)5塊,本試劑盒配備兩塊,用于被檢血清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注:抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用,實(shí)驗(yàn)后,用水沖洗干凈,然后用無(wú)離子水沸水浴30秒,晾干,待用。4.超純水 , 無(wú)離子水或蒸餾水。三、試劑準(zhǔn)備(需用戶完成)1.包被緩沖液(ph9.6)將本試劑盒配備的碳

5、酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開,將膠囊內(nèi)粉末倒入100ml無(wú)離子水中溶解即可。4存放,1月內(nèi)有效。2. 洗滌液(pbst)將本試劑盒配備的 25 倍濃縮 pbst 液(可能有結(jié)晶形成,用時(shí)微熱溶化)用無(wú)離子水或蒸餾水做1:25稀釋。(如果ph降低,務(wù)必用naoh調(diào)至7.4)3.底物溶液取1片檸檬酸磷酸鹽片劑(本試劑盒配備)溶于100ml無(wú)離子水中,溶化后,取50ml溶液, 再加1片鄰苯二胺(opd)片劑,充分溶解,分裝（5ml/ 瓶或 10ml瓶 ), 避光之-2o保存。 用前避光溶化 ,臨時(shí)每1ml上述溶液加 10l 本試劑盒配備的 3% 的雙氧水(h202) 。務(wù)必加雙氧水!四、操作步驟 1.

6、用包被緩沖液稀釋亞洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度(1:1000), 在 elisa 板上每孔加 50l, 振蕩 , 封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。2. 抗原抗體(陰陽(yáng)性對(duì)照血清及待檢血清)反應(yīng)根據(jù)不同的需要,選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應(yīng)板上操作。圖 1 96 孔酶標(biāo)板檢測(cè) 10 份樣品布局圖s1 1:8s2s3s4s5s6s7s8s9s10+1:32-1:41:161：641:81:321：1281:641：2561:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l0241:4096圖 1 為抗體滴度測(cè)定 (定量) 檢測(cè) 10 份樣品布局圖;圖 2 為抗體滴度測(cè)

7、定( 定量 )檢測(cè) 20 份樣品布局圖。圖 2 96 孔酶標(biāo)板檢測(cè) 20 份樣品布局圖s11:32s2s3s4s5s6s7s8s9s10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256s111:32s12s13s14s15s16s17s18s19s201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以圖 1 為例 , 在 u 型血凝板上按 50 l/孔量用 pbst 將待檢 血清從1:4開始做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時(shí),按圖示稀釋陰陽(yáng)性對(duì)照血清 , 然后每孔加入 50 l 用 pbst 稀釋到使用濃度的亞洲型口蹄疫病毒抗原 (1:

8、4,即1份病毒抗原、加3份pbst), 病毒抗原對(duì)照孔加100l。振蕩混勻,封板,4過夜。加入病毒抗原后血清的稀釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋。3.用洗滌液 (1pbst) 洗 elisa板5 次,在洗水紙上甩干,再將抗原抗體混合物從抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至elisa板上的相對(duì)應(yīng)孔,每孔50l封板,37溫育1小時(shí)。4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度 (1:1000), 每孔加50l,封板,37溫育1小時(shí)。5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 lpbst 稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度 (1:500), 每孔加 50 l 封板 ,37 溫育

9、1 小時(shí)。6. 同上洗板5次,每孔加50l底物溶液 (務(wù)必加雙氧水),37溫育15分鐘。每孔再加50l終止液終止反應(yīng),立即在492nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值(od492nm值)。五 結(jié)果判定1. 試驗(yàn)認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)每塊板設(shè) 4 孔病毒抗原對(duì)照,病毒抗原對(duì)照不加任何血清,直接用pbst稀釋至使用濃度,與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入elisa板孔,50l/孔,病毒抗原對(duì)照od492nm 值應(yīng)在1.50.5范圍內(nèi)。 陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在1:10241滴度以內(nèi),陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)應(yīng)1:8。2.病毒抗原對(duì)照平均od492nm 值50%計(jì)算(臨界值)抗原對(duì)照是4孔,棄去最高和最低od492nm值,計(jì)算剩余2孔的平

10、均od492nm值,再除以2,即50%對(duì)照值。該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對(duì)照od492nm值。3.結(jié)果判定以病毒抗原對(duì)照平均od492nm 值的50%為臨界值,被檢血清稀釋孔o(hù)d492nm值大于臨界值的孔為陰性孔,小于或等于臨界值的孔為陽(yáng)性孔,陽(yáng)性孔的od492nm值等于臨界值時(shí)所對(duì)應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對(duì)照平均od492nm值為1.2,則其50%為0.60。若某一待檢血清在1:128時(shí)od492nm值為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為 1:128 。若臨界值處于兩個(gè)滴度之間 ,如處于1：64與1：128之間，則抗體滴度取中間值為1:9o。定性檢測(cè)中 , 兩個(gè)

11、重復(fù)孔只要有 一孔為陽(yáng)性孔 , 則抗體滴度判 定為 1:128, 兩孔均為陽(yáng)性孔 , 則判定 為抗體滴度1:128 。elisa抗體效價(jià)1:128,判定為亞洲 1 型口蹄疫抗體陽(yáng)性。 elisa抗體效價(jià)與保護(hù)力的關(guān)系:牛、羊:抗體效價(jià)1:128,99% 保護(hù)；效價(jià)1:16, 不保護(hù)；效價(jià)在1:22-90之間,50%保護(hù)。豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒classical swine fever virus antigen test kit(csfvag)概 述豬瘟病毒(csfv)、牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)、邊界病病毒(bdv)都是瘟病毒科黃病毒屬的成員。豬瘟病毒自從成為一種重要的病原體以來(lái)，給養(yǎng)豬業(yè)造成

12、了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并引起豬的嚴(yán)重死亡。感染高致病力豬瘟病毒后，豬在出現(xiàn)臨床癥狀前會(huì)排出大量的病毒。耐過急性或亞急性感染的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生抗體并且不再散毒。低致病力溫和病毒會(huì)造成豬的隱性感染，病豬將會(huì)持續(xù)或間歇排出病毒直至死亡。懷孕母豬與豬瘟病毒接觸后可能通過胎盤感染胎兒。先天性感染可能導(dǎo)致流產(chǎn)，木乃伊胎兒，死產(chǎn)和/或弱仔及畸形胎兒。先天性感染低毒力病毒的結(jié)果是產(chǎn)出持續(xù)性感染的仔豬，仔豬出現(xiàn)免疫耐受，不表現(xiàn)任何癥狀向外排毒。豬也有可能感染bvdv或bdv。盡管這些感染通常呈溫和經(jīng)過并且是自限性的，但將它們同豬瘟病毒有效區(qū)分是很重要的。原 理本elisa檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)外周血白細(xì)胞、全血、細(xì)胞培養(yǎng)物

13、以及組織樣本中的豬瘟病毒抗原。采用雙抗體夾心elisa，將csfv單克隆抗血清包被微量反應(yīng)板，可與樣品中的csev抗原結(jié)合。豬瘟病毒的特異性單克隆抗體形成了夾心的上層。形成的單克隆抗體+樣品+單克隆抗體夾心可以用辣根過氧化物酶標(biāo)記物檢測(cè)。加入與辣根過氧化物酶反應(yīng)的底物，在酶的作用下形成有色產(chǎn)物。通過酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度?？梢杂?50nm單波長(zhǎng)或450nm與620m雙波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度。試 劑本試劑盒采用96孔板，可以一次檢測(cè)92個(gè)樣品(每個(gè)樣品1孔，每個(gè)對(duì)照2孔)或46個(gè)樣品(每個(gè)樣品2孔，每個(gè)對(duì)照2孔)；或分6次使用，每次用2個(gè)板條，設(shè)2個(gè)對(duì)照，測(cè)定6個(gè)樣品(每個(gè)樣品2孔)。為了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確

14、性，最好每個(gè)樣本都設(shè)重復(fù)。試 劑 數(shù) 量1、多克隆羊抗血清包被板條 8孔12條(96孔)2、10倍濃縮樣品稀釋液(10x) 55ml足以配制550ml直接使用的1x稀釋液3、10倍濃縮洗滌液(10x) 125ml足以配制1、25l直接使用的洗滌液工作濃度(1x)4、csfv單克隆抗體，含防腐劑 4ml5、陽(yáng)性對(duì)照，含有防腐劑 1.5ml6、陰性對(duì)照，含有防腐劑 1.5ml7、100倍濃縮辣根過氧化物酶標(biāo)記物(100x)，辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠igg，含有防腐劑 200l8、酶標(biāo)抗體稀釋液 15ml9、底物液，tmb/h2o2溶液 12ml10、終止液，1m hci(小心，強(qiáng)酸) 12ml注意事

15、項(xiàng)1、仔細(xì)閱讀并遵守操作說明；2、試劑盒試劑于27冷藏保存。建議將濃縮的洗滌液(10x)保存在1825室溫，以免形成結(jié)晶。3、所有試劑在使用前必須恢復(fù)至室溫。4、未使用的包被板應(yīng)該密封保存在配備的塑料袋中，于27冷藏保存。5、不要將不同批次的說明書以及試劑盒成分混合使用。6、注意防止真菌或細(xì)菌污染試劑盒成分。處理試劑時(shí)要小心。7、不要用超過保質(zhì)期的檢測(cè)試劑盒。8、進(jìn)行樣品或試劑操作時(shí)嚴(yán)禁吃東西、喝水或吸煙。9、每個(gè)樣品都用單獨(dú)的吸頭。10、每一批次的試劑必須用其配備的陰陽(yáng)對(duì)照。11、配制試劑時(shí)只能用超純水。12、不要用嘴吸取液體。13、底物溶液和濃縮的樣本稀釋液對(duì)眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚有剌激性，

16、避免與皮膚和眼睛接觸。14、終止液為1mhcl，hci為強(qiáng)酸并且能造成灼傷，小心處理。15、本試劑盒只能用于體外診斷。獸醫(yī)專用。試劑配制1、包被的反應(yīng)板、豬瘟病毒特異性單克隆抗體、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、底物溶液、終止液為現(xiàn)用試劑。2、洗滌液10倍濃縮洗滌液必須用超純水或雙蒸水進(jìn)行10倍(1：10)稀釋，稀釋的洗滌液于27冷藏保存，但不能超過3天；或冰凍保存，至少可以保存一年。例如：配制500ml稀釋的洗滌液，將450ml超純水或雙蒸水加到50ml濃縮液中，混勻。注意：如果濃縮液有結(jié)晶，在使用前必須溶解?？蓪⑵孔臃旁跍厮?0分鐘以上。3、樣品稀釋液10倍濃縮樣品稀釋液必須用超純水或雙蒸水進(jìn)行10

17、倍(110)稀釋，但如果檢測(cè)全血樣品時(shí)，將適量的10倍濃縮液與等體積的超純水混合，制成5倍濃縮液(5x)即可。將制備的稀釋液于27冷藏保存，但不能超過3天；或者冰凍保存，可以保存一年以上。4、辣根過氧化物酶標(biāo)記物(100x)100倍(100x)濃縮標(biāo)記物在使用前必須用標(biāo)記物稀釋液進(jìn)行1100倍稀釋。如果只使用部分試劑，只要用稀釋液按100倍(1100)稀釋足夠本次使用的標(biāo)記物濃縮液(旋渦振蕩混勾)即可。稀釋后的標(biāo)記物溶液只能保存24小時(shí)。例如：10ml的辣根過氧化物酶標(biāo)記物工作液，只需取100l濃縮標(biāo)記物(100x)加到10ml標(biāo)記物稀釋液中，在旋渦振蕩器上混勻即可。自備器材1、精密移液器，5

18、1至100012、一次性移液吸頭。3、雙蒸水或超純水。4、洗瓶或自動(dòng)洗板機(jī)。5、濕盒或封板膠帶。6、離心機(jī)，2000xg。7、酶標(biāo)儀。8、離心管和小試管。9、微量離心機(jī)，10，000xg。10、旋渦振蕩器。11、剪刀和攝子。12、0.17mnh4ci溶液，制備白細(xì)胞用。樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在27保存7天，或-20冷凍保存6個(gè)月以上。但這些樣品在應(yīng)用前應(yīng)該再次以1，500xg離心10分鐘或10，000xg離心25分鐘。外周血白細(xì)胞a) 取10ml肝素或edta抗凝血樣品，1，500xg離心1520分鐘。b) 用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入500l樣品稀釋液(1x)，在旋渦振蕩器

19、上混勻，室溫下放置1小時(shí)，其間不時(shí)用旋渦器混合。然后直接進(jìn)行步驟f操作；c) 假如樣品的棕黃層壓積細(xì)胞體積非常少，那么就用整個(gè)細(xì)胞團(tuán)(包括紅細(xì)胞)。將細(xì)胞加進(jìn)10ml的離心管，并加入5ml預(yù)冷(27，下同)的0.17mnh4ci(氯化銨)混勻，靜置10分鐘。d) 用冷(27)超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1，500xg離心5分鐘。e) 棄去上清，向細(xì)胞團(tuán)中加入500l樣品稀釋液(1x)，用潔凈的吸頭懸起細(xì)胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)用旋渦器混合。f) 1，500xg離心5分鐘，取上清液按操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。g) 注意：處理好的樣品可以在27冷藏保存7天，或-20

20、冷凍保存6個(gè)月，但在使用前必須再次離心。外周血自細(xì)胞(簡(jiǎn)化方法)a) 取0.52ml肝素或edta抗凝血與等體積冷(2-8)0.17m nh4ci加入離心管混合。室溫放置10分鐘。b) 1，500xg離心10分鐘(或10，000xg離心23分鐘)，棄掉上清。c) 用冷(27)超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1，500xg離心5分鐘。d) 棄去上清，向細(xì)胞團(tuán)中加入500l樣本稀釋液(1x)。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)用旋渦器混合。取75l按照操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。全血(肝素或edta抗凝)a) 取25l 10倍濃縮樣品稀釋液(10x)和475l全血加入微量離心管，在旋渦振

21、蕩器上混勻。b) 室溫下溫育1小時(shí)，期間不時(shí)用旋渦器混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)?；颍褐苯訉?5l全血加入酶標(biāo)板孔中，再加入10l 5倍濃縮樣品稀釋液(5x)?；蝿?dòng)酶標(biāo)板/板條，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)物a) 移去細(xì)胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞加入到離心管中。b) 2，500xg離心5分鐘，棄去上清。c) 向細(xì)胞團(tuán)中加入500l樣品稀釋液(1x)。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)用旋渦器混合。取此樣品75l按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于28冷藏保存1個(gè)月。每只動(dòng)物檢測(cè)12種組織，最好選取扁桃體

22、、脾、腸、腸系膜淋巴結(jié)或肺。a)取12g組織用剪刀剪成小碎塊(25mm大小)。b) 將組織碎塊加入10ml離心管，加入5ml樣品稀釋液(1x)，旋渦振蕩混勻，室溫下放置12小時(shí)，期間不時(shí)用旋渦器混合。c) 1，500xg離心10分鐘，取75l上清液按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。操作步驟注意：所有試劑在使用前應(yīng)該恢復(fù)至室溫1825；使用前試劑應(yīng)在室溫條件下至少放置1小時(shí)。1、每孔加入25lcsfv特異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器(812道)操作。2、在相應(yīng)孔中分別加入75l陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，各加2孔。注意更換吸頭。3、在其余孔中分別加入75l制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標(biāo)板，使樣

23、品混合均勻。4、置濕盒中或用膠條密封后室溫(1825)溫育過夜。也可以放置室溫溫育4個(gè)小時(shí)，但是這可降低檢測(cè)靈敏度。5、甩掉孔中液體，用洗滌液(1x)洗滌5次，每次洗滌都要將孔注滿。將孔中的所有液體倒空，用力拍打酶標(biāo)板，以使所有液體拍出?；蛘撸靠准尤胂礈煲?50300l用自動(dòng)洗板機(jī)洗滌5次。注意：洗滌酶標(biāo)板要仔細(xì)細(xì)心。6、每孔加入100l稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記物，在濕盒或密封后置室溫溫育1小時(shí)。7、重復(fù)操作步驟5；每孔加入100l底物液，在暗處室溫溫育10分鐘。第1孔加入底物液開始計(jì)時(shí)。8、每孔加入100l終止液終止反應(yīng)。加入終止液的順序與上述加入底物的順序一致。9、在酶標(biāo)儀上測(cè)量樣品與

24、對(duì)照孔在450m處的吸光值，或測(cè)量在450nm和620nm雙波長(zhǎng)的吸光值(空氣調(diào)零)。10、計(jì)算每個(gè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照孔的矯正吸光值的平均值(參見“計(jì)算方法”)。計(jì)算方法首先計(jì)算樣品和對(duì)照孔的od平均值，在判定結(jié)果之前，所有樣品和陽(yáng)性對(duì)照孔的od平均值必須進(jìn)行矯正，矯正的od值等于樣本或陽(yáng)性對(duì)照值減去陰性對(duì)照值。矯正od=樣本od陰性對(duì)照od注意：北京愛德士元亨生物科技有限公司奮進(jìn)行平均值相un值計(jì)算并提供數(shù)據(jù)匯總的儀器和軟件系統(tǒng)(xchek)試驗(yàn)有效性判定陽(yáng)性對(duì)照od平均值應(yīng)該大于0.500，陰性對(duì)照od平均值應(yīng)小于0.150，試驗(yàn)結(jié)果方能有效。否則，應(yīng)仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)操作并進(jìn)行重測(cè)。如果陰性對(duì)照的

25、吸收值始終很高，將陰性對(duì)照液在微量離心機(jī)中10，000xg離心35分鐘，重新檢測(cè)。結(jié)果判定被檢樣品的矯正吸光值大于或等于0.30，則為陽(yáng)性：被檢樣品的矯正吸光值小于0.20，則為陰性；被檢樣品的矯正吸光值大于0.20，小于0.30，則為可疑。建議根據(jù)外周血白細(xì)胞處理方案或細(xì)胞培養(yǎng)物處理方案進(jìn)行全血樣品的處理和檢測(cè)?？谔阋呓Y(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)方法（ 3abc-i-elisa）簡(jiǎn)介口蹄疫(fmd)是一種高度接觸性傳染病，傳播迅速，可形成世界性大流行，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和國(guó)際畜產(chǎn)品貿(mào)易具有嚴(yán)重的負(fù)面影響。控制和消滅fmd策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。在采用疫苗的國(guó)家，大多數(shù)動(dòng)物血清口蹄疫病毒(fmdv)結(jié)構(gòu)蛋白和病

26、毒感染相關(guān)抗原(viaa，即3d)抗體均為陽(yáng)性，因此，一些基于結(jié)構(gòu)蛋白和viaa的診斷方法很難確定口問疫病毒感染與否。只有將感染動(dòng)物和隱性帶毒動(dòng)物與疫苗免疫動(dòng)物加以區(qū)分才能為fmd的控制和消滅提供科學(xué)的依據(jù)。日前的疫苗生產(chǎn)工藝，在病毒純化過程中去除絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，因此滅活疫苗免疫動(dòng)物體內(nèi)沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3abc抗體產(chǎn)生，而自然感染動(dòng)物體內(nèi)既有結(jié)構(gòu)蛋白抗體，也有非結(jié)構(gòu)蛋向3abc抗體。因此檢測(cè)fmdv非結(jié)構(gòu)蛋白3abc抗體的elisa方法不但可以檢測(cè)隱性感染動(dòng)物，而且可以區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物?？谔阋卟《痉墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)試劑盒(fmd3abc-i-ellsa)對(duì)感染牛的檢出率很高，敏感性

27、在99%以上。對(duì)免疫牛的特異性在96%以上。用途fmd3abc-i-elisa試劑盒檢測(cè)fmdv非結(jié)構(gòu)蛋白3abc抗體。該試劑盒不受血清型影響，適用于活畜進(jìn)出口調(diào)運(yùn)、疫區(qū)凈化檢疫和群體無(wú)癥狀感染評(píng)價(jià)，區(qū)分感染和免疫動(dòng)物。原理fmd3abc-i-elisa試劑盒采用間接elisa模式。用3abc基因表達(dá)蛋白（ag）包被elisa板，洗板封閉。檢測(cè)時(shí)，加入待檢血清樣品，如果血清樣品中有3abc抗體，與elisa板上3abc蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入底物后，就會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)。如果待檢樣品為陰性，就不能形成抗原-抗體復(fù)合物，酶標(biāo)二抗不會(huì)結(jié)合，因此就不顯色。注意事項(xiàng)1冰凍血清

28、樣品應(yīng)充分融化，且應(yīng)混和均勻。2血清稀釋液和底物應(yīng)平衡至室溫應(yīng)用。底物a在4為結(jié)晶狀態(tài)，需要在室溫或37水浴化開后應(yīng)用。3最好在血清稀釋板上稀釋血清，以減小操作誤差。4應(yīng)使用相同的加樣器加樣，以保證加樣量的準(zhǔn)確，減小試驗(yàn)誤差。5多道微量移液器所用的吸頭應(yīng)為同一規(guī)格和型號(hào)，避免加樣誤差。6應(yīng)使用自動(dòng)或手動(dòng)連續(xù)洗板系統(tǒng)洗板。7加樣先后次序應(yīng)該一致，保證作用時(shí)間一樣。8底物作用時(shí)間到后，如果顏色較淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)作用時(shí)間。9本試劑盒只能檢測(cè)一種動(dòng)物的血清樣本，應(yīng)分別訂購(gòu)檢測(cè)牛、豬或羊血清的試劑盒，以測(cè)定不同動(dòng)物來(lái)源的血清。試劑準(zhǔn)備l.洗滌液(pbst)將試劑盒配備的25倍濃縮pbst用無(wú)離子水或蒸餾水

29、做l:25倍稀釋即可。操作步驟1. 待檢血清樣品和陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清用血清稀釋液1:2l倍稀釋(120l血清稀釋液加血清6l)，每孔加入lool，陰、陽(yáng)性對(duì)照血清平行加兩孔，用封口膜封口，37結(jié)合30分鐘。2. 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。3. 用血清稀釋液按l:loo比例稀釋酶標(biāo)二抗，每孔加入100l，用封口膜封口，37結(jié)合30分鐘。4. 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。5. 將底物a按1:50比例(體積比)稀釋于底物b中(lml底物b中加入2ol底物a)，吹打混勻，每孔加入lool，封口膜封口，37避光作用1015分鐘。6. 每孔加入.100l終

30、止液。7. 輕輕搖振混勻，測(cè)定波長(zhǎng)450nm吸光值(od450nm值)。8. 陽(yáng)性對(duì)照平均od值應(yīng)大于0.6；陰性對(duì)照平均od值應(yīng)小于0.2。9. 結(jié)果計(jì)算:樣品效價(jià)為:(od樣品-od陰性)(od陽(yáng)性-od陰性)。結(jié)果判定若效價(jià)0.3為陽(yáng)性?？梢珊完?yáng)性樣品應(yīng)進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)為可疑或者陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)判為陽(yáng)性。犬細(xì)小病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書原理：本試劑盒采用間接elisa方法檢測(cè)犬血清中犬細(xì)小病毒igg抗體。在聚苯乙烯微孔酶標(biāo)板上,包被純化的犬細(xì)小病毒抗原。待檢血清中的cpv抗體與包被抗原特異結(jié)合,再與hrp標(biāo)記的兔抗犬igg 抗體結(jié)合,形成抗原抗體酶標(biāo)抗體復(fù)合物,加tmb底物作用顯色,在酶標(biāo)儀上

31、測(cè)定od值判定結(jié)果。試劑盒的組成(96頭份):1. cpv抗原反應(yīng)板 12*8孔2. 20倍濃縮洗液 30ml*1瓶3、樣品稀釋液 15mi*1瓶4、cpv陰性對(duì)照 300l*1支5、cpv陽(yáng)性對(duì)照 300l*1支6、50倍cpv酶結(jié)合物液 300l*l支7、酶結(jié)合物稀釋液 15ml*1瓶8、底物液a 8ml*1瓶9.底物液b 8ml*1瓶10、終止液 8ml*1瓶11、封板膜 2張12、自封袋 1個(gè)13、說明書 1張?jiān)噭?zhǔn)備:1.將20倍濃縮洗液用蒸餾水稀釋20倍后備用(30ml濃縮洗液+570ml蒸餾水)。2.將50倍cpv酶結(jié)合物液用酶結(jié)合物稀釋液稀釋50倍后備用(300u1 50倍cp

32、v酶結(jié)合物液+15m1酶結(jié)合物稀釋液),輕振混勻,當(dāng)日用完。操作步驟:1.待檢血清在板孔外用稀釋后的洗滌液作l:16倍預(yù)稀釋(150ul洗滌液+10ul待檢血清)備用。陰、陽(yáng)性對(duì)照不稀釋。2.記下稀釋樣品的對(duì)應(yīng)編號(hào),每次試驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、各2孔。3.試劑盒平衡至室溫,在反應(yīng)板各孔中加入100ul樣品稀釋液。再分別在相應(yīng)孔中加入經(jīng)預(yù)稀釋的待檢血清1oul,然后在對(duì)照孔中分別加入10ul陰、陽(yáng)性對(duì)照。充分混勻后,貼上封板膜,置37溫育20分鐘。4.小心揭掉封板膜,棄去各孔中液體、拍干。每孔加滿洗滌液,靜置約30秒,如此重復(fù)洗滌5次,最后一遍拍干。5.每孔加入經(jīng)過稀釋的酶結(jié)合物液100ul,

33、貼上封板膜,置37溫育20分鐘。6.操作同步驟5。7.每孔加入底物液a 50ul,再加入底物液b 50ul,輕拍混勻,置37避光顯色10分鐘。8.每孔加入終止液50ul,輕輕振蕩,置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定od值。要求:1.陽(yáng)性對(duì)照od值有效范圍:0.60。2.陰性對(duì)照od值有效范圍:0.10(陰性對(duì)照若有一孔大于0.10應(yīng)舍棄,如果兩孔o(hù)d值都大于0.10,應(yīng)重復(fù)試驗(yàn))。結(jié)果判定:1.臨界值(cut off值)的計(jì)算:cut off值=(陽(yáng)性對(duì)照od平均值一陰性對(duì)照od平均值)0.1+陰性對(duì)照od平均值2.待檢樣本od值臨界值(cut off值)即判為cpv抗體具有保護(hù)效價(jià):小于臨界值(c

34、ut off值)即判為cpv抗體未達(dá)到保護(hù)效價(jià)。注意事項(xiàng):1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)置室溫平衡后再打開密封袋,未用完的微孔反應(yīng)板條用自封袋加干燥劑保存。2.各步加液均應(yīng)使用加液器并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液,防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。4.封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。5.結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),且終止反應(yīng)后應(yīng)在10分鐘以內(nèi)測(cè)定其od值。6.所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。7.不同批次試劑不能混用。8.請(qǐng)嚴(yán)格按說明書操作。犬瘟熱病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書原理本試劑盒采用間接elisa方法檢測(cè)犬血清中犬瘟熱病毒igg抗體。

35、在聚苯乙烯微孔酶標(biāo)板上,包被純化的犬瘟熱病毒抗原。待檢血清中的cdv抗體與包被抗原特異結(jié)合,再與hrp標(biāo)記的兔抗犬igg抗體結(jié)合,形成抗原抗體酶標(biāo)抗體復(fù)合物,加tmb底物作用顯色,在酶標(biāo)儀上測(cè)定od值判定結(jié)果。試劑盒的組成(96頭份):1、cdv抗原反應(yīng)板 12*8孔2、20倍濃縮洗液 30ml*1瓶3、樣品稀釋液 15mi*1瓶4、cdv陰性對(duì)照 300l*1支5、cdvf陽(yáng)性對(duì)照 300l*1支6、50倍cdv酶結(jié)合物液 300l*l支7、酶結(jié)合物稀釋液 15ml*1瓶8、底物液a 8ml*1瓶9.底物液b 8ml*1瓶10、終止液 8ml*1瓶11、封板膜 2張12、自封袋 1個(gè)13、說

36、明書 1張?jiān)噭?zhǔn)備:1.將20倍濃縮洗液用蒸餾水稀釋20倍后備用(30ml濃縮洗液+570ml蒸餾水)。2.將50倍cdv酶結(jié)合物液用酶結(jié)合物稀釋液稀釋50倍后備用(300u1 50倍cdv酶結(jié)合物液+15m1酶結(jié)合物稀釋液),輕振混勻,當(dāng)日用完。操作步驟:1.待檢血清在板孔外用稀釋后的洗滌液作l:16倍預(yù)稀釋(150ul洗滌液+10ul待檢血清)備用。陰、陽(yáng)性對(duì)照不稀釋。2.記下稀釋樣品的對(duì)應(yīng)編號(hào),每次試驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、各2孔。3.試劑盒平衡至室溫,在反應(yīng)板各孔中加入100ul樣品稀釋液。再分別在相應(yīng)孔中加入經(jīng)預(yù)稀釋的待檢血清1oul,然后在對(duì)照孔中分別加入10ul陰、陽(yáng)性對(duì)照。充分

37、混勻后,貼上封板膜,置37溫育20分鐘。4.小心揭掉封板膜,棄去各孔中液體、拍干。每孔加滿洗滌液,靜置約30秒,如此重復(fù)洗滌5次,最后一遍拍干。5.每孔加入經(jīng)過稀釋的酶結(jié)合物液100ul,貼上封板膜,置37溫育20分鐘。6.操作同步驟5。7.每孔加入底物液a 50ul,再加入底物液b 50ul,輕拍混勻,置37避光顯色10分鐘。8.每孔加入終止液50ul,輕輕振蕩,置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定od值。要求:1.陽(yáng)性對(duì)照od值有效范圍:0.60。2.陰性對(duì)照od值有效范圍:0.10(陰性對(duì)照若有一孔大于0.10應(yīng)舍棄,如果兩孔o(hù)d值都大于0.10,應(yīng)重復(fù)試驗(yàn))。結(jié)果判定:1.臨界值(cut of

38、f值)的計(jì)算:cut off值=(陽(yáng)性對(duì)照od平均值一陰性對(duì)照od平均值)0.1+陰性對(duì)照od平均值2.待檢樣本od值臨界值(cut off值)即判為cdv抗體具有保護(hù)效價(jià):小于臨界值(cut off值)即判為cdv抗體未達(dá)到保護(hù)效價(jià)。注意事項(xiàng):1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)置室溫平衡后再打開密封袋,未用完的微孔反應(yīng)板條用自封袋加干燥劑保存。2.各步加液均應(yīng)使用加液器并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液,防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。4.封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。5.結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),且終止反應(yīng)后應(yīng)在10分鐘以內(nèi)測(cè)定其od值。6.所有樣品、

39、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。7.不同批次試劑不能混用。8.請(qǐng)嚴(yán)格按說明書操作。保存28儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月常見pcr操作方法豬偽狂犬病毒pcr診斷試劑劑盒用途豬偽狂犬病毒(prv)聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)試驗(yàn)用于檢測(cè)豬血清和組織中的prv,適用于prv的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理提取病料dna作為模板,高溫使模板的一條雙鏈dna變性后形成兩條單鏈,低溫使引物與互補(bǔ)的模板形成雙鏈,中溫時(shí),在taqdna聚合酶作用下,以dntp為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),沿模板合成一條新鏈。每個(gè)循環(huán)包括:高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)過程。每一次循環(huán)使擴(kuò)增的dna片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35次循環(huán),使擴(kuò)

40、增的dna片段放大了數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到dna片段的擴(kuò)增帶。試劑1.試劑組成名稱數(shù)量陽(yáng)性對(duì)照350la：消化液12mlb：蛋白酶k110lc：酚/氯仿/異戊醇混合液7mld：異丙醇6mle：75%乙醇12mlf：滅菌去離子水650lj：rt-pcr反應(yīng)液200lk：taqdna聚合酶25ll:礦物油300lm:50倍tae電泳緩沖液(50倍稀釋后使用)20mln：溴化乙錠溶液100lo：上樣緩沖液50l2.試劑貯藏條件:陽(yáng)性對(duì)照、b、e、j、k液(塑料袋內(nèi))于一20保存,其它試劑4保存。器材試劑盒內(nèi)配有0.2ml薄壁pcr管15個(gè)。其它需要

41、自備的物品1.儀器:分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、pcr擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、液氮或-70冰箱、微波爐、組織研磨器、-20冰箱、可調(diào)移液器。2.耗材:眼科剪、眼科鑷、稱量紙、2oml一次性注射器、1.5ml滅菌離心管、瓊脂糖、500ml量筒、500ml錐形瓶、吸頭、滅菌雙蒸水。使用注意事項(xiàng)1.所有接觸prv病料的物品均應(yīng)合理處理,以免prv污染實(shí)驗(yàn)室。2.pcr整個(gè)試驗(yàn)分pcr反應(yīng)液配制區(qū)配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)模板提取區(qū)擴(kuò)增區(qū)電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。3所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存,使用時(shí)拿到室溫下,使用后立即

42、放回。4n液具有致癌性,小心操作。使用a液之前將其室溫溶解為澄清透明。5.注意防止試劑盒組分受污染使用前將紅蓋管5000rpm離心15s,使液體全部沉于管底。6.不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的成分不要混用。7.嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。8.本試劑盒為10頭份csfvrtpcr診斷試劑盒,應(yīng)在3次以內(nèi)用完。樣品制備1樣品采集:病死或撲殺的動(dòng)物取有明顯病變臟器的病變部與健康部交界處組織:待檢活動(dòng)物,用注射器取血5ml,4保存,送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2樣品處理:每份樣品分別處理。2.l組織樣品處理:稱取待檢病料0.lg置組織研磨器中剪碎并研磨,加入

43、1mla液繼續(xù)研磨。取己研磨好的待檢病料上清100ul加入1.5ml滅菌離心管中,再加入500ula液和10ulb液,混勻后,置55水浴中過夜。2.2全血樣品處理:待血凝后取血清放于離心管中,8000rpm離心5min,取血清100ul,加入500ula液和loul b液,混勻后,置55水浴中過夜。2.3陽(yáng)性對(duì)照處理:混勻后取100ul,加入500ul a液和loul b液,混勻后,置55水浴中過夜。2.4陰性對(duì)照處理:取f液100ul,加入500ul a液和10ul b液,混勻后,置55水浴中過夜。操作步驟l.病毒模板dna的提取1.1從水浴鍋中取出己處理的樣品,加60oul c液(用c液之

44、前不要晃動(dòng),不要吸到c液上層保護(hù)液),用力顛倒10次混勻,1200orpm離心lomin。1.2取500ul上清置于滅菌離心管中,加入500ul d液,混勻,置液氮中3min或-70冰箱中3omin。取出樣品管,室溫融化,1300orpm離心15min。1.3棄上清,沿管壁緩緩滴入lml e液,輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉,將離心管倒扣于吸水紙上lmin,再將離心管50烘干或真空抽干15min(以無(wú)乙醇味為準(zhǔn))。1.4取出樣品管,用30ul f液溶解沉淀,作為模板備用。2pcr擴(kuò)增每份總體積20ul,取16ulj 液(用前混勻),2ul k液,2ul模板dna(見1.4)。混勻,作好標(biāo)記,加入l液20u

45、l覆蓋。擴(kuò)增條件為943min后,9530s,6530s,7230s循環(huán)35次,72延伸7min。結(jié)果1電泳稱4g瓊脂糖放于500ml錐形瓶中,加入50倍稀釋的m液200ml(取4ml m液用雙蒸水稀釋至200ml),于微波爐中熔解,再加入20 ul n液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物15 ul混合3 ul o液,點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5v/cm電壓于50倍稀釋的m液中電泳,紫外燈下觀察結(jié)果。2 結(jié)果判定prv陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)217bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)帶出現(xiàn)(引物帶除外)時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)217bp擴(kuò)增帶為prv陽(yáng)性,否則為陰性。豬圓環(huán)病毒pcr

46、診斷試劑盒用途豬圓環(huán)病毒(pcv)的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)試驗(yàn)用于檢測(cè)豬血清和組織中的pcv,適用于pcv的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理提取病料dna作為模板,高溫使模板的一條雙鏈dna變性后形成兩條單鏈,低溫使引物與互補(bǔ)的模板形成雙鏈,中溫時(shí),在taqdna聚合酶作用下,以dntp為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),沿模板合成一條新鏈。每個(gè)循環(huán)包括:高溫變性、低溫返火、適溫延伸三個(gè)過程。每一次循環(huán)使擴(kuò)增的dna片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35次循環(huán),使擴(kuò)增的dna片段放大了數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到dna片段的擴(kuò)增帶。試劑1.試劑組成名稱數(shù)量a：消化液1

47、2mlb：蛋白酶k110lc：酚/氯仿/異戊醇混合液7mld：異丙醇6mle：75%乙醇12mlf：滅菌去離子水650lj：rt-pcr反應(yīng)液200lk：taqdna聚合酶25ll:礦物油300lm:50倍tae電泳緩沖液(50倍稀釋后使用)20mln：溴化乙錠溶液100lo：上樣緩沖液50lpcv-1陽(yáng)性對(duì)照350ulpcv-2陽(yáng)性對(duì)照350ul2.試劑貯藏條件:陽(yáng)性對(duì)照、b、e、j、k液于一20保存,其它試劑4保存。器材試劑盒內(nèi)配有0.2ml薄壁pcr管15個(gè)。其它需要自備的物品1.儀器:分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、pcr擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外

48、分析儀)、液氮或-70冰箱、微波爐、組織研磨器、-20冰箱、可調(diào)移液器。2.耗材:眼科剪、眼科鑷、稱量紙、2oml一次性注射器、1.5ml經(jīng)焦碳酸二乙醋(depc)水處理的滅菌離心管、瓊脂糖、500ml量筒、500ml錐形瓶、吸頭、滅菌雙蒸水。使用注意事項(xiàng)1所有接觸pcv病料的物品均應(yīng)合理處理,以免pcv污染實(shí)驗(yàn)室。2.pcr整個(gè)試驗(yàn)分pcr反應(yīng)液配制區(qū)配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)模板提取區(qū)擴(kuò)增區(qū)電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。3所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存,使用時(shí)拿到室溫下,使用后立即放回。4n液具有致癌性,小心操作。使用a液之前將其室溫溶解為澄清透明。5注意防止試劑盒組分

49、受污染。使用前將紅蓋管500orpm離心15s,使液體全部沉于管底。6.不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的成分不要混用。7.嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。8.本試劑盒為10頭份pcv pcr診斷試劑盒,應(yīng)在3次以內(nèi)用完。樣品制備1 樣品采集:病死或撲殺的動(dòng)物取有明顯病變臟器的病變部與健康部交界處組織:待檢活動(dòng)物,用注射器取血5ml,4保存,送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2 樣品處理:每份樣品分別處理。2.l 組織樣品處理:稱取待檢病料0.lg置組織研磨器中剪碎并研磨,加入lml a液繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料上清100ul加入1.5ml滅菌離心管中,再加

50、入500ul a液和10ul b液,混勻后,置55水浴中過夜。2.2 全血樣品處理:待血凝后取血清放于離心管中,800orpm離心5min,取血清100ul,加入500ul a液和10ul b液,混勻后,置55水浴中過夜。2.3 陽(yáng)性對(duì)照處理:混勻后取l00ul,加入500ul a液和10ul b液,混勻后,置55水浴中過夜。2.4 陰性對(duì)照處理:取f液l00ul,加入500l a液和10ul b液,混勻后,置55水浴中過夜。操作步驟1. 病毒模板dna的提取1.1 從水浴鍋中取出己處理的樣品,加600ul c液(用c液之前不要晃動(dòng),不要吸到c液上層保護(hù)液),用力顛倒10次混勻,1200orpm離心10min。1.2 取500ul上清置于滅菌離心管中,加入50oul d液,混勻,置液氮中3min或一70冰箱中30min。取出樣品管,室溫融化,13000rpm離心15min。1.3 棄上清,沿管壁緩緩滴入lml e液,輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉,將離心管倒扣于吸水紙上lmin,再將離心管真空抽干或50烘干15min(以無(wú)乙醇味為準(zhǔn))。1.4 取出樣品管,用3oul f液溶解沉淀,作為模板備用。2 pcr擴(kuò)增每份總體積20ul,取16u