丹參酮Ⅱa磺酸鈉微量雜質(zhì)的分離與結(jié)構(gòu)鑒定畢業(yè)

1、中國藥科大學(xué)本科生畢業(yè)論文本 科 畢 業(yè) 論 文論文題目 丹參酮a磺酸鈉微量雜質(zhì)的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 英文題目 separation of microimpurity and identification of sodium tanshinone a sulfonate 專 業(yè) 中藥學(xué) 院 部 中藥學(xué)院 學(xué) 號 姓 名 指導(dǎo)教師 課 題完成場所 中藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室 論文工作時間： 年 月 至 年 月丹參酮iia磺酸鈉微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定目 錄摘要3前言5第一章 文獻綜述61.1 丹參形態(tài)61.2 丹參的化學(xué)成份及其藥理作用71.3 丹參酮iia磺酸鈉的藥理作用及研究現(xiàn)狀8第二章 原料藥

2、中微量成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定132.1 實驗方法132.1.1實驗儀器132.1.2實驗試劑132.1.3原料藥中微量成分的分離132.2 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定15參考文獻17致謝18丹參酮iia磺酸鈉微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)摘要：丹參酮iia磺酸鈉，是從藥材丹參中提取的主要脂溶性有效成分丹參酮iia經(jīng)磺化反應(yīng)后形成的一種水溶性鈉鹽，由于磺酸基的引入，提高了丹參酮iia的水溶性，在治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等疾病方面顯示出與丹參酮iia所無法比擬的優(yōu)越性，成為主要的心血管類中藥。目前從丹參中提取丹參酮iia的方法和藥理活性研究較多，但對于丹參酮iia磺酸鈉雜質(zhì)的研究很少，原料中的微量雜質(zhì)成分的研究

3、還是空白。在對丹參酮iia磺酸鈉的藥理作用，在藥物代謝動力學(xué)和相關(guān)文獻報導(dǎo)的制備工藝等進行綜合考察的基礎(chǔ)上本課題采用色譜及波譜方法對丹參酮iia磺酸鈉進行微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定。同時，本文建立了高效液相色譜法測定原料藥丹參酮a磺酸鈉微量成份含量的方法，可用來對原料藥和制劑進行質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：羥基丹參酮iia磺酸鈉；丹參酮iia磺酸鈉；丹參酮iia；分離；結(jié)構(gòu)鑒定 separation of microimpurity and identification of sodium tanshinone iia sulfonateabstract: salvia miltiorrhiza is o

4、ne of the most important tradition chinese medicinal materials that possess the function of both promoting blood flow and removing blood stasis with anti-coronary artery disease. the consumed quantity only in the aspect of injection has been exceeded 2 billion dosages every year. however, because th

5、e undetermined active ingredients and relaxed index of quality control induced the instable effects of clinic traterment, and, moreover, usually adverse functions, which lead salvia miltiorrhiza unable to accommodate requirement of contemporary chinese medicinal materials melting world. sulfotanshin

6、one sodium is asodium chloride of water-solubility after sulfonating tanshinone iia of liposolubility active ingredien tabstraeted in salvia miltiorrhiza.it is an effective medicine of angiocardiopathy to treat coronary artery disease, anginacordis，and myocardial infarction.the amount of clincal uti

7、lization continuous.increasing with the high proportion of patients of angiocardiopathy induces raw material resource of salvia miltiorrhiza insufficient in china. so it becomes an extensive focus point in fharmaceutical factory that sufficient utilize and cut down uymost dissipation resource of sal

8、via miltiorrhiza.keywords:1-hydroxy-tanshinone iia sulfonate ; sodium tanshinonea sulphonate(sts);tanshinoneiia;separation;identification 前言丹參是活血化淤的傳統(tǒng)中藥，具有良好的抗冠心病等作用。其制劑及復(fù)方制劑品種繁多，僅注射劑的年使用量就達20億支以上，但多數(shù)產(chǎn)品有效成分不明確，質(zhì)量控制指標(biāo)不嚴(yán)格，由此導(dǎo)致臨床療效不穩(wěn)定，不良反應(yīng)時常出現(xiàn)，因此不能適應(yīng)中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化和向國際市場挺進的要求。丹參酮iia磺酸鈉，是從藥材丹參中提取的主要脂溶性有效成分丹參酮ii

9、a經(jīng)磺化反應(yīng)后形成的一種水溶性鈉鹽，由于磺酸基的引入，提高了丹參酮iia的水溶性，在治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等疾病方面顯示出與丹參酮iia所無法比擬的優(yōu)越性，成為主要的心血管類中藥11。由于我國心血管疾病患者在人群中比例居高不下，該藥品市場需求量呈逐年增加趨勢，但是因為其雜質(zhì)不明確，安全問題一直是制藥企業(yè)關(guān)心的問題。目前從丹參中提取丹參酮iia 的方法和藥理活性研究較多，但對于丹參酮iia磺酸鈉雜質(zhì)的研究很少，原料中的微量雜質(zhì)成分的研究還是空白，且對雜質(zhì)分離也沒有一個統(tǒng)一較好的方法。由于丹參酮iia磺酸鈉是丹參提取物經(jīng)過化進一步磺化制得，因此其可能的雜質(zhì)主要有兩個來源，一是作為磺化原料的參

10、酮iia中沒有純化干凈的其他丹參酮類化合物，一是磺化過程中丹參酮iia其他殘留丹參酮磺化產(chǎn)物及其副產(chǎn)物，在對丹參酮iia磺酸鈉的藥理作用，藥物代謝動力學(xué)和相關(guān)文獻報導(dǎo)的制備工藝等進行綜合考察的基礎(chǔ)上本課題采用色譜及波譜方法對丹參酮iia磺酸鈉進行微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定1,2。 第一章文獻綜述1.1 丹參形態(tài)丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參(salvia miltiorrhiza bge)的干燥根及根莖。該屬植物約900-1100種，主要分布于熱帶或溫帶。我國有約84種，分布于全國各地，尤以西南為多。除了丹參外，三葉鼠尾草，云南鼠尾草的根也可以作為丹參入藥。其植物學(xué)性狀和產(chǎn)地如下6,7（見圖1）：

11、圖1 多年生直立草本；根肥厚，肉質(zhì)，外面朱紅色，內(nèi)面白色，長5-15厘米，直徑4-14毫米，疏生支根。莖直立，高40-80厘米，四棱形，具槽，密被長柔毛，多分枝。葉常為奇數(shù)羽狀復(fù)葉，葉柄長1.3-7.5厘米，密被向下長柔毛，小葉3-5，長1.5-8厘米，寬1-4厘米，卵圓形成橢圓狀卵圓形或?qū)捙樞?，先端銳尖或漸尖，基部圓形成偏斜，邊緣具圓齒，草質(zhì)，兩面被疏柔毛，下面較密，小葉柄長2-14毫米，與葉軸密被長柔毛。輪傘花序6花或多花，下部者疏離，上部者密集，組成長4.5-17厘米縣長梗的頂生或腋生總狀花序；苞片技針形，先端漸尖，基部楔形，全緣，上面無毛，下面略被疏柔毛，比花梗長或短；花梗長34毫米

12、，花序軸密被長柔毛或具腺長柔毛?；ㄝ噻娦危瑤ё仙?，長約1.1厘米，花后稍增大。外面被疏長柔毛及具腺長柔毛，具緣毛，內(nèi)面中部密被白色長硬毛，具11脈，二唇形，上唇全緣，三角形，長約4毫米寬約8毫米，先端具3個小尖頭，側(cè)脈外緣具狹翅，下辱與上唇近等長，深裂成2齒，齒三角形，先端漸尖?；ü谧纤{色，長2-2.7厘米，外被具腺短柔毛，尤以上唇為密，內(nèi)面離冠筒基部約2-3毫米有斜生不完全小疏柔毛毛環(huán)，冠筒外伸，比冠檐短，基部寬2毫米，向上漸寬，至喉部寬達8毫米，冠檐二唇形，上唇長12-15毫米，鐮刀伏，向上豎立，先端微缺，下唇短于上唇，3裂，中裂片長5毫米，寬達10毫米，先端二裂，裂片頂端具不整齊的尖齒，

13、側(cè)裂片短，頂端圓形，寬約3毫米。能育雄蕊2，伸至上唇片，花絲長3.5-4毫米，藥隔長1720毫米，中部關(guān)節(jié)處略被小疏柔毛，上臂十分伸長，長14-17毫米，下臂短而增粗，藥室不育，頂端聯(lián)合。退化雄蕊線形，長約4毫米?；ㄖh(yuǎn)外伸，長達40毫米，先端不相等2裂，后裂片極短，前裂片線形?；ūP前方稍膨大。小堅果黑色，橢圓形，長約3.2厘米，直徑1.5毫米。花期4-8月，花后見果。產(chǎn)河北，山西，陜西，山東，河南，江蘇，浙江，安徽，江西及湖南；生于山坡、林下草叢或溪谷旁，海拔120-1300米。日本也有6,7。1.2丹參的化學(xué)成分及其藥理作用丹參為唇形科植物丹參(salviae miltiorrhizaeb

14、ge.)的干燥根及根莖。性微寒, 味苦, 是臨床最常用中藥之一。具有祛瘀止疼、活血調(diào)經(jīng)、清心除煩的功效、是活血化瘀的常用中藥。丹參的主要有效成分為脂溶性的二帖類化合物和水溶性酚酸類化合物。其中的丹參酮i、ii，異丹參酮i、ii，異丹參酮、丹參酸甲醋、丹參新酮、丹參酚、原兒茶醛、原兒茶酸等都具有藥學(xué)活性。由于丹參的上述各種療效均與丹參酮iia直接相關(guān)，且丹參酮iia標(biāo)準(zhǔn)品較易得到，其色譜行為與其它成分差距較大，以及丹參酮iia具有廣泛藥理作用，因此作為脂溶性成分的代表，并被中華人民共和國藥典用作為丹參藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)1。丹參廣泛用于治療心血管疾病的中藥復(fù)中，以丹參為主要的中藥制劑開發(fā)也相當(dāng)活躍

15、14【丹參酮】（tanshinone）具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗血栓形成和抗炎等，常在中醫(yī)中被用來治療炎性疾病。丹參酮iia（tanshinone iia）在丹參中含量最多，丹參酮iia磺酸鈉（sodium tanshinone iia sulphonate, sts）是丹參酮iia的衍生物?！镜⑼猧ia】( tanshinoneiia)是從傳統(tǒng)的活血化淤類中藥丹參( salvia miltiorrhiza bge)中提取的脂溶性有效成分,易溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑, 微溶于水, 分子式為c h o , 分子量294.33,室溫下外觀性狀為紅褐色粉末或紅色結(jié)晶。丹參酮幾乎不溶于水，

16、口服吸收差,生物利用度低,一般應(yīng)通過注射給藥。在空氣中丹參酮a迅速降解,而ph和復(fù)方成分則對該成分降解影響不大。丹參有效成分可分為脂溶性的丹參酮類(主要成分為1)及水溶性的丹參酸類(包括丹參素、原兒茶醛等) 35。有效成分具有抗心肌缺血、抗菌、抗雄性激素作用,水溶性成分具有抗心肌缺血和增加冠狀動脈血流量等生物活性4。故中國藥典2000年版中將丹參的提取工藝定為醇提和水提結(jié)合的工藝路線。不少生產(chǎn)廠家雖按藥典工藝生產(chǎn),但產(chǎn)品檢測結(jié)果往往仍不合格。為此,本文從原料、提取工藝以等方面對丹參酮iia磺酸鈉質(zhì)量問題進行研究9。上世紀(jì)60年代kakisswa確定了丹參酮iia的結(jié)構(gòu)式；隨后，baidlie等

17、人合成了丹參酮iia。由于丹參酮iia腸道吸收差， 臨床起效慢，故植物化學(xué)家錢明坤等人半合成了丹參酮iia磺酸鈉，并由上海制藥一廠、中藥三廠等制備成注射液制劑，用于心腦血管疾病的治療和預(yù)防。注射液推向市場其確切的療效得到廣大醫(yī)患的歡迎?！镜⑼猧ia磺酸鈉】( sodium tanshinone iia sulfonate , sts)是從丹參中分離出二萜醌類化合物丹參酮后經(jīng)磺化得到的水溶性物質(zhì)。化學(xué)成份主要有隱丹參酮,丹參酮a( tanshinone iia) ,羥基丹參酮iia,丹參酮甲脂,異隱丹參酮以及丹參新酮等。適用于冠心病、腦中風(fēng)等心腦血管疾病。8 ,91.3丹參酮iia磺酸鈉藥理作

18、用的研究現(xiàn)狀:1.3.1 丹參酮iia 磺酸鈉對心血管系統(tǒng)的影響對心肌的影響藥理實驗表明，對麻醉狗一次靜脈推注sts 20 mg/kg后，血壓升高，心輸出量和左心室做功量稍有增加，心率和外周血管阻力的變化不顯著。王志敏等進一步報道sts增加在位大鼠心臟的收縮幅度與上面的結(jié)果一致，并對sts對心肌和溶血的作用進行了觀察，發(fā)現(xiàn)離體豚鼠心臟灌流中，sts 0.5 - 20g/ ml灌流20 min，隨濃度而加重抑制心臟收縮幅度。麻醉大白鼠靜脈注射40 mg/kg能輕度增加在位心臟收縮幅度，0.1 mg/ ml對離體兔左心室乳頭肌在缺氧條件下，電刺激收縮幅度下降一半所需要的時間延長。0.02 或0.1

19、 mg/ ml使兔紅細(xì)胞在低滲條件下的破裂減小，又減少牛血清白蛋白凝固。25 - 75g/ ml對離體豚鼠左心室乳頭肌膜電位和動作電位的振幅和時程無明顯影響。并進一步推測藥物對離體心臟和在體心臟的影響不同，可能由于：在離體心臟灌流中，sts抑制心肌收縮是藥物直接長時間作用于心肌，而體內(nèi)給藥中，藥物在給藥瞬間血濃度很高，但很快趨向下降；藥物在體內(nèi)受到代謝轉(zhuǎn)化；神經(jīng)系統(tǒng)的影響；豚鼠與大白鼠的種鼠差異。sts能輕度增加大鼠在位心臟收縮力。增加收縮力的藥物可能會增加心肌耗氧量。但這類藥物也可能通過降低左心室舒張末期壓和心容積，即降低室壁張力和心臟體積而降低心肌耗氧量。又從sts對乳頭肌在缺氧條件下收縮

20、力下降50所需要的時間延長，表明藥物似乎可以減少心肌對氧的需求，有助于心絞痛緩解。接著，我國學(xué)者從分子水平進一步對sts對心肌的作用機制進行了探討。通過豚鼠離體心臟langendorff灌流法，造成心肌鈣反常模型，給予不同濃度的sts作為心肌保護劑，觀察sts對心肌鈣反常的保護作用，并與已知的鈣拮劑異搏定比較，探討sts的鈣拮抗作用。實驗結(jié)果表明，sts對心肌鈣反常損傷具有明顯的保護作用，抑制鈣內(nèi)流，減輕鈣反常過程中心肌組織鈣沉積和心肌損傷所致的蛋白酶釋放 （p 0.01），且該作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴關(guān)系，且作用效果優(yōu)于異搏定。同時作者用電鏡進行了超微結(jié)構(gòu)觀察，比較了正常對照組，鈣反常組

21、，鈣反常加異搏定組，鈣反常加sts組。結(jié)果表明與正常對照組相比，鈣反常組出現(xiàn)典型損傷，肌原纖維極度收縮，i、a帶融合，z線扭曲、排列紊亂，形成許多同心收縮帶，線粒體明顯腫脹、基質(zhì)疏松。部分線粒體內(nèi)外膜及嵴斷裂；肌膜破裂，間盤嚴(yán)重分離。鈣反常組加sts 10mg/l、20mg/l的兩組心肌形態(tài)學(xué)改善不佳，加30 mg/l、40 mg/l的兩組心肌形態(tài)學(xué)明顯改善，尤以30mg/l組為佳，除線粒體輕度腫脹、糖原略減少外，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。2 mg/l異搏定組心肌形態(tài)學(xué)亦有改善，但不如sts 30mg/l、 40 mg/l兩組。進一步證實sts系通過其鈣拮抗作用保護心肌免受鈣反常損傷。新制備的家兔

22、心肌細(xì)胞線粒體，在體外條件研究了sts對家兔正常的和異丙基腎上腺素(isp)興奮的心肌線粒體攝取鈣活力的響。結(jié)果表明sts對線粒體的主動攝取鈣的影響也是具有鈣通道阻滯劑樣的作用。并能減少或抑制isp所引起的心肌線粒體鈣超載，從而起到保護心肌線粒體和心肌細(xì)胞免遭上述病理原因引起的高鈣沖擊和細(xì)胞壞死的后果。這可能即是t治療冠心病心絞痛和胸悶及改善缺血性心電圖；抗心肌缺血和縮小梗塞范圍；降低缺血后的乳酸增加等藥理作用的共同生化基礎(chǔ)。通過分離的成年豚鼠心室肌單細(xì)胞在高鉀(25 mmol/l)溶液中部分除極化使鈉通道失活，用細(xì)胞內(nèi)刺激誘發(fā)慢反應(yīng)動作電位。20 mol/l的sts對這種慢反應(yīng)動作電位有明顯

23、的抑制作用。在1-20mol/l濃度范圍內(nèi)，sts對0.28 mol/l的異丙腎上腺素強化的慢反應(yīng)動作電位有濃度依賴性抑制作用。而且，隨異丙腎上腺素濃度的增加(69-0.55 mol/l)抑制作用更加明顯，進一步說明sts可能是一種鈣拮抗劑。通過甲狀腺粉在誘導(dǎo)大鼠甲亢過程中心肌微粒體na+，k+-atpase，ca2+-atpasemg2+-atpase活性變化，曾林等探討高甲狀腺激素水平作用下sts對大鼠心肌微粒體atpase活性的保護作用及機制。實驗證實sts不干擾甲狀腺粉誘脈流量，供給了心肌充足的氧，保護atpase活性，以糾正心肌細(xì)胞內(nèi)異常的鈣代謝，減少細(xì)胞內(nèi)ca2+超載，對心肌起到保

24、護作用。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，研究sts對豬冠脈平滑肌katp和kca的作用，從分子水平闡明其擴冠機制。實驗結(jié)果表明，在內(nèi)面向外式膜片方式下，5 20mol/ l 的sts可明顯激活katp，表現(xiàn)為通道開放概率、膜片通道開放數(shù)目增加，而且sts也可明顯增加kca通道開放概率，表現(xiàn)出明顯激活作用，因此，sts對原代培養(yǎng)豬冠脈平滑肌上katp和kca均有直接激活作用，sts對這兩種通道是否有間接作用尚需進一步證實。實驗結(jié)果進一步從分子水平證實sts 對原代培養(yǎng)豬冠脈平滑肌上katp和kca均有直接激活作用，這可能也是它們舒張冠脈的重要機制之一，而且由此可推測，sts通過對katp、kca的鉀通道開放和鈣

25、通道阻滯的協(xié)同或聯(lián)合作用，可明顯減少血管平滑肌上的自發(fā)電活動，引起血管舒張，在心血管疾病的治療中具有重要的應(yīng)用價值。利用在體家兔缺血預(yù)適應(yīng)（ischemia preconditioning，ipc）模型，隨機將家兔24 只分為心肌缺血組（ir）、缺血預(yù)適應(yīng)組（ipc）和sts聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組（ds-201+ipc），應(yīng)用心外膜單相動作電位（map）探針記錄技術(shù)檢測缺血-再灌注過程中心肌復(fù)極50時（mapd50）及心律失常發(fā)生率和持續(xù)時間；ttc染色測定梗死面積；he染色病理組織學(xué)觀察，研究sts對家兔缺血預(yù)適應(yīng)心肌電生理參數(shù)的影響及保護作用。結(jié)果表明，與ir組相比，ipc組缺血5 min時的m

26、apd50：迅速縮短（p 0.05），缺血20 min時的mapd50縮短明顯減小（p 0.05），復(fù)灌30 min后mapd50的過度延長程度明顯減?。╬ 0.05）。同時，缺血再灌注中室性心律失常發(fā)生率明顯降低（p 0.05）。在ds - 201+ipc組，缺血5 min時未見mapd50迅速縮短（p 0.05），缺血20 min及復(fù)灌30 min后mapd50及缺血再灌注中室性心律失常發(fā)生率與ipc組無差異（p 0.05）。病理學(xué)檢測顯示，ipc組心肌梗死面積及組織損傷程度均明顯小于ir組3,4。ds-201+ipc組心肌梗死面積及組織損傷程度均小于ipc組。實驗結(jié)果顯示，ds-201

27、聯(lián)合ipc取消了缺血早期ipc顯著縮短mapd50的效應(yīng)。但對ipc抗缺血再灌注心律失常作用無顯著影響；sts能增強ipc縮小心肌梗死面積和減輕組織損傷的作用。其機制可能是ipc能抑制心肌細(xì)胞線粒體atp酶，減少atp的水解，有效保存心肌細(xì)胞的能量儲備。sts能降低ir后線粒體脂質(zhì)過氧化物的含量，改善線粒體膜的流動性。用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞sts對血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及p-jnk，絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶表達的影響，發(fā)現(xiàn)sts能顯著降低血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成速率的增加，對p-jnk表達具有劑量依賴性的抑制作用；同時上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶表達。據(jù)此推測，sts

28、抗心肌肥厚機制與上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶，抑制p-jnk表達相關(guān)。下一步研究應(yīng)著重于sts對erk以及p35 信號通路的上下游分子的影響，進一步闡明sts抗心肌肥厚的機制，為其在臨床用于心肌肥厚的防治提供實驗依據(jù)11,13對心血管系統(tǒng)的影響、對腦血管和細(xì)胞的影響、對腫瘤細(xì)胞的作用、對神經(jīng)系統(tǒng)的影響、抗菌作用目前對丹參酮iia 及其鈉鹽的藥理作用研究取得了一定成果，但很少有人報道其在心血管受體的藥理學(xué)方面和在體內(nèi)與其他藥物的相互作用方面的研究5。但是其雜質(zhì)一直很少有研究，丹參酮iia磺酸鈉原料及丹參酮iia磺酸鈉注射液上市后，發(fā)現(xiàn)無論是原料還是水針劑在生產(chǎn)和銷售過程中都會由于儲存而出現(xiàn)酸性增

29、強，含量降低的現(xiàn)象因為原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有對丹參酮iia磺酸鈉原料及丹參酮iia磺酸鈉制劑有關(guān)物質(zhì)進行有效監(jiān)控。經(jīng)hplc檢查，丹參酮iia磺酸鈉原料及制劑中均存在一未知雜質(zhì)成分高達7%-15%。目前，丹參酮iia磺酸鈉研究主要還是集中在其藥理活性的探討上，原料中的微量雜質(zhì)成分的研究還是空白。由于丹參酮iia磺酸鈉是丹參提取物經(jīng)過化進一步磺化制得，因此其可能的雜質(zhì)主要有兩個來源，一是作為磺化原料的參酮iia中沒有純化干凈的其他丹參酮類化合物，一是磺化過程中丹參酮iia其他殘留丹參酮磺化產(chǎn)物及其副產(chǎn)物，基于此方面的考慮，本課題采用色譜及波譜方法對丹參酮iia磺酸鈉的微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定。采用硅膠

30、、大孔樹脂等柱層析方法對丹參酮iia磺酸鈉的微量雜質(zhì)進行制備分離，運用1h,13c，nmr等波譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。我們準(zhǔn)備在這方面進行初步的研究。進一步制備大量高純度樣品作為雜質(zhì)含量測定和結(jié)構(gòu)鑒別及質(zhì)量控制的方法，并比較了不同條件下的分離效果，建立了一個簡單的含量測定方法可以用來作為原料藥的和注射劑的質(zhì)量控制。 第二章原料藥中微量成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定2.1實驗方法2.1.1實驗儀器agilent 1100 系列高效液相色譜儀shim-pack clc-ods-c18(150mn*6.0mn 5m)色譜柱vwd型紫外檢測器hp chemstation 色譜工作站（美國惠普公司）jzh柱溫箱（

31、天津金洲科學(xué)儀器有限公司）旋蒸蒸發(fā)儀2.1.2 實驗試劑甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）乙酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）氯仿（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）丙酮（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司 ）95%乙醇 硅膠h（200-300目）大孔樹脂2.1.3 原料藥中微量成分的分離準(zhǔn)確稱取原料藥粗品2g，置于100ml圓底燒瓶中加水約25ml，超聲使其充分溶解。然后置于回流裝置上溫度90回流四個小時，將樣品轉(zhuǎn)移到500ml楔形瓶內(nèi)置旋蒸儀上蒸干，樣品用40乙醇溶解，抽濾。冷卻后上樣。(原料藥高效液相色譜見圖1)圖1 原料藥粗品高效液相色譜圖原料藥上大孔樹脂吸附兩個小時后用40乙醇洗脫。用試

32、管接餾分，流速不能過快。大孔樹脂收集所得餾分反相板檢識（展開劑50%甲醇），對照品用95%乙醇溶解。點板后合并相同餾分，置于100ml楔形瓶內(nèi)于旋蒸儀上蒸干，然后用95%乙醇少量溶解，旋蒸蒸干（如果殘留物成大片狀且色澤不均勻可用95%乙醇再次溶解，然后蒸干）。取出殘留物轉(zhuǎn)入試劑瓶內(nèi)，得dst-1粗品.待上硅膠柱。取dst-1粗品100mg。取硅膠20g，硅膠柱采用濕法裝柱,干法上樣。以氯仿：丙酮=1：1洗脫，氣泵加壓。用10ml試管收集餾分，tlc檢識 展開劑為氯仿：甲醇=8：2。合并餾分后，高效液相檢測，流動相：甲醇：2%醋酸水=60%：40%；柱溫35；流速：1ml/min； 檢測波長：2

33、72nm；檢測含量達到97%以上( 見圖2-1，2-2)。圖2-1 dst-1粗品高效液相色譜圖圖2-2 dst-1粗品高效液相色譜圖2. 2目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定及結(jié)果討論：羥基丹參酮iia磺酸鈉的結(jié)構(gòu)鑒定：對dst-1粗品上硅膠柱分離得到的樣品dst-1，進行氫譜共振檢測，測定結(jié)果見圖。圖3-1dst-1樣品氫譜掃描圖圖3-2樣品氫譜掃描圖)2.2.1丹參酮iia磺酸鈉的結(jié)構(gòu)鑒定1hnmr數(shù)據(jù)（500mhz，tms，dmso-d6，(ppm)）7.85(1h,d,j=8.4 hz)，7.56(1h,d,j=8.1 hz)說明為芳環(huán)上的氫，2.33(3h，s)為甲基峰，且與雙鍵相連，1.29(

34、6h，s)為兩個甲基峰，3.08(2h,t,j=6.1hz)，1.72(2h,m)，1.62(2h,m)為三個-ch2-，結(jié)構(gòu)片斷與丹參酮iia骨架結(jié)構(gòu)相似，與文獻報道的丹參酮iia磺酸鈉數(shù)據(jù)相比，化學(xué)位移向低場移動，且峰的裂分要清晰；與丹參酮iia相比，h 7.16(1h,d,j=1.1)峰消失，且2.33(3h，s)沒有被裂分，但其他的峰位與裂分基本相似，說明sts的母核結(jié)構(gòu)為丹參酮iia，且在16位磺化。（見表2.1）2.2.2羥基丹參酮iia磺酸鈉的結(jié)構(gòu)鑒定1h nmr數(shù)據(jù)h(ppm)：7.87(d,j=8hz,1h)、7.85(d,j=8hz,1h)為兩相互偶合的芳環(huán)氫，2.48(s,3h)為甲基，與雙鍵相連，1.40(s,3h)為甲基，1.28(s,3h)為甲基，1.98(m,2h)為兩個次甲基上的氫，2.15(m,1h)，1.53（m,1h）為次甲基上的兩個氫，和化合物丹參酮iia